Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

تقييم الكولاجين والايلاستين ميكروارتشيتيكتوريس تعتمد على الضغط في الشرايين المقاومة البشرية، والعيش بالفحص المجهري Fluorescence تسمية خالية

doi: 10.3791/57451 Published: April 9, 2018

Summary

نحن تصف اختبار الميكانيكية المتزامنة وتصوير 3D الجدار الشرياني معزولة، يعيش الشرايين المقاومة البشرية، وتحليل الصورة إيلاستيك وفيجي للتحديد الكمي كثافات المنظمة وحجم المكانية الايلاستين والكولاجين. ونحن نناقش استخدام هذه البيانات في نماذج رياضية لميكانيكا الجدار الشرياني.

Abstract

يتم توثيق مساهمة المسببة للأمراض لإعادة عرض شريان المقاومة في ضروري ارتفاع ضغط الدم ومرض السكري ومتلازمة الأيض. التحقيقات ووضع نماذج رياضية دافع ميكروستروكتورالي لفهم الخواص الميكانيكية للشرايين المقاومة الإنسان في الصحة والمرض كامنة للمساعدة في فهم كيفية المرض والعلاجات الطبية تؤثر على الإنسان دوران الأوعية الدقيقة. لتطوير هذه النماذج الرياضية، من الضروري أن فك العلاقة بين الخصائص الميكانيكية وميكروارتشيتيكتورال الجدار ميكروفاسكولار. في هذا العمل، ويصف لنا طريقة السابقين فيفو لاختبار الميكانيكية السلبي وتصوير خالية من تسمية ثلاثية الأبعاد المتزامنة المصغرة من الايلاستين والكولاجين في الجدار الشرياني للشرايين المقاومة البشرية المعزولة. يمكن تطبيق البروتوكول التصوير لمقاومة الشرايين لأي نوع من الفائدة. تحليل الصورة موصوفة للتحديد الكمي ط) الضغوط الناجمة عن التغيرات في الصفيحة المرنة الداخلية الزوايا المتفرعة والاستقامة الكولاجين أدفينتيتيال استخدام كثافات المجلد الثاني) الكولاجين والايلاستين تحدد باستخدام البرمجيات إيلاستيك وفيجي. يفضل أن يتم تنفيذ جميع القياسات الميكانيكية والتصوير في الشرايين الحية، perfused، غير نهج بديل باستخدام معيار ضغط الفيديو-الفحص المجهري ميوجرافي في تركيبة مع التصوير بعد انتهاء التثبيت المضغوط إعادة السفن وناقش. هذا أسلوب بديل يوفر للمستخدمين مع خيارات مختلفة لتحليل النهج. مناقشة إدراج بيانات الميكانيكية والتصوير في نماذج رياضية لميكانيكا الجدار الشرياني، ويقترح تطوير في المستقبل وإضافات للبروتوكول.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

مساهمة المسببة للأمراض والآثار لإعادة عرض الشريان المقاومة موثقة في ضروري ارتفاع ضغط الدم ومرض السكري ومتلازمة الأيض1،2،3،،من45. فك العلاقة بين الخصائص الميكانيكية وميكروارتشيتيكتورال من الجدار microvascular أمر ضروري لوضع نماذج رياضية لهذه الرابطة. سيؤدي إلى تحسين فهم عملية إعادة عرض هذه النماذج وسيدعم التنمية في السيليكون نماذج مفيدة لاختبار استراتيجيات الدوائية تستهدف الأمراض المتصلة بإعادة عرض الجدار الشرياني.

وركزت الدراسات السابقة في فهم كيف المصغرة للجدار الشرياني تتعلق بالميكانيكا الجدار الشرياني بإدماج تدابير الميكانيكية والمصغرة المصفوفة خارج الخلية (ECM) وتجري حصرا تقريبا على كبير ، الشرايين قناة مرنة من الفئران أو الخنازير6،،من78،9،،من1011. عادة يتم تصوير المجهرية للجدار باستخدام التقنيات البصرية غير الخطية، مع استفادة أوتوفلوريسسينسي الايلاستين وجيل التوافقي الثاني بالكولاجين. وهذا ما يسمح تصوير الزمانية المكانية لعنصرين رئيسيين المصفوفة خارج الخلية، والايلاستين والكولاجين، دون حاجة إلى تلطيخ. تصوير الجدار الشرياني في سمك كامل يمثل تحديا في الشرايين قناة كبيرة بسبب تشتت الضوء في وسائل الإعلام الغلالة السميكة. ومع ذلك، لتحديد كيف تتصل المصغرة للعناصر الهيكلية للجدار الشرياني الخواص الميكانيكية الملاحظة، معلومات ثلاثية الأبعاد يجب الحصول على أثناء اختبار الميكانيكية. للشرايين الكبيرة مثل الاورطي البشرية، وهذا يتطلب تركيب بياكسيال واختبار الميكانيكية والتصوير من المناطق ذات الاهتمام في 1-2 سم2 قطعة من الجدار الشرياني7،،من910، 12-يمكن تصويرها سوى جزء من الجدار واختبرت ميكانيكيا.

للشرايين أصغر من أي الأنواع (مثلاً، التامور البشرية13و الرئوية14 والشرايين تحت الجلد15 ، الفئران الشرايين المساريقي العلوي16،،من1718، 19 , 20، الماوس cremaster، المساريقي العلوي، والدماغية، والفخذ والشرايين السباتي21،،من2223،،من2425،26، من الممكن تصوير 27) من سمك الجدار كامل ويمكن دمجها مع اختبار الميكانيكية. يسمح هذا التسجيل المتزامن للخواص الميكانيكية والترتيبات الهيكلية داخل الجدار. ومع ذلك، نمذجة رياضية مباشرة العلاقة بين التعديلات الملحوظة في هيكل ثلاثي الأبعاد إدارة المحتوى في المؤسسة وتغيير الخصائص الميكانيكية لمقاومة الجدار الشرياني، إلى أفضل معرفتنا فقط أبلغ عند مؤخرا في المقاومة البشرية الشرايين13،15.

ويرد في هذا العمل، أسلوب السابقين فيفو لاختبار الميكانيكية السلبي وتصوير ثلاثي الأبعاد المتزامنة المصغرة من الايلاستين والكولاجين في الجدار الشرياني للشرايين المقاومة البشرية المعزولة. يمكن تطبيق البروتوكول التصوير لمقاومة الشرايين لأي نوع من الفائدة. ويرد تحليل الصورة الحصول على مقاييس الزوايا المتفرعة الداخلية الصفيحة المرنة والكولاجين أدفينتيتيال الاستقامة13 استخدام فيجي28. وأخيراً، نوقشت إدراج بيانات الميكانيكية والتصوير في نماذج رياضية لميكانيكا الجدار الشرياني وكثافة حجم الكولاجين والايلاستين مصممون على استخدام البرمجيات إيلاستيك29 .

ولاحظ هدف واصفاً التحليلات التصوير والصورة تقنيات في تركيبة مع النمذجة الرياضية تزويد المحققين نهج المنهجي لوصف وفهم الضغوط الناجمة عن التغييرات في إدارة المحتوى المؤسسي لمقاومة الشرايين. وتركز الأسلوب المبين في قياس التغيرات التي طرأت إدارة المحتوى في المؤسسة في سفينة أثناء الضغط، بمقارنة هيكل إدارة المحتوى في المؤسسة في 20 و 40 و 100 ملم زئبق. وقد اختيرت هذه الضغوط لتحديد هيكل الجدار الشرياني في أكثر متوافقة (20 ملم زئبق) وقاسية (100 ملم زئبق) والمتوسطة (40 ملم زئبق) الدولة، على التوالي. ومع ذلك، أي عملية في جدار الأوعية الدموية للشرايين الحية، بما في ذلك التغيرات التي تحدثها المكونات فعال في الأوعية والتباطؤ والتدفق، يمكن قياسها كمياً، اعتماداً على فرضية البحث في السؤال قبل المحقق.

ويشدد على استخدام الإثارة اثنين-فوتون fluorescence مجهرية (تبيم) في تركيبة مع ميوجراف ضغط لدراسة الضغط (أو غيرها) الناجمة عن التغييرات في إدارة المحتوى في المؤسسة الشرايين الحية. أولاً، لأن هذا يسمح باقتناء المتزامن لهيكل ثلاثي الأبعاد الشاملة للجدار الشرياني (سمك الجدار وقطرها) جنبا إلى جنب مع اكتساب خالية من تسمية ثلاثية الأبعاد ذات جودة عالية، مفصلة الصور الكولاجين والايلاستين ميكروارتشيتيكتوريس ك وصف13 بالاستفادة من أوتوفلوريسسينسي الايلاستين والكولاجين الثاني جيل التوافقي إشارة (SHG)30. ثانيا، يسمح تبيم هو السماح باستخدام الضوء الطاقة المنخفضة القريبة من الأشعة تحت الحمراء الإثارة، والتقليل إلى أدنى حد د من الأنسجة ومن ثم تصوير متكررة في نفس الموقف داخل جدار الأوعية الدموية، لاحظ يسمح تحليل القياسات المتكررة التغييرات.

هو مناقشة استخدام نهج بديل باستخدام التصوير [كنفوكل] لضغط ثابت الشرايين للسماح للمستخدمين دون الوصول إلى تبيم فرصة لاستخدام أسلوب وصف كذلك. يمكن أيضا استرداد المعلومات المتعلقة بإدارة المحتوى في المؤسسة هيكل وحجم الكثافة من تحليلات ثنائي الأبعاد للأنسجة مقطوع في المسلسل، مثلاً كما هو موضح من31،32. ومع ذلك، نظراً لعدم وجود إمكانية لاسترداد المعلومات الهيكلية ثلاثي الأبعاد عبر جداول طول الشريان وكذلك أثناء تغيير شروط استخدام هذا الأسلوب، أنها لا نوصي باستخدام هذا النهج للتحقيقات للضغط و المعاملة الناجمة عن التغييرات ثلاثية الأبعاد في إدارة المحتوى في المؤسسة.

الحد الأدنى لمتطلبات المحقق لتطبيق الأسلوب الموصوفة هنا هو الوصول إلى إعداد كانوليشن والضغط في الشرايين في تركيبة مع مجهر الأسفار إثارة [كنفوكل] أو اثنين-فوتون. الإعداد المبينة في البروتوكول التالي ميوجراف ضغط مبنية خصيصا مع محول قوة طولية، بنيت لتناسب على مجهر الأسفار مخصص بنيت مقلوب اثنين-فوتون إثارة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

أنجز مجموعة من خزعات تامور الجدارية البشرية لاستخدامها في هذا العمل بعد الموافقة الخطية، كما هو موضح سابقا33. دراسة الأنسجة البشرية تتفق مع المبادئ الواردة في "إعلان هلسنكي"34 وأقرته "اللجان الإقليمية" شأن "أخلاقيات البحوث الصحية" لجنوب الدنمارك (S-20100044 و S-20140202)، والوكالة الدانمركية لحماية البيانات.

1-جمع الأنسجة والشريان مقاومة عزل (الإنسان)

  1. جمع عينات الأنسجة من الاهتمام فور الختان أثناء عملية جراحية. نقل الأنسجة إلى 4 درجات مئوية حبيس مخزنة الفسيولوجية الملح حل (ميزانيات) فورا بعد جمع وتخزينها في ميزانيات.
    ملاحظة: الأنسجة البشرية هي فقط جمعتها بعد موافقة اللجان المؤسسية والأخلاقية ذات الصلة، فضلا عن المرضى الموافقة الخطية. تكوين ميزانيات في ملم: مجسو4 1.2، كاكل2 2.5، 1.2، 14.9 حبيس، الجلوكوز 5.5 خ2ص4 ، 144 كلوريد الصوديوم، 4.7 بوكل. ضبط الأس الهيدروجيني 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم، وتصفية عامل التصفية على الرغم من 0.2 ميكرون الحل.
  2. ترك الأنسجة التي تم جمعها في ميزانيات عقيمة في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها تغسل المسكنات.
    ملاحظة: يجب أن يتم التحقق أي أثر للتخزين بين عشية وضحاها على سلامة السفينة ووظيفة مختبر الأبحاث الفردية.
  3. عزل المقاومة الحجم الشرايين (± 200 ميكرومتر التجويف قطر) باستخدام زوج من الملقط حادة-نصيحة ومقص التشريح الجزئي بعناية.
  4. تخزين الشرايين عند 4 درجة مئوية في ميزانيات المثلج بينما فتيلة قاعة التصوير والضغط.

2-جبل الشريان المعزولة في ميوجراف الضغط

  1. جبل القنيات الزجاج مع أقطار نصيحة من ميكرومتر ~ 80 على أصحاب القنيات. ضع ميكرومتر نصائح ما يقرب من 150 أعلاه أسفل الزجاج الدائرة.
    ملاحظة: قد تسمح القنيات نصيحة محني 45° الموضع الدقيق للسفينة أعلاه أسفل الزجاج.
  2. سد مدخل ومنفذ أنابيب مع ميزانيات مع جيش صرب البوسنة 1% والاتصال بنظام الضغط.
    ملاحظة: يتم تضمين للحفاظ على وظيفة الخلية البطانية جيش صرب البوسنة.
  3. جبل الشريان المعزولة باستخدام خيوط عقده مزدوجة اثنين كل قنية.
    ملاحظة: يمكن إعدادها مسبقاً عقده والمخزنة على الشريط اللاصق المزدوج حتى حاجة.
  4. ملء الدائرة مع ميزانيات ومكان عقده مزدوجة اثنين على كل قنية الزجاج.
    ملاحظة: عند استخدام عرض لهجة شذوذ الشرايين، ميزانيات يستعاض بالكالسيوم تستكمل ميزانيات مجاناً مع 3 ميكرومتر عطا و 3 ميكرومتر الصوديوم نيتروبروسيدي.
  5. عقد الشريان برفق في نهاية واحدة باستخدام اثنين من أزواج من الملقط الحافة الحادة. فتح التجويف الشريان والانزلاق بلطف على القنية. إصلاح على القنية استخدام عقده اثنين.
  6. تطبيق ضغط من 5 مم زئبق بلطف مسح التجويف مع ميزانيات/1% جيش صرب البوسنة.
  7. كانولاتي الطرف الآخر للشريان وتأمينه على قنية استخدام اثنين عقده مزدوجة.
  8. نقل ميوجراف إلى مرحلة مجهر والضغط على الشريان إلى 5 مم زئبق (الضغط مدخل = الضغط منفذ)، ثم الحرارة إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  9. اختياري: معايرة محول قوة الطولي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (بالمليون 1 g = 9.81).
    ملاحظة: من الضروري لمعايرة محول القوة بعد تدفئة كما هو درجة الحرارة الحساسة.

3-إجراء التجربة: التصوير الشرياني القطر وسمك الجدار والكولاجين والايلاستين المصغرة باستخدام تبيم

  1. سرعة المسح الضوئي الشريان مقني الضغط إلى 5 مم زئبق باستخدام 20 X الهدف (≥ 0.8 من الفتحة العددية (نا)) وطاقة منخفضة الإثارة الخفيفة لتقييم سمك الجدار وقطرها السفينة في 5 ملم زئبق.
    ملاحظة: للمجهر المقلوب، استخدم هدفا غمر مياه؛ تستقيم المجاهر، استخدام مياه غمس الهدف. إذا لم يكن لديه الهدف طوق تصحيح لتصحيح لسمك الغطاء زلة، تأكد من تطابق بكشف غطاء المستخدمة بهدف استخدامها. قد تختلف إعدادات البرامج والوصف المستخدم-الطور البيني ومجهر والبرمجيات المستخدمة.
    1. إعداد مسار بصري.
      1. تنشيط تاي مي اثنين-فوتون الليزر وتعيينها إلى 820 الضوء الإثارة في شمال البحر الأبيض المتوسط.
        تحذير: تجنب أي تعرض لضوء الليزر مرئية، فضلا عن غير مرئية.
      2. جمع الانبعاثات في وقت واحد في اثنين من القنوات. تقسيم الانبعاثات الخفيفة بين فوتومولتيبليرس باستخدام 460 نانومتر طويلة تمرير مرآة مزدوج اللون وجمع الانبعاثات باستخدام مرشحات ممر الموجه واسعة شمال البحر الأبيض المتوسط 30-60 تركزت في 520 نانومتر (الايلاستين) و 410 نانومتر (الكولاجين)، على التوالي.
    2. تمكين المسح المستمر مع 10 المايكروثانيه الليزر يسكن الوقت/بكسل و 512 × 512 بكسل لمجال الرؤية 100%.
    3. مسح يدوياً عن طريق الشريان لتحديد العمق حيث لوحظ القطر كحد أقصى.
    4. اختر شريحة مستطيلة تغطي القطر الشريان أوسع نطاق، ومسح إطار واحد مع بكسل حجم ≤ 300 نيوتن متر/بكسل (الشكل 2). استخدام الإثارة منخفض الطاقة الخفيفة والوقت يسكن بكسل قدر الإمكان لتجنب فوتوداماجينج الشريان حية.
      ملاحظة: من المستحسن للحصول مستطيل، على سبيل المثال-، 100 × 1024 بكسل الصورة بدلاً من الصورة الدرجة الثانية في هذا الموضع لتوفير الوقت والحد من تعرض الأنسجة فوتون (الشكل 2).
    5. حفظ الصورة لتحليلات لاحقة.
  2. تحديد سمك الجدار وقطرها التجويف في القطر الأقصى الشريان.
    1. لتحميل الصورة في فيجي.
    2. تعيين الجدول بواسطة النقر فوق القائمة الرئيسي | تحليل | ضبط مقياس وأدخل نسبة ميكرومتر/بكسل بكسل (ينصح بالاحتفاظ بكسل نسبة 1:1).
    3. اختر أداة سطر فيجي ورسم خط بين عن مرونة داخلية اثنين في كل من جانبي التجويف الشرياني، واضغط ctrl + M. طول التقارير فيجي كافتراضي في جدول النتائج.
    4. وبالمثل، رسم خطوط أكثر لقياس سمك الجدار كل، واضغط على ctrl + M لقياس العلامات التالية.
    5. حفظ القياسات.
  3. الصورة المصغرة الكولاجين والايلاستين في 5 مم زئبق بمسح كامل سمك الجدار الشرياني، الحصول على رصات الصور ثلاثية الأبعاد مع نوعية جيدة للمناطق ذات الاهتمام على طول الشريان 1-3.
    1. الحصول على رصات الصور عن طريق الجدار كامل الشريان استخدام 60 × الهدف، ≥ 1 غ، أحجام بكسل الأمثل وتباعد z.
      1. حساب أفضل الظروف التصوير (أحجام بكسل وتباعد خطوة z) وفقا للمسار البصري، المتوسطة الغمر وعينه مؤشرات الانكسار باستخدام الحاسبة "العلمية نايكست التصوير وحدة التخزين" (https://svi.nl/NyquistCalculator).
        ملاحظة: يرجى الانتباه هنا إلى الفرق بين حجم بكسل الأمثل وتباعد z مقابل النصيحة في المقطع 3.4. أعلاه على استخدام أقصى حجم بكسل.
    2. استخدام نفس إعدادات الإثارة والانبعاثات أعلاه (3.1.1.).
    3. مسح جدار الوعاء بسرعة كما هو موضح أعلاه لتحديد سمك z-المكدس.
    4. تعريف z-مكدس بدء ونهاية عمق وتباعد z-خطوة وكثافة بكسل (حساب في 3.3.1.1). وإجراء الفحص-z. حفظ كل قناة بشكل منفصل.
      ملاحظة: الصور يجب أن تكون صغيرة بما يكفي مثلاً 30 × 30 ميكرومتر أو 50 × 50 ميكرومتر تبعاً لحجم السفينة لتجنب أي تأثير لانحناء في تحليلات الصورة اللاحقة.
  4. تحديد قطر الشرايين، وسمك الجدار، والمصغرة الايلاستين والكولاجين في الضغوط المتبقية من البروتوكول.
    1. كرر 3.1-3.2 في الضغوط 10 و 20 ملم زئبق، وكرر 3.3 في الضغط 20 ملم زئبق.
    2. كرر 3.1 و 3.2 في ضغط 40 ملم زئبق.
    3. كرر 3.1-3.2 في الضغوط 60 و 80 و 100 ملم زئبق وكرر 3.3 في 100 ملم زئبق.
      ملاحظة: يمكن أن تتكرر 3.1-3.3 لكل الضغوط، ومزيج من الضغوط (مثل سلسلة/مزيج ضغوط المتزايدة، فضلا عن تناقص كما)، اعتماداً على فرضية يمكن اختبارها. ويوزين بتركيز 0.3-1 ميكرومتر قد تضاف إلى تعزيز إيلاستين أوتوفلوريسسينسي في حالة فوتوبليتشينج. فوتوبليتشينج يمكن تجنبها عن طريق تطبيق كطاقة منخفضة الإثارة الخفيفة قدر الإمكان.
    4. يستعاض المخزن المؤقت في قاعة ميوجراف الطازج 37 درجة مئوية ميزانيات بعد كل خطوة الضغط... تسمح الشريان تكييف لمدة 5 دقائق قبل التصوير بعد كل تغيير في الضغط.
  5. تخزين رصات القناة بشكل منفصل لتحليل الصورة.
  6. اختبار صلاحية الشريان.
    1. تطبيق 10 ميكرون U46619 في قاعة ميوجراف يتبع بإضافة 10 ميكرون براديكينين عندما يحتفل انقباض مستقرة.
    2. سجل سمك الجدار وقطرها كما هو موضح أعلاه في القسم 3.1 بعد تطبيق كل من المركبات.
    3. إضافة 3 ميكرومتر الصوديوم nitroprusside عند الشريان لا المتوسعة تماما بعد إضافة سمك الجدار وقطرها براديكينين وسجل.
      ملاحظة: اعتماداً على الخصائص الدوائية الشريان للفائدة (سرير الأوعية الدموية والأنواع) مضيق للأوعية ووعائي (تعتمد على البطانة) مركبات أخرى يمكن استخدامها.
  7. اختياري: إصلاح الشريان المضغوط أو تواصل مع تصوير الكولاجين والايلاستين لحجم الكثافة (الخطوة 7).
    1. إضافة 4% فورمالدهايد في 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) عند 37 درجة مئوية ح 1.
    2. أغسل الشريان ثابت ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني 1 x والشريحة بلطف الشريان قبالة القنيات، لمس فقط أجزاء من الشريان خارج عقده. لا إزالة عقده، واستخدامها لعقد الشريان عندما نقل إلى أنبوب تخزين.
    3. مخزن في 1 × برنامج تلفزيوني/0.05% أزيد الصوديوم في 4 درجات مئوية حتى التصوير لكثافة حجم الايلاستين والكولاجين أو لأغراض أخرى.
      ملاحظة: يمكن تخزين الشرايين ثابت لمدة 3 أشهر على الأقل في 1 × برنامج تلفزيوني/0.05% أزيد الصوديوم في 4 درجات مئوية.

4-حساب علاقات سلالة الإجهاد وتصلب الجدار الجوهرية

  1. يرجى اتباع الصيغ وخطوات الحساب لحساب الضغوط وسلالات وصلابة الجدار كما هو موضح بلوكسجارد, M. et al. 13 ومراجع هنا.

5-صورة التحليل-الزوايا المتفرعة IEL (الصفيحة المرنة الداخلية)

  1. فتح الصورة في مكدس الذاكرة المؤقتة في فيجي. اذهب إلى الملف | فتح الصورة لاختيار صورة المكدس.
    ملاحظة: تستخدم إسقاطات كثافة ماكس 2-7 على التوالي z-أقسام تغطي IEL (1-2 ميكرون سمك) لتحديد IEL الايلاستين الألياف المتفرعة الزوايا باستخدام أداة زاوية في فيجي28،35. الرجوع إلى الشكل 4A للتوضيح.
  2. اذهب إلى الصورة | مداخن | z المشروع... لاختيار الصور و "ماكس كثافة الإسقاط".
  3. حفظ الإسقاط كثافة ماكس كالمشاجرة.
  4. اختر العديد من النقاط المتفرعة الألياف IEL قدر الإمكان باستخدام أداة "زاوية"، والعمل بشكل منهجي من خلال الصور. اضغط على ctrl + M لقياس كل زاوية.
  5. حفظ ورقة النتائج فيجي.

6-صورة التحليل-الأغطية الكولاجين أدفينتيتيال

  1. فتح الصورة في مكدس الذاكرة المؤقتة في فيجي. اذهب إلى الملف | فتح الصورة لاختيار صورة المكدس.
    ملاحظة: ماكس إسقاطات كثافة من 2-7 على التوالي z-أقسام تغطي حق الكولاجين خارج الصفيحة المرنة الخارجية (ثعبان البحر، 1-4 ميكرون سمك) هي المستخدمة لتحديد الأغطية الكولاجين باستخدام البرنامج المساعد "نيروني فيجي"36 كما وصفها ريزاخانيها، R . وآخرون. 37 (الشكل 4 باء).
  2. تعيين المقياس. اذهب إلى تحليل | تعيين مقياس لإدخال أبعاد البيكسل.
  3. اذهب إلى الصورة | مداخن | z المشروع... اختيار الصور للعمل مع "ماكس كثافة الإسقاط".
  4. تغيير نوع الصورة إلى بيت 8 TIFF بالنقر فوق صورة | نوع | 8 بيت وحفظ الإسقاط كثافة ماكس كالمشاجرة.
  5. قياس الاستقامة ألياف الكولاجين باستخدام "البرنامج المساعد ي العصبية فيجي".
    1. فتح المساعد نيروني بواسطة النقر فوق فيجي | الإضافات | العصبية ي.
    2. فتح 8 بت TIFF في نيروني بالنقر فوق "تحميل صورة" | حدد ملف.
    3. انقر فوق إضافة وسم، وحدد الألياف لتحليل بالنقر في بداية ونهاية كل الألياف.
    4. انقر فوق وسم التدبير، اختر عرض التتبع (Lf) و قياسات الرأس في مربع الحوار.
  6. حساب المستوى 0/Lf في excel (أو ما شابه ذلك)، وحفظ النتائج.
    1. نسخ ولصق الإخراج "فيجي العصبية ي" وسم والقمم إلى excel (أو ما شابه ذلك) وحساب L0 باستخدام مبرهنة فيثاغورس لمن قياسات الرأس. النقطة الأولى والأخيرة على خط تشير إلى مواقف الغايات الوتر في نظام إحداثي ثنائي الأبعاد.
      ملاحظة: المستوى 0/Lf [الكولاجين الألياف حزمة نهاية إلى نهاية طول عبر خط مستقيم (L0)/كامل طول (Lf)] ما يقرب من 1 يشير إلى ألياف الكولاجين تقريبا على التوالي.

7-تصوير لكثافة حجم الايلاستين والكولاجين

  1. أغسل الشريان (ثابت) 1 x في برنامج تلفزيوني ووصمة عار عليه لمدة 15 دقيقة في 1 ميكرومتر ويوزين في برنامج تلفزيوني 1 x في الظلام. للشرايين الثابتة، تنفيذ هذه الخطوة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: ثم يعزز fluorescence الايلاستين. ثم سوف وصمة عار هياكل أخرى مثل الكولاجين والسيتوبلازم الخلية إذا ترك العينة في الحل المصبوغة لتمديد الوقت. إذا كانت مكثفة جداً تلطيخ الهياكل الأخرى، انخفاض تركيز ويوزين إلى 0.3 ميكرومتر أو تكرار الغسيل.
  2. أغسل الشريان 3 x في 1 x برنامج تلفزيوني
    1. للشرايين الثابتة: جبل الشريان للتصوير.
      تنبيه: لا يسمح تصوير الأوعية غير مضغوطة استرجاع أي معلومات كمية هندسية. عندما يتطلب الأمر الكميات المطلقة، هذه ينبغي دائماً الحصول على الشرايين الحية، والضغط. يمكن الحصول على وحدة التخزين-نسب في الشرايين غير مضغوطة مع هذا الأسلوب.
      1. قطع مكان اثنين من لاصق مزدوج الشريط 1-1.5 سم وبصرف النظر عن زجاج الكائن. الشريط اللاصق المزدوج هو حوالي 100 ميكرومتر سميكة. تطبيق طبقة واحدة أو أكثر من الشريط بحيث تتطابق مع قطر الشريان ليتم تحميلها.
      2. 10-20 ميليلتر من برنامج تلفزيوني على الزجاج في وسط الساحة ومكان الشريان في إسقاط برنامج تلفزيوني.
        ملاحظة: يجب أن يكون القطرة صغير ومسطح قدر الإمكان لتجنب دفع الشريان الخروج من الموقف عند تركيب بكشف الغطاء.
      3. ضع ساترة واضغط على الشريط اللاصق المزدوج.
      4. ملء الخزان بين ساترة والزجاج الكائن مع 1 x PBS. تعبئة كل ساعة لتجنب تجفيف العينة.
  3. الحصول على الصورة-مداخن للكولاجين والايلاستين حجم كثافة استخدام هدفا X 20 مع نا > 1 لتغطية جزء كبير من الجدار الشرياني ممكن بينما لا تزال تواجه قرار جيد بصرية (الشكل 2D، 2 غ و 2 ح).
    ملاحظة: استخدم هدفا غمر مياه لتصوير الشرايين ثابتة تحت ساترة، واستخدام مياه غمس الهدف لتصوير الشرايين الحيوية. إذا لم يكن لديه الهدف طوق تصحيح لتصحيح لسمك الغطاء زلة، تأكد من تطابق ساترة للهدف. يفضل استخدام أحجام بكسل الأمثل وتباعد z. حساب هذه باستخدام الحاسبة نايكست (الخطوة 3.3.1.1.). وبدلاً من ذلك، استخدم حجم بكسل الحد أدنى من 300 نانومتر وتباعد z من 1 ميكرومتر. من المستحسن الحصول على ثلاث صور على طول الشريان للسماح للمستخدم لتحديد التغير داخل مقايسة.
  4. توسيط الصورة الايلاستين استخدام 820 نانومتر الإثارة الخفيفة وجمع الانبعاثات باستخدام تصفية واسعة شمال البحر الأبيض المتوسط 30-60 في ممر الموجه في 520 نانومتر.
  5. الكولاجين الصورة باستخدام ضوء الإثارة نانومتر 990 لتجنب أي الإثارة الايلاستين وغيرها من البروتينات أوتوفلوريسسينت وجمع الانبعاثات باستخدام تصفية 10-30 نانومتر ممر الموجه واسعة تركزت في 495 نانومتر.
  6. حفظ صورة أكوام من كل قناة بشكل منفصل كملفات TIFF

8-صورة التحليل لاستخراج الايلاستين والكولاجين حجم كثافة استخدام إيلاستيك

  1. تحويل رصات الصور TIFF إلى HDF5 باستخدام فيجي28،35 بواسطة النقر فوق اختيار الملف | حفظ باسم... HDF5.
  2. قم بإنشاء مجلدين من ملف البيانات على القرص الثابت في الكمبيوتر، واحدة الايلاستين، وواحد للكولاجين رصات الصور، على التوالي. نسخ رصات الصور ذات الصلة إلى المجلد ذات الصلة.
  3. إنشاء مشروعين إيلاستيك جديدة في البرنامج إيلاستيك، واحدة من الايلاستين، واحد للكولاجين، على التوالي.
    1. افتح إيلاستيك | إنشاء مشروع جديد | التصنيف بكسل | مشروع جديد | إضافة بيانات وتحديد صورة مجلد تم إنشاؤه في الخطوة 8، 2.
      ملاحظة: اتبع معالج إيلاستيك.
  4. استيراد مكدس واحد صورة ثلاثية الأبعاد لتدريب البرنامج.
    1. حدد التطبيق الصغير "بيانات الإدخال" | مساحة الرئيسية | تبويب البيانات الخام | إضافة جديدة... | إضافة صورة منفصلة واختر بيانات الصورة المرجوة
  5. اختر السمات ذات الصلة في البرنامج.
    1. فتح "تحديد الميزة" الصغير | حدد سمة الذي يفتح مربع حوار جديد. انظر الشكل 5 ألف للحصول على التفاصيل.
  6. إضافة تسميات اثنين على الأقل باستخدام الزر إضافة التسمية ضمن برنامج التدريب.
    ملاحظة: سوف تقابل كل تسمية لنوع كائن الذي يحتاج إلى فصل. في هذا العمل، وتستخدم التسميات الثلاث الايلاستين: الايلاستين نفسه، النقاط المضيئة (باستثناء)، والخلفية (باستثناء).
  7. رسم التسميات أعلى المكدس صورة raw باستخدام فرشاة الطلاء على غرار أداة التعليق التوضيحي.
    1. حدد التسمية المناسبة: انقر فوق أداة الفرشاة والبدء في الرسم.
  8. موجه إيلاستيك لتحليل المكدس الصورة والبحث عن ميزات مماثلة بواسطة النقر فوق تمكين التحديث العيش.
  9. التحقق بعناية من الخريطة التنبؤ (الشكل 5).
    ملاحظة: يظهر العملية من الصورة الخام لمخطط التنبؤ بكامل في الشكل 5. يستخدم إيلاستيك المكدس خريطة التنبؤ لتجزئة الصورة وفقا للتسمية التي بكسل من الأرجح أن تكون مرتبطة (الشكل 5).
  10. تطبيق عتبة.
    1. تحديد مستوى عتبة الصغيرواختر الأسلوب المناسب، تسمية الإدخال، على نحو سلس، وعتبة وحجم معلمات التصفية، وأخيراً انقر فوق تطبيق.
      ملاحظة: هذا يعزل وبالمثل المسمى أجزاء الصورة إلى كائنات منفصلة. الأنسجة شديدة متصلة، مثل الايلاستين والكولاجين لا تحتاج إلى عزلهم، لذلك، يتم تطبيق عتبة 0.4 (الافتراضي هو 0.5). يوضح الشكل 5E و 5F نتيجة لتطبيق عتبة.
  11. كرر تدريب إيلاستيك إلى النتائج غير مرضية (المسلم فقط إيلاستين الكولاجين على التوالي للتحليلات الخاصة بكل منها).
    1. وكثيراً ما التبديل بين التدريب وتجزئة (وأيضا في بعض الأحيان مستوى العتبة) تطبيقات أثناء هذه العملية. ويرد مثال على أثر إعادة التدريب إيلاستيك في الشكل 6.
  12. دفعة تحليل بيانات صورة مماثلة: حدد الدفعي التنبؤ بالتحديد الإدخال وإضافة الملفات ذات الصلة.
    ملاحظة: إيلاستيك الإخراج هو مجموعة من رصات الصور 3D الزائفة-1 بت (صورة أقنعة) مع 0 (صفر) تدل على عدم وجود الايلاستين (أو الكولاجين) و 1 (واحد) تدل الوجود هذا العقد (عمق البت الفعلي 8 بت).
  13. التحقق من النتائج لكل مكدس الصورة بشكل مرئي مقارنة أقنعة الصور وملفات الصور raw.
  14. تحسين القناع إيلاستيك (خطوات 8.4-8.9) وإعادة تحليل أية مكدسات الصورة مع نتائج غير مرضية.
  15. حساب كثافة حجم الايلاستين والكولاجين من إيلاستيك صورة أقنعة باستخدام MATLAB
    1. فتح MATLAB.
    2. حدد مجلداً مع إيلاستيك صورة أقنعة في MATLAB "المجلد الحالي" نافذة.
    3. نسخ البرنامج النصي MATLAB من التكميلية الملف 1 إلى محرر MATLAB وحفظ التعليمات البرمجية ك volumeCalculator.m في MATLAB مجلد على القرص الثابت في الكمبيوتر.
    4. أدخل أحجام بكسل والارتفاع بكسل في بنود البرنامج النصي
      بيكسيلسيزي = 0.1230000 * 0.1230000؛ ميكرون % * ميكرون
      بيكسيلهيت = 0.9؛ ميكرون %
    5. حفظ البرنامج النصي.
    6. اذهب إلى نافذة الأوامر MATLAB وأدخل "فولوميكالكولاتور (' المسار إلى البيانات--')" لتحميل البرنامج النصي.
    7. انقر فوق إدخال. ولخص كل قناع الصورة الآن ومضروبا في حجم بكسل/فوكسل (معروف) (الأبعاد المادية بكسل مضروباً في القرار محور ع). الإخراج من MATLAB هو الحجم الإجمالي من الايلاستين والكولاجين في كل مكدس من الصورة.
  16. حفظ النتائج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويرد في الشكل 1ميوجراف الضغط مبنية خصيصا للتصوير المستخدمة في هذا العمل. تم إيلاء عناية خاصة للتصميم ميوجراف ط) الدائرة مع حجم صغير (2 مل) والثاني) إمكانية تحديد المواقع القنيات قريبة إلى، وجنبا إلى جنب مع أسفل الزجاج (الشكل 1B). الجزء السفلي من الدائرة يناسب 50 × 24 مم #1.5 زجاج ساترة (قابلة لاستبدال). وحدة التحكم بالضغط بنيت من زجاجة زجاجية ل 1 قياسية ومقياس ضغط الدم (الكفة إزالة). لإعداد ميوجراف مع متطلبات التدفق، يوصي باستخدام وحدة تحكم الماكينة بالضغط.

ويبين الشكل 2 مواقف الموصى بها للحصول على الصور واحدة ورصات الصور أثناء التجربة المبينة في البروتوكول. ولأغراض التوضيح، يتم تضمين صورة مجهرية خفيفة انتقال الشريان محمل في الشكل 2 ألف. طول عقده إلى عقده الشريان محمل حوالي 1.6 ملم. يتم تفحص الشريان حتى قطر أوسع من الملاحظ (الشكل 2)، وفي هذه المرحلة، سمك الجدار وقطرها العزم (الشكل 2). وبالمثل، المدرجة في 2D الشكل، تظهر الموضع صورة ضوء انتقال الشريان وأوصى بعرض رصات الصور لتحديد ميكروارتشيتيكتوريس (الشكل 2E) الكولاجين والايلاستين (الشكل 2 واو، صغيرة ساحة في 2D الشكل) فضلا عن رصات الصور لتحديد كثافة حجم الايلاستين (الشكل 2 ح) (أكبر ساحة، الشكل 2D) والكولاجين (الشكل 2). باستخدام هذا النهج، يمكن الحصول على البيانات لإنشاء منحنيات القطر الضغط، متبوعاً بحساب منحنيات الإجهاد-الانفعال المقابلة من قياسات سمك الضغط والقطر والجدار (الشكل 2).

واحد أسي تناسب العلاقة الإجهاد-الانفعال وفقا بلوكسجارد وآخرون. 13 والمراجع هنا، يوفر β-القيمة، تدبير مستقلة هندسة من صلابة الجدار يتناسب مع معامل المرونة الإضافية، هلجنة التفاوض الحكومية الدولية. حساب هلجنة التفاوض الحكومية الدولية في الضغوط المختلفة التي تم الحصول عليها ميكروارتشيتيكتوريس في الصور التي للكولاجين والايلاستين، يسمح بتحليل مباشر للعلاقة بين الضغط الناجم عن التغيرات في ميكروارتشيتيكتوريس الكولاجين والايلاستين ومعامل المرونة الإضافية عند ضغوط مختلفة (الشكل 3). قياس الزوايا المتفرعة IEL والاستقامة الكولاجين يتضح في الشكل 4.

لتفسير ميكانيكية البيانات المقارنة بين اثنين أو أكثر من مجموعات الاهتمام، مثل مرضى ارتفاع ضغط الدم مقابل نورموتينسيفي، ومن المهم تحديد محتوى الايلاستين والكولاجين. لذلك، تم تطوير أسلوب تحليل تلقائي في إيلاستيك، تحليل برامج التي يمكن تدريبهم على التعرف على بعض ميزات الصورة، صورة مجانية. ويبين الشكل 5تدفق العمل في إيلاستيك.

الكشف التلقائي من الايلاستين والكولاجين كثافات التخزين، من المهم أن هناك نسبة الإشارة إلى الضوضاء جيدة في الصور التي تم الحصول عليها. في العينات البشرية، كثيرا ما يلاحظ أوتوفلوريسسينسي كبيرة من الكولاجين بالإضافة إلى إشارة SHG الكولاجين. وهذا يقلل نسبة الإشارة إلى الضوضاء للكشف عن الايلاستين. يبين الشكل 6 كيفية إعادة التدريب للبرنامج إيلاستيك يمكن أن ينتج الاعتراف أفضل من ألياف الايلاستين رقيقة في عينة مع أوتوفلوريسسينسي الكولاجين كبيرة في "الأخضر"/قناة الايلاستين. إذا تنزف من خلال إشارة أوتوفلوريسسينسي في القناة SHG الكولاجين مشكلة، قد يساعد في الحصول على إشارة SHG استخدام موجه إثارة وقتاً أطول. إذا كانت القناة تنزف من خلال يحدث بعد تلطيخ مع ويوزين، ينبغي تخفيض تركيز الحل المطبق من ثم. ثم هو بسهولة غسلها، حتى الغسيل المتكرر للعينة الملون قد إنقاص الإشارة جداً.

Figure 1
الشكل 1 . مخصص بني ميوجراف الضغط لتصوير fluorescence. (أ) نضح الدائرة مع الزجاج الشعيرات تعلق على ميكرومانيبولاتورس، التي شنت على محول قوة (قوة الطولية). (ب) 2 مل التصوير الدائرة. الانحناء 45° القنيات يسهل التصوير باستخدام مجهر مقلوب. (ج) الضغط وحدة تحكم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . الجمع بين الضغط ميوجرافي والأسفار التصوير استراتيجية- (أ) نقل صورة الخفيفة الشريان مع الرسم التوضيحي (ب) مسح من العرض الكامل للشريان. الكولاجين ويرد SHG في الخضراء، وأوتوفلوريسسينسي الايلاستين في الأرجواني. (ج)-التجويف الشرياني القطر (ميكرومتر هنا 238)، وسمك الجدار (هنا 17 و 18 من ميكرومتر أعلى وأسفل، على التوالي) يتحدد في المنطقة الاستوائية (أكبر قطر لاحظت) الشريان. (د) نقل صورة الخفيفة الشريان مع توضيح موقف z-المداخن التي تم الحصول عليها في نطاق 10-50 ميكرون لتحديد الاستقامة الكولاجين (E)، زوايا (و) المتفرعة عن مرونة داخلية، و (ز) z-المداخن التي حصلوا عليها في 50-100 ميكرومتر مقياس للحصول على الكولاجين والايلاستين (ح) حجم الكثافة. صور باء/جيم: الارتفاع 300 ميكرون (بار 20 ميكرومتر)، E/f: 50 × 50 ميكرومتر (بار 10 ميكرومتر)، ز/ح 130 × 130 × 30 ميكرومتر (بار = 30 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . التغييرات ميكروستروكتورال في الكولاجين أدفينتيتيال والصفيحة المرنة الداخلية (IEL) وعلاقتها ببواقي مطاطا تزايدي كفافى في 20 و 40 و 100 ملم زئبق. (A) زوايا متفرعة من ألياف الايلاستين في IEL. (ب) الاستقامة ألياف الكولاجين أدفينتيتيال قريبة من الصفيحة المرنة الخارجية. فتم تحديد القيم ووفقا للقيم و استخدام القياسات المتكررة ANOVA أحادي الاتجاه: ف/F-values ج: 0.0014/24.18، 0.0002/37.38 ب:. (ج) IEL الزوايا المتفرعة يرتبط [نونلينرلي] مع هلجنة التفاوض الحكومية الدولية. (د) الكولاجين الاستقامة يرتبط خطيا مع هلجنة التفاوض الحكومية الدولية. وترد البيانات يعني ± SE. ميكروستروكتورال تم تحديد تغييرات (أ وب وإكساكسيس جيم ودال) للشرايين المقاومة 6 تعرض للتصوير الحيوي بينما هلجنة التفاوض الحكومية الدولية (C و D) تم حساب النسبة 20 الشرايين الأخرى يتعرضون لضغوط ميوجرافي في معيار ميوجراف الضغط. وكان الشريان كل درس من شخص آخر. وقد تم تعديل هذا الرقم من بلوكسجارد وآخرون. 13- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 . رسم توضيحي لقياسات الزوايا المتفرعة IEL والاستقامة الكولاجين في فيجي- (أ) IEL الزوايا المتفرعة يدوياً وتقاس باستخدام أداة زاوية فيجي. (ب) الاستقامة الكولاجين عازمة على استخدام البرنامج المساعد "ي العصبية فيجي" كنسبة طول نهاية إلى نهاية الألياف الكولاجين واحد عبر خط مستقيم (أبيض) مقسوماً على طول إلى النهاية الفعلية للألياف (برتقالي). شريط الحجم: 20 ميكرومتر.

Figure 5
الشكل 5 . سير إيلاستيك- (أ) ميزة إطار التحديد مع الإشارة إلى الميزات المحددة. (ب) مثال الصورة الخام مع تسميات (ج) لألياف الايلاستين والنقاط المضيئة (غير مرغوب فيها) والخلفية التي سلط عليها الضوء في الأحمر والأخضر والأزرق، على التوالي. (د) يؤدي إلى التنبؤ بخريطة للصورة (ب) مع التسميات المشار إليه في (ج). (ﻫ) تجزئة استناداً إلى خريطة التنبؤ في الفقرة (د) قبل (ه) وبعد (و) تطبيق عتبة 0.5. ويظهر اللون الأصفر بكسل متصل المقابلة للميزة المنفصل (الايلاستين). شريط الحجم: 25 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 . مثل الصور قبل وبعد التحسين للتنبؤ إيلاستيك خريطة تبين أثر إعادة التدريب إيلاستيك للاعتراف بألياف الايلاستين في عينة مع الأسفار خلفية عالية من الكولاجين (دون المستوى الأمثل إشارة إلى نسبة الضوضاء). (أ) الصورة الأصلية، (ب) نتيجة لتحليل إيلاستيك الأولى، حيث لا سيما ألياف الايلاستين رقيقة (الجانب الأيسر من الصورة ب) ليست مدرجة في التجزئة والنتيجة (ج) النهائية عقب الأمثل لخريطة التنبؤ. شريط الحجم: 25 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ملف تكميلي الرجاء انقر هنا لتنزيل هذا الملف

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويمثل هذا العمل لدينا اقتراح موحد، والجمع بين التصوير والضغط ميوجرافي نهجاً، قيمة لتقييم الخواص الميكانيكية لمقاومة الشرايين والتغييرات ذات الصلة بالضغط في هيكل الشرياني المتزامن الجدار أكثر من مجموعة ضغط من 0 إلى 100 ملم زئبق. وضعت النهج المقدمة باستخدام معدات مخصصة بنيت، بيد أي ميوجراف الضغط التي تناسبها في مجهر الأسفار إثارة اثنين-فوتون يمكن استخدامها، عندما يسمح تصميم كلا معدات تصوير الجدار الشرياني. وينبغي إيلاء اهتمام خاص إلى الشكل والعرض والعمل عن بعد للهدف، والشروط التي سيتم إجراء التصوير. مجاهر تستقيم تتطلب استخدام المياه غمس الأهداف، بينما ينصح باستخدام أهداف غمر المياه للمجهر المقلوب تجنب حدوث اختلافات في الانكسار بين العينة والهدف. وعلاوة على ذلك، ينبغي إيلاء اهتمام لسمك ساترة، أما بتطبيق تصحيح لعدم تطابق بين الهدف وساترة باستخدام طوق التصويب على الهدف (إذا كان موجوداً) أو عن طريق مطابقة سمك ساترة بهدف المستخدمة.

في بروتوكول وصف، والاستفادة من الضوء الطاقة المنخفضة، والقريبة من الأشعة تحت الحمراء للتصوير أوتوفلوريسسينسي الايلاستين والكولاجين SHG. وهذا ما يسمح تصوير لفترات طويلة من الزمن. في الشرايين المقاومة البشرية المستخدمة في هذه الدراسة، IEL تتألف من شبكة الألياف مثل الانحياز طوليا من الايلاستين المترابطة ألياف13،33، مشابهة لهيكل IEL البشرية المقاومة تحت الجلد 38،الشرايين (هسكا)39. تقييم التغييرات في الزوايا المتفرعة من ألياف الايلاستين في IEL وتستخدم جنبا إلى جنب مع التدابير uncoiling تدريجيا من ألياف الكولاجين أدفينتيتيال مع تزايد الضغوط37 لتقييم التغييرات في المصغرة الايلاستين و الكولاجين على التوالي. تم الحصول على الصور لتقييم ميكروارتشيتيكتوريس الايلاستين والكولاجين في المنطقة نفسها من الاهتمام داخل الجدار الشرياني عند ضغوط مختلفة. وهذا ما يسمح تحليل القياسات المتكررة. عندما يكون ذلك ممكناً، ويمكن أن تهدف المحقق الحصول على الصور في المناطق ذات الاهتمام، على الأقل 3 مع صورة أحجام 10-50 ميكرومتر في كل بعد من الأبعاد. ومع ذلك، اعتماداً على العينة، لا سيما سمك الجدار الشرياني، قد حلاً وسطا بين العدد المناطق الممسوحة ضوئياً من الفائدة ومدة ممكنة من التجربة. في حالة الشرايين المقاومة التامور الإنسان، الشرايين ظل على قيد الحياة لمالا يقل عن 8-12 ساعة التجريب. مسح مناطق عدة تهم يسمح تقييم من داخلها-مقابل تقلب العينة بين ومما يؤيد الاستنتاج على النتائج التي تم الحصول عليها.

من المهم أن نلاحظ أن لتجنب أحداث أضرار سمي ضيائي، ينبغي تجنب التصوير باستخدام ضوء الإثارة العالية الطاقة عند العمل على عينات الأنسجة الحية. وفي ضوء هذا، من المستحسن الحصول على رزمة الصورة الكبيرة للكولاجين والايلاستين حجم الكثافة في نهاية البروتوكول التجريبي، وبدلاً من ذلك على عينات ثابتة. عندما يتطلب الأمر الكميات المطلقة لمكونات إدارة المحتوى في المؤسسة، ينبغي تحديده كمياً أي تأثير لمثبت على كثافة حجم وتؤخذ في الاعتبار. يسمح التثبيت و permeabilization الشرايين علاوة على ذلك تلطيخ الأهداف داخل الخلايا للفائدة عند الضرورة. في هذا البروتوكول، يتم تنفيذ تلطيخ الايلاستين باستخدام ويوزين في الشريان حية. يمكن تطبيق تلوين من الايلاستين بتحقيقات محددة (مثل أليكسا 633 المالئيك40) والكولاجين (مثلاً، CNA3541)، جنبا إلى جنب مع بقع أخرى (مثلاً، فالويدين42) أو الحمض النووي، لتيسير التقييم الكثافة الحجمية والهيكل التنظيمي للهياكل الأخرى ذات الاهتمام في الجدار الشرياني. قد توفر هذه الفرصة لمختبرات البحوث مع مجاهر [كنفوكل] فوتون واحد فرصة للتحقيق في التغييرات ميكروستروكتورال في الشرايين المقاومة. شرائح من نفس الشريان قد تعامل تحت ظروف مختلفة، ثابتة تحت ضغط وتصويرها في مرحلة لاحقة لمقارنة أثر المعالجة التطبيقية. ينبغي تصور الأهداف ذات الاهتمام بتصوير الأوعية إعادة مقني وإعادة المضغوط والملون. إعادة كانولاتيون وإعادة الضغط مطلوب عند تعتبر التغييرات الهيكلية، كما الايلاستين لا يمكن أن تكون ثابتة ومن ثم سوف نكص وتغيير هيكل ثلاثي الأبعاد ال43،الشريان الثابتة44. العيب من تحديد التغيرات الهيكلية في الشرايين ثابت هو أن عدة قطاعات يجب أن تكون ثابتة للمقارنة، ولا يمكن إجراء تحليلات لقياس تكرار.

يمكن استخدام البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام التصوير مباشرة لحساب الجدار الضغوط والتوترات، ودعم التفاهم وميكانيكا جدار الأوعية الدموية، كما هو موضح في بلوكسجارد، م. وآخرون13. في هذا العمل، تم تطبيق نموذج رياضي لوصف صلابة الجوهرية من الايلاستين ومكونات الكولاجين الجدار الشرياني وتقدير الكولاجين التوظيف سلالات45،46 على أساس من حسابها علاقات سلالة الإجهاد. تصوير تؤيد الاستنتاجات من النمذجة الرياضية، وأن الكولاجين في الشرايين المقاومة البشرية عين الفعل في سلالة كفافى منخفضة والإجهاد الجدار. المقاييس الكمية للمصغرة من الايلاستين والكولاجين الموصوفة في هذا البروتوكول يمكن أن تكون زيادة تمديد، مستوحاة من العمل المكثف الذي يجري في الشرايين السباتي6،،من847، 48 , 49 والشريان الاورطي7،،من910،،من5051: تحليلات إضافية قد تشمل تقييم التوزيع المكاني والمصغرة من الكولاجين و ألياف الايلاستين داخل طبقات مختلفة من الجدار الشرياني، فضلا عن الألياف زوايا التوجيه (التوجيه فيما يتعلق بالمحور الطولي). بيل وآخرون. 15 معالجة الضغط الناجم عن إعادة تنظيم IEL والكولاجين أدفينتيتيال بما في ذلك نموذج تحليلي متعدد الطبقات لحساب صلابة والإجهاد في كل طبقة من الجدار الشرياني. تستخدم هذه الكتاب15 الشرايين البشرية المقاومة تحت الجلد التي تم الحصول عليها من المتطوعين صحية، والمتصلة الهيكل وتشدد على الحائط في 3 و 30 ملم زئبق، على التوالي.

الطريقة المقترحة في هذا البروتوكول نأمل أن يحفز المزيد من التحقيقات ووضع نماذج رياضية دافع ميكروستروكتورالي لفهم الخواص الميكانيكية للشرايين المقاومة الإنسان في الصحة والمرض. مع مزيد من التعديلات للأسلوب ليشمل أيضا زوايا الميول الكولاجين والايلاستين على طول المحور الطولي، خلايا العضلات الملساء كثافة التخزين والتوزيع المكاني والتوجه ضمن توزيع الجدار، الكولاجين والايلاستين الشرياني و التوجه في الغلالة وسائل الإعلام، ومنظمة الايلاستين والتوزيع في الغلالة الغلالة، بيانات التصوير يمكن تغذية التنمية إلى الأمام للنماذج الرياضية، تيسير فهم عملية إعادة عرض في ارتفاع ضغط الدم ومرض السكري، المتلازمة الأيضية. وبالمثل، كما اقترح تشن كساب لل52،التاجية دوران الأوعية الدقيقة53، النماذج المستندة إلى المجهرية الشرايين المقاومة البشرية يمكن أن توفر التنبؤات الشرياني الردود الميكانيكية في الماكرو-(الشريان كله) ومستويات micro-(structure) الميكانيكية لكل التأسيسية. هذه النماذج يجب أن تستند إلى البيانات الكمية من المعلمات الهيكلية والخواص الميكانيكية لطبقات الفردية ومكونات للجدار الشرياني للشرايين التي تنشأ من المتطوعين صحية والمرضى الذين يعانون من أمراض مختلفة، تلقي العلاجات الدوائية المختلفة. بيانات يتم جمعها بطريقة موحدة ومقارنة مع التشكيلات الجانبية عبر الأفراد مع مختلف عوامل الخطر والمرض والعلاج. الأسلوب الذي لديه القدرة على المساعدة في فهم كيفية تأثير المرض والعلاج الطبي على دوران الأوعية الدقيقة البشرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون مركز التصوير الطبية الحيوية الجزيئية الدانمركية في "كلية العلوم الطبيعية"، جامعة جنوب الدنمارك، لاستخدام المختبرات والمجاهر. يعترف روسينستاند Kristoffer والعلا ملكيور للمساعدة التقنية الممتازة مع الضغط ميوجرافي والتصوير.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine Science Tools 15401-12
Fine Science Tools 11251-23
Nikon SMZ800N
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. 761028 for dissection purpose
Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark 1.63, 2.13, 210mm
Smiths medical Intl, UK
Ethicon Ethilon 11-0
Custom built DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt
Mettler toledo
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. B3259
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. A7030
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. C5670
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. G7021
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. E3889
Merck Millipore, Hellerup, Denmark 1.00496.9010 Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution 
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. H3784
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. P9666
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. P5655
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. M2643
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S2002
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S5886
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S5761
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. 1.06462
Gibco, ThermoFisher Scientific 10010015
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. PHR1423
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. Z370525
 Tocris Bioscience, Bristol, UK 538944
Nikon Custom built
Spectra Physics, Mountain View, CA
Nikon CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27
Nikon CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75
Hamamatsu, Ballerup, Denmark H7422P-40
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). ChromaET 460 nm long pass dichroic
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). Chroma ET402/15X 
Scotch TM
coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19, (2), 187-194 (2010).
  2. Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med. 14, (5), 1037-1043 (2010).
  3. van den Akker, J., Schoorl, M. J., Bakker, E. N., Vanbavel, E. Small artery remodeling: current concepts and questions. J Vasc Res. 47, (3), 183-202 (2010).
  4. Rizzoni, D., Agabiti-Rosei, E. Structural abnormalities of small resistance arteries in essential hypertension. Intern Emerg Med. 7, (3), 205-212 (2012).
  5. Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: mechanisms and treatment. Hypertension. 59, (2), 367-374 (2012).
  6. Fonck, E., et al. Effect of elastin degradation on carotid wall mechanics as assessed by a constituent-based biomechanical model. Am J Physiol-Heart C. 292, (6), H2754-H2763 (2007).
  7. Chow, M. J., Turcotte, R., Lin, C. P., Zhang, Y. Arterial extracellular matrix: a mechanobiological study of the contributions and interactions of elastin and collagen. Biophys J. 106, (12), 2684-2692 (2014).
  8. Chen, H., et al. Biaxial deformation of collagen and elastin fibers in coronary adventitia. J Appl Physiol (1985). 115, (11), 1683-1693 (2013).
  9. Schriefl, A. J., Schmidt, T., Balzani, D., Sommer, G., Holzapfel, G. A. Selective enzymatic removal of elastin and collagen from human abdominal aortas: uniaxial mechanical response and constitutive modeling. Acta Biomater. 17, 125-136 (2015).
  10. Zeinali-Davarani, S., Wang, Y., Chow, M. J., Turcotte, R., Zhang, Y. Contribution of collagen fiber undulation to regional biomechanical properties along porcine thoracic aorta. J Biomech Eng. 137, (5), 051001 (2015).
  11. Mattson, J. M., Turcotte, R., Zhang, Y. Glycosaminoglycans contribute to extracellular matrix fiber recruitment and arterial wall mechanics. Biomech Model Mechan. 16, (1), 213-225 (2017).
  12. Schriefl, A. J., Zeindlinger, G., Pierce, D. M., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Determination of the layer-specific distributed collagen fibre orientations in human thoracic and abdominal aortas and common iliac arteries. J R Soc Interface. 9, (71), 1275-1286 (2012).
  13. Bloksgaard, M., et al. Imaging and modeling of acute pressure-induced changes of collagen and elastin microarchitectures in pig and human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. (2017).
  14. Dora, K. A., et al. Isolated Human Pulmonary Artery Structure and Function Pre- and Post-Cardiopulmonary Bypass Surgery. J Am Heart Assoc. 5, (2), (2016).
  15. Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311, (6), H1560-H1568 (2016).
  16. Roque, F. R., et al. Aerobic exercise reduces oxidative stress and improves vascular changes of small mesenteric and coronary arteries in hypertension. Brit J Pharmacol. 168, (3), 686-703 (2013).
  17. Briones, A. M., et al. Alterations in structure and mechanics of resistance arteries from ouabain-induced hypertensive rats. Am J Physiol-Heart C. 291, (1), H193-H201 (2006).
  18. Briones, A. M., et al. Role of elastin in spontaneously hypertensive rat small mesenteric artery remodelling. J Physiol. 552, (Pt 1), 185-195 (2003).
  19. Arribas, S. M., et al. Confocal myography for the study of hypertensive vascular remodelling. Clin Hemorheol Micro. 37, (1-2), 205-210 (2007).
  20. Gonzalez, J. M., et al. Postnatal alterations in elastic fiber organization precede resistance artery narrowing in SHR. Am J Physiol-Heart C. 291, (2), H804-H812 (2006).
  21. Spronck, B., Megens, R. T., Reesink, K. D., Delhaas, T. A method for three-dimensional quantification of vascular smooth muscle orientation: application in viable murine carotid arteries. Biomech Model Mechan. 15, (2), 419-432 (2015).
  22. Megens, R. T., et al. In vivo high-resolution structural imaging of large arteries in small rodents using two-photon laser scanning microscopy. J Biomed Opt. 15, (1), 011108 (2010).
  23. Megens, R. T., oude Egbrink, M. G., Merkx, M., Slaaf, D. W., van Zandvoort, M. A. Two-photon microscopy on vital carotid arteries: imaging the relationship between collagen and inflammatory cells in atherosclerotic plaques. J Biomed Opt. 13, (4), 044022 (2008).
  24. Bender, S. B., et al. Regional variation in arterial stiffening and dysfunction in Western diet-induced obesity. Am J Physiol-Heart C. 309, (4), H574-H582 (2015).
  25. Clifford, P. S., et al. Spatial distribution and mechanical function of elastin in resistance arteries: a role in bearing longitudinal stress. Arterioscler Thromb. 31, (12), 2889-2896 (2011).
  26. Martinez-Revelles, S., et al. Lysyl Oxidase Induces Vascular Oxidative Stress and Contributes to Arterial Stiffness and Abnormal Elastin Structure in Hypertension: Role of p38MAPK. Antioxid Redox Sign. 27, (7), 379-397 (2017).
  27. Foote, C. A., et al. Arterial Stiffening in Western Diet-Fed Mice Is Associated with Increased Vascular Elastin, Transforming Growth Factor-beta, and Plasma Neuraminidase. Front Physiol. 7, 285 (2016).
  28. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  29. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit. 2011 8th Ieee International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro, 230-233 (2011).
  30. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, (1 Pt 1), 493-508 (2002).
  31. Intengan, H. D., Deng, L. Y., Li, J. S., Schiffrin, E. L. Mechanics and composition of human subcutaneous resistance arteries in essential hypertension. Hypertension. 33, (1 Pt 2), 569-574 (1999).
  32. Saatchi, S., et al. Three-dimensional microstructural changes in murine abdominal aortic aneurysms quantified using immunofluorescent array tomography. J Histochem Cytochem. 60, (2), 97-109 (2012).
  33. Bloksgaard, M., et al. Elastin Organization in Pig and Cardiovascular Disease Patients' Pericardial Resistance Arteries. J Vasc Res. 52, (1), 1-11 (2015).
  34. World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. JAMA. 310, (20), 2191-2194 (2013).
  35. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  36. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58, (2), 167-176 (2004).
  37. Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomech Model Mechan. 11, (3-4), 461-473 (2012).
  38. Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4, (2), 20130058 (2014).
  39. Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311, (6), H1560-H1568 (2016).
  40. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9, (3), 273-276 (2012).
  41. Megens, R. T., et al. Imaging collagen in intact viable healthy and atherosclerotic arteries using fluorescently labeled CNA35 and two-photon laser scanning microscopy. Mol Imaging. 6, (4), 247-260 (2007).
  42. Staiculescu, M. C., et al. Prolonged vasoconstriction of resistance arteries involves vascular smooth muscle actin polymerization leading to inward remodelling. Cardiovasc Res. 98, (3), 428-436 (2013).
  43. Fung, Y. C., Sobin, S. S. The retained elasticity of elastin under fixation agents. J Biomech Eng. 103, (2), 121-122 (1981).
  44. Fung, Y. C. Biomechanics : mechanical properties of living tissues. 2nd, Springer-Verlag. (1993).
  45. Bakker, E. N., et al. Heterogeneity in arterial remodeling among sublines of spontaneously hypertensive rats. PLoS One. 9, (9), e1107998 (2014).
  46. VanBavel, E., Siersma, P., Spaan, J. A. Elasticity of passive blood vessels: a new concept. Am J Physiol-Heart C. 285, (5), H1986-H2000 (2003).
  47. Chen, H., et al. Microstructural constitutive model of active coronary media. Biomaterials. 34, (31), 7575-7583 (2013).
  48. Saez, P., Garcia, A., Pena, E., Gasser, T. C., Martinez, M. A. Microstructural quantification of collagen fiber orientations and its integration in constitutive modeling of the porcine carotid artery. Acta Biomater. 33, 183-193 (2016).
  49. Bellini, C., Ferruzzi, J., Roccabianca, S., Di Martino, E. S., Humphrey, J. D. A microstructurally motivated model of arterial wall mechanics with mechanobiological implications. Ann Biomed Eng. 42, (3), 488-502 (2014).
  50. Schriefl, A. J., Wolinski, H., Regitnig, P., Kohlwein, S. D., Holzapfel, G. A. An automated approach for three-dimensional quantification of fibrillar structures in optically cleared soft biological tissues. J R Soc Interface. 10, (80), 20120760 (2013).
  51. Weisbecker, H., Unterberger, M. J., Holzapfel, G. A. Constitutive modelling of arteries considering fibre recruitment and three-dimensional fibre distribution. J R Soc Interface. 12, (105), 20150111 (2015).
  52. Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based biomechanics of coronary arteries in health and disease. J Biomech. 49, (12), 2548-2559 (2016).
  53. Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based constitutive model of coronary artery with active smooth muscle contraction. Sci Rep. 7, (1), 9339 (2017).
تقييم الكولاجين والايلاستين ميكروارتشيتيكتوريس تعتمد على الضغط في الشرايين المقاومة البشرية، والعيش بالفحص المجهري Fluorescence تسمية خالية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bloksgaard, M., Thorsted, B., Brewer, J. R., De Mey, J. G. R. Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (134), e57451, doi:10.3791/57451 (2018).More

Bloksgaard, M., Thorsted, B., Brewer, J. R., De Mey, J. G. R. Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (134), e57451, doi:10.3791/57451 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter