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Bioengineering

का आकलन कोलेजन और Elastin दबाव पर निर्भर Microarchitectures रहते हैं, मानव प्रतिरोध धमनियों में लेबल से मुक्त प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

doi: 10.3791/57451 Published: April 9, 2018

Summary

हम एक साथ यांत्रिक परीक्षण और 3 डी-अलग, जीना मानव प्रतिरोध धमनियों की धमनी की दीवार के इमेजिंग, और फिजी और Ilastik छवि विश्लेषण का वर्णन elastin और कोलेजन स्थानिक संगठन और मात्रा घनत्व के ठहराव के लिए । हम धमनी की दीवार यांत्रिकी के गणितीय मॉडल में इन आंकड़ों के उपयोग पर चर्चा ।

Abstract

प्रतिरोध धमनी remodeling के रोगजनक योगदान आवश्यक उच्च रक्तचाप, मधुमेह और चयापचय सिंड्रोम में प्रलेखित है । जांच और स्वास्थ्य और रोग में मानव प्रतिरोध धमनियों के यांत्रिक गुणों को समझने के लिए microstructurally प्रेरित गणितीय मॉडल के विकास के लिए कैसे रोग और चिकित्सा उपचार समझ सहायता की क्षमता है मानव microcirculation को प्रभावित करता है । इन गणितीय मॉडलों को विकसित करने के लिए, यह microvascular दीवार के यांत्रिक और microarchitectural गुणों के बीच संबंध को समझने के लिए आवश्यक है । इस काम में, हम निष्क्रिय यांत्रिक परीक्षण और अलग मानव प्रतिरोध धमनियों की धमनी की दीवार में elastin और कोलेजन के microarchitecture के एक साथ लेबल मुक्त तीन आयामी इमेजिंग के लिए एक पूर्व vivo विधि का वर्णन. इमेजिंग प्रोटोकॉल ब्याज की किसी भी प्रजाति की प्रतिरोध धमनियों के लिए लागू किया जा सकता है । छवि विश्लेषण मैं बढ़ाता है के लिए वर्णित हैं) दबाव-आंतरिक लोचदार लेमिना शाखाओं में बदलाव प्रेरित और adventitial कोलेजन सीधे फिजी और द्वितीय का उपयोग कर) कोलेजन और elastin मात्रा Ilastik सॉफ्टवेयर का उपयोग कर निर्धारित घनत्व । अधिमानतः सभी यांत्रिक और इमेजिंग माप रहते हैं, perfused धमनियों पर प्रदर्शन कर रहे हैं, तथापि, मानक वीडियो का उपयोग कर एक वैकल्पिक दृष्टिकोण-पुनः दबाव वाहिकाओं के पद निर्धारण इमेजिंग के साथ संयोजन में सूक्ष्म दबाव myography है चर्चा. यह वैकल्पिक पद्धति उपयोगकर्ताओं को विश्लेषण के लिए भिंन विकल्प प्रदान करती है । धमनी की दीवार यांत्रिकी के गणितीय मॉडलों में यांत्रिक और इमेजिंग डेटा के शामिल किए जाने पर चर्चा की है, और भविष्य के विकास और प्रोटोकॉल के लिए परिवर्धन प्रस्तावित कर रहे हैं.

Introduction

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रोगजनक योगदान और प्रतिरोध धमनी remodeling के प्रभाव आवश्यक उच्च रक्तचाप, मधुमेह और चयापचय सिंड्रोम1,2,3,4,5में प्रलेखित हैं । microvascular दीवार के यांत्रिक और microarchitectural गुणों के बीच संबंध को समझने के लिए इस संघ के गणितीय मॉडलों के विकास के लिए आवश्यक है । इस तरह के मॉडल को फिर से तैयार करने की प्रक्रिया को समझने में सुधार होगा और silico मॉडल में के विकास का समर्थन करेंगे औषधीय रणनीति धमनी की दीवार के remodeling संबंधित रोग लक्ष्यीकरण के परीक्षण के लिए उपयोगी है ।

पहले अध्ययन कैसे धमनी की दीवार के microarchitecture यांत्रिक उपायों को शामिल करके धमनी की दीवार यांत्रिकी से संबंधित है और extracellular मैट्रिक्स (ECM) के microarchitecture लगभग विशेष रूप से बड़े पैमाने पर प्रदर्शन कर रहे है को समझने में ध्यान केंद्रित , चूहों या सूअर से लोचदार नाली धमनियों6,7,8,9,10,11. दीवार के microstructures की इमेजिंग आम तौर पर रैखिक ऑप्टिकल तकनीक का उपयोग कर, कोलेजन द्वारा elastin और दूसरी सुरीले पीढ़ी के autofluorescence का लाभ लेने के प्रदर्शन किया है । यह extracellular मैट्रिक्स, elastin और कोलेजन के दो प्रमुख घटकों के spatiotemporal इमेजिंग की अनुमति देता है, धुंधला के लिए एक की जरूरत के बिना । पूर्ण मोटाई में धमनी दीवार की इमेजिंग मोटी tunica मीडिया में प्रकाश के बिखराव के कारण बड़े नाली धमनियों में एक चुनौती है । हालांकि, यह निर्धारित करने के लिए कैसे धमनी की दीवार के संरचनात्मक घटकों के microarchitecture मनाया यांत्रिक गुणों से संबंधित है, तीन आयामी जानकारी यांत्रिक परीक्षण के दौरान प्राप्त किया जाना चाहिए । मानव महाधमनी की तरह बड़ी धमनियों के लिए, यह द्विअक्षीय बढ़ते, यांत्रिक परीक्षण और ब्याज के क्षेत्रों की इमेजिंग की आवश्यकता है 1-2 सेमी धमनी की दीवार के2 टुकड़ों में7,9,10, 12. दीवार का केवल एक भाग imaged और यांत्रिक रूप से परीक्षण किया जा सकता है ।

किसी भी प्रजाति की छोटी धमनियों के लिए (जैसे, मानव pericardial13, फुफ्फुसीय14 और चमड़े के नीचे15 धमनियों, चूहे mesenteric धमनियों16,17,18 , 19 , 20, माउस cremaster, mesenteric, सेरेब्रल, ऊरु और मन्या धमनियों21,22,23,24,25,26, 27) पूरी दीवार मोटाई के इमेजिंग संभव है और यांत्रिक परीक्षण के साथ जोड़ा जा सकता है । यह एक साथ यांत्रिक संपत्तियों और दीवार के भीतर संरचनात्मक व्यवस्था की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है । हालांकि, ECM के तीन आयामी संरचना में मनाया परिवर्तन के बीच संबंधों के प्रत्यक्ष गणितीय मॉडलिंग और प्रतिरोध धमनी दीवार के यांत्रिक गुणों को बदल दिया है, हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए ही है पर रिपोर्ट मानव प्रतिरोध धमनियों में हाल ही में13,15.

इस काम में, निष्क्रिय यांत्रिक परीक्षण और अलग मानव प्रतिरोध धमनियों की धमनी की दीवार में elastin और कोलेजन के microarchitecture के एक साथ तीन आयामी इमेजिंग के लिए एक पूर्व vivo विधि वर्णित है । इमेजिंग प्रोटोकॉल ब्याज की किसी भी प्रजाति की प्रतिरोध धमनियों के लिए लागू किया जा सकता है । छवि विश्लेषण आंतरिक लोचदार लेमिना शाखाकरण कोण और adventitial कोलेजन सीधे13 का उपयोग फिजी28के उपायों को प्राप्त करने के लिए वर्णित हैं । कोलेजन और elastin मात्रा घनत्व Ilastik सॉफ्टवेयर का उपयोग कर निर्धारित कर रहे हैं29 और अंत में, यांत्रिक और इमेजिंग डेटा के गणितीय मॉडल में धमनी की दीवार यांत्रिकी के शामिल किए जाने पर चर्चा की है ।

गणितीय मॉडलिंग के साथ संयोजन में इमेजिंग और छवि विश्लेषण तकनीक का वर्णन करने का लक्ष्य जांचकर्ताओं का वर्णन करने के लिए एक व्यवस्थित दृष्टिकोण प्रदान करने और समझने के लिए प्रतिरोध धमनियों के ECM में परिवर्तन प्रेरित दबाव है । वर्णित विधि प्रणा के दौरान एक पोत में ECM में परिवर्तन को बढ़ाता है, 20, 40 और 100 mmHg पर ECM की संरचना की तुलना द्वारा ध्यान केंद्रित है । इन दबावों को अपने अधिक अनुरूप (२० mmHg), कड़ा (१०० mmHg) और मध्यवर्ती (४० mmHg) राज्य में, क्रमशः धमनी की दीवार की संरचना निर्धारित करने के लिए चुना गया. हालांकि, लाइव धमनियों की संवहनी दीवार में किसी भी प्रक्रिया, vasoactive घटकों, हिस्टैरिसीस और प्रवाह द्वारा प्रेरित परिवर्तन सहित, quantified जा सकता है, अंवेषक द्वारा प्रश्न में अनुसंधान परिकल्पना पर निर्भर करता है ।

दाब का अध्ययन करने के लिए दाब myograph के साथ संयोजन में दो-फोटॉन उत्तेजना प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TPEM) का प्रयोग (या अन्य) जीने की धमनियों के ECM में प्रेरित परिवर्तन पर बल दिया जाता है. सबसे पहले, क्योंकि यह समग्र तीन के एक साथ अधिग्रहण की अनुमति देता है, धमनी की दीवार के आयामी संरचना (व्यास और दीवार मोटाई) तीन आयामी लेबल के साथ उच्च गुणवत्ता, कोलेजन और elastin की विस्तृत छवियों के मुक्त अधिग्रहण के साथ microarchitectures के रूप में वर्णित13 elastin autofluorescence और कोलेजन दूसरा हार्मोनिक उत्पादन संकेत (स्वसहायता)30का लाभ लेने के द्वारा । दूसरा, TPEM कम ऊर्जा के पास के उपयोग की अनुमति देता है-अवरक्त उत्तेजना प्रकाश, ऊतक के धूप को कम करने और इस प्रकार, दोहराया इमेजिंग नाड़ी दीवार के भीतर बिल्कुल एक ही स्थिति में अनुमति दी है, दोहराया की अनुमति-माप विश्लेषण मनाया परिवर्तन.

एक वैकल्पिक करने के लिए दबाव स्थिर धमनियों के फोकल इमेजिंग का उपयोग दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए उपयोग के लिए एक अवसर के रूप में अच्छी तरह से वर्णित विधि का उपयोग TPEM के बिना प्रयोक्ताओं की अनुमति पर चर्चा की है । ECM संरचना और मात्रा घनत्व पर सूचना भी धारावाहिक में खोदी ऊतकों के दो आयामी विश्लेषण से प्राप्त किया जा सकता है, उदाहरण के रूप में31,32द्वारा वर्णित. हालांकि, संभावना की कमी के कारण धमनी की लंबाई तराजू पर तीन आयामी संरचनात्मक जानकारी को पुनः प्राप्त करने के साथ ही बदलती परिस्थितियों के दौरान इस पद्धति का उपयोग कर, यह अनुशंसा नहीं है दबाव की जांच के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग कर और उपचार ECM में तीन आयामी परिवर्तन प्रेरित ।

अन्वेषक के लिए न्यूनतम आवश्यकता के साथ साथ वर्णित विधि लागू करने के लिए एक cannulation और प्रणा के साथ संयोजन में धमनियों के लिए एक सेटअप करने के लिए उपयोग है या दो फोटॉन उत्तेजना प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप. सेटअप निंनलिखित प्रोटोकॉल में वर्णित एक कस्टम निर्मित दबाव myograph एक अनुदैर्ध्य बल transducer, एक कस्टम पर फिट करने के लिए बनाया औंधा दो फोटॉन उत्तेजना प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ बनाया गया है ।

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Protocol

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इस कार्य में उपयोग के लिए मानव पार्श्विका पेरीकार्डियम के बायोप्सी का संग्रह लिखित सूचित सहमति के बाद किया गया था, जैसा कि पहले33बताया गया है । मानव ऊतकों का अध्ययन हेलसिंकी34 की घोषणा में उल्लिखित सिद्धांतों के अनुरूप है और दक्षिणी डेनमार्क के लिए स्वास्थ्य अनुसंधान नैतिकता पर क्षेत्रीय समितियों (एस-२०१०००४४ और एस-२०१४०२०२) और डेनिश डेटा संरक्षण एजेंसी द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. इकट्ठा ऊतक और अलग (मानव) प्रतिरोध धमनी

  1. एक सर्जरी के दौरान उत्पाद शुल्क पर तुरंत ब्याज की ऊतक नमूने ले लीजिए । 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ऊतक स्थानांतरण HEPES शारीरिक नमक समाधान (एचबीएस) तुरंत संग्रह पर बफर और यह एचबीएस में स्टोर ।
    नोट: मानव ऊतकों केवल प्रासंगिक संस्थागत और नैतिक समितियों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रोगियों के लिखित सूचित सहमति द्वारा अनुमोदन के बाद एकत्र कर रहे हैं । एमएम में एचबीएस रचना: NaCl 144, KCl 4.7, CaCl2 2.5, MgSO4 1.2, KH2पीओ4 1.2, HEPES १४.९, ग्लूकोज 5.5. NaOH के साथ पीएच 7.4 समायोजित करें, और हालांकि 0.2 µm फ़िल्टर समाधान फ़िल्टर ।
  2. निश्चेतक बाहर धोने के लिए रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ एचबीएस में एकत्र ऊतक छोड़ दें ।
    नोट: पोत अखंडता और कार्यक्षमता पर रातोंरात भंडारण के किसी भी प्रभाव व्यक्तिगत अनुसंधान प्रयोगशाला द्वारा जांच की जानी चाहिए ।
  3. सावधानी से अलग प्रतिरोध आकार धमनियों (± 200 µm लुमेन व्यास) तेज टिप संदंश और सूक्ष्म विच्छेदन कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर.
  4. बर्फ ठंडा एचबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर धमनियों की दुकान, जबकि इमेजिंग/

2. माउंट दबाव Myograph में अलग धमनी

  1. माउंट cannulae धारकों पर ~ 80 µm की नोक व्यास के साथ कांच cannulae । स्थिति युक्तियां चैंबर ग्लास नीचे के ऊपर लगभग 150 µm ।
    नोट: 45 ° झुका टिप cannulae नीचे कांच के ऊपर पोत की सटीक स्थिति की अनुमति दे सकता है ।
  2. दोनों प्रवेश और आउटलेट टयूबिंग एचबीएस के साथ 1% BSA के साथ भरें और दबाव प्रणाली से कनेक्ट ।
    नोट: BSA endothelial cell फ़ंक्शन को रक्षित करने के लिए शामिल है ।
  3. प्रवेशनी प्रति दो डबल गाँठ टांके का उपयोग कर अलग धमनी माउंट ।
    नोट: समुद्री मील अग्रिम में तैयार किया जा सकता है और जब तक जरूरत डबल चिपकने वाला टेप पर संग्रहीत ।
  4. एचबीएस के साथ चैंबर भरें और प्रत्येक गिलास प्रवेशनी पर दो डबल समुद्री मील की जगह ।
    नोट: myogenic टोन प्रदर्शित धमनियों का उपयोग करते समय, एचबीएस कैल्शियम मुक्त एचबीएस 3 µ एम EGTA और 3 µ एम सोडियम nitroprusside के साथ पूरक के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए ।
  5. तीव्र टिप संदंश के दो जोड़े का उपयोग कर एक छोर पर धीरे से धमनी पकड़ो । धमनी के लुमेन खोलें और धीरे प्रवेशनी पर यह स्लाइड. दो समुद्री मील का उपयोग कर प्रवेशनी पर फिक्स ।
  6. एचबीएस/1% BSA के साथ लुमेन को धीरे से फ्लश करने के लिए 5 mmHg का दबाव लागू करें ।
  7. धमनी के दूसरे छोर को Cannulate दो डबल गाँठों का प्रयोग कर प्रवेशनी पर उसे सुरक्षित कर देता है.
  8. माइक्रोस्कोप चरण के लिए myograph स्थानांतरण और 5 mmHg (प्रवेश दबाव = आउटलेट दबाव), तो 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी के लिए धमनी दबाव ।
  9. वैकल्पिक: अनुदैर्ध्य बल transducer निर्माता के निर्देशों के अनुसार जांचना (1 g = ९.८१ mN) ।
    नोट: यह तापमान संवेदनशील है के रूप में हीटिंग के बाद बल transducer जांचना आवश्यक है ।

3. प्रयोग प्रदर्शन: धमनी व्यास की इमेजिंग, दीवार मोटाई और कोलेजन और Elastin Microarchitecture का उपयोग TPEM

  1. जल्दी से 5 उत्तेजना में पोत व्यास और दीवार की मोटाई का आकलन करने के लिए एक 20X उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर (ना) ≥ 0.8) और कम बिजली mmHg प्रकाश का उपयोग करने के लिए दबाव cannulated धमनी को स्कैन ।
    नोट: उल्टे सूक्ष्मदर्शी के लिए, एक जल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करें; ईमानदार सूक्ष्मदर्शी के लिए, एक पानी सूई उद्देश्य का उपयोग करें । उद्देश्य एक सुधार कॉलर कवर स्लिप मोटाई के लिए सही करने के लिए नहीं है, तो इस्तेमाल किया उद्देश्य के साथ कवर पर्ची से मेल करने के लिए सुनिश्चित करें. सॉफ्टवेयर सेटिंग्स और विवरण उपयोगकर्ता-चरण और माइक्रोस्कोप और इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर के आधार पर भिन्न हो सकते हैं.
    1. सेटअप ऑप्टिकल पथ ।
      1. एक्टिवेट माई ताई टू-फोटॉन लेजर और इसे 820 एनएम उत्तेजना लाइट के लिए सेट करें ।
        चेतावनी: दृश्य के रूप में अच्छी तरह से अदृश्य लेजर प्रकाश के लिए किसी भी जोखिम से बचें ।
      2. दो चैनलों में एक साथ उत्सर्जन इकट्ठा । एक 460 एनएम लंबे पास dichroic दर्पण का उपयोग कर photomultipliers के बीच विभाजन उत्सर्जन प्रकाश और 30-60 एनएम चौड़ा bandpass 520 एनएम (elastin) और 410 एनएम (कोलेजन), क्रमशः पर केंद्रित का उपयोग उत्सर्जन इकट्ठा ।
    2. 10 µs लेजर के साथ सतत स्कैनिंग सक्षम करें/पिक्सेल और 512 × 512 पिक्सेल के 100% देखने के क्षेत्र के लिए ।
    3. अधिकतम व्यास मनाया जाता है जहां गहराई निर्धारित करने के लिए मैन्युअल रूप से धमनी के माध्यम से स्कैन.
    4. धमनी के व्यापक व्यास को कवर एक आयताकार स्लाइस चुनें और पिक्सेल आकार ≤ 300 एनएम/पिक्सेल (चित्र 2c) के साथ एक एकल फ्रेम को स्कैन करें । कम उत्तेजना प्रकाश शक्ति और पिक्सेल के रूप में समय का उपयोग करने के लिए जीना धमनी photodamaging से बचने के लिए संभव है ।
      नोट: यह समय बचाने के लिए और ऊतक फोटॉन एक्सपोजर (चित्रा 2c) को सीमित करने के लिए इस स्थिति पर द्विघात छवि के बजाय एक आयताकार, उदा, 100 × 1024 पिक्सेल छवि प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है ।
    5. बाद में विश्लेषण के लिए छवि को बचाओ ।
  2. धमनी के अधिकतम व्यास पर लुमेन व्यास और दीवार मोटाई का निर्धारण ।
    1. फिजी में छवि लोड ।
    2. मुख्य मेनू क्लिक करके स्केल सेट करें । विश्लेषण । स्केल सेट करें और µm/पिक्सेल और पिक्सेल अनुपात दर्ज करें (यह अत्यधिक पिक्सेल अनुपात 1:1 रखने के लिए अनुशंसित है) ।
    3. फिजी लाइन उपकरण चुनें और धमनी लुमेन के प्रत्येक पक्ष में दो आंतरिक लोचदार laminae के बीच एक लाइन आकर्षित, और ctrl + एमक्लिक करें । फिजी लंबाई के रूप में परिणाम तालिका में डिफ़ॉल्ट रिपोर्ट करता है ।
    4. इसी तरह, प्रत्येक दीवार की मोटाई मापने के लिए अधिक रेखाएं आरेखित करें, और निंनलिखित मार्कअप को मापने के लिए ctrl + M दबाएं ।
    5. माप को बचाओ ।
  3. छवि कोलेजन और elastin microarchitecture 5 mmHg में धमनी की दीवार की पूरी मोटाई स्कैनिंग द्वारा, 3 डी छवि के साथ अच्छी गुणवत्ता के ढेर प्राप्त करने के लिए 1-3 ब्याज की लंबाई के साथ क्षेत्रों धमनी.
    1. एक 60X उद्देश्य, ना ≥ 1, अनुकूलित पिक्सेल आकार और जेड-रिक्ति का उपयोग कर धमनी की पूरी दीवार के माध्यम से छवि ढेर प्राप्त करें ।
      1. वैज्ञानिक वॉल् यूम इमेजिंग Nyquist कैलकुलेटर (https://svi.nl/NyquistCalculator) का उपयोग करके ऑप्टिकल मार्ग, विसर्जन माध् यम और नमूना अपवर्तन सूचकांकों के अनुसार इष्टतम इमेजिंग शर्तों (पिक्सेल आकार और z-चरण रिक्ति) की गणना करें ।
        नोट: कृपया अनुभाग 3.4 में सलाह बनाम इष्टतम पिक्सेल आकार और z-रिक्ति के बीच अंतर के लिए यहाँ ध्यान दें. ऊपर एक अधिकतम पिक्सेल आकार के उपयोग पर ।
    2. ऊपर (3.1.1.) के रूप में एक ही उत्तेजना और उत्सर्जन सेटिंग्स का उपयोग करें ।
    3. जल्दी से ऊपर वर्णित के रूप में पोत दीवार को स्कैन करने के लिए z-स्टैक की मोटाई निर्धारित करते हैं ।
    4. z-स्टैक प्रारंभ और अंत गहराई, z-चरण रिक्ति और पिक्सेल घनत्व (3.3.1.1 में परिकलित.) निर्धारित करें और z-स्कैन करें । प्रत्येक चैनल अलग से सहेजें ।
      नोट: छवियां काफी छोटा होना चाहिए उदा 30 x 30 µm या 50 × 50 µm पोत आकार के आधार पर बाद में छवि विश्लेषण में वक्रता के किसी भी प्रभाव से बचने के लिए ।
  4. धमनी व्यास, दीवार मोटाई, और elastin और प्रोटोकॉल के शेष दबाव पर कोलेजन microarchitecture निर्धारित करते हैं ।
    1. दोहराएं 3.1-3.2 दबावों पर 10 और 20 mmHg, 3.3 दोहराने दाब पर 20 mmHg ।
    2. दोहराने 3.1 और 3.2 दबाव में 40 mmHg ।
    3. दोहराएं 3.1-3.2 दबाव पर 60, 80, और 100 mmHg और दोहराने 3.3 पर 100 mmHg ।
      नोट: 3.1-3.3 सभी दबावों के लिए दोहराया जा सकता है, और दबाव के संयोजन (जैसे एक श्रृंखला/वृद्धि के रूप में अच्छी तरह से दबाव कम करने के संयोजन), परिकल्पना पर निर्भर करता है परीक्षण किया जाना है । Eosin 0.3-1 µ m एकाग्रता में photobleaching के मामले में elastin autofluorescence को बढ़ाने के लिए जोड़ा जा सकता है । Photobleaching कम बिजली उत्तेजना प्रकाश के रूप में लागू करने से बचा जा सकता है ।
    4. प्रत्येक दबाव चरण के बाद ताजा 37 ° c एचबीएस के साथ myograph कक्ष में बफर बदलें । 5 मिनट के लिए दबाव में प्रत्येक परिवर्तन के बाद इमेजिंग से पहले के लिए अनुकूलन के लिए धमनी की अनुमति दें ।
  5. छवि विश्लेषण के लिए अलग से स्टोर चैनल स्टैक ।
  6. धमनी की परीक्षण व्यवहार्यता ।
    1. 10 µ m bradykinin के अलावा जब एक स्थिर कसना मनाया जाता है myograph चैंबर में १० µ मीटर U46619 लागू करें ।
    2. रिकॉर्ड व्यास और दीवार मोटाई के रूप में खंड 3.1 में ऊपर वर्णित यौगिकों में से प्रत्येक के आवेदन के बाद ।
    3. 3 µ एम सोडियम nitroprusside जोड़ें जब धमनी bradykinin और रिकार्ड व्यास और दीवार मोटाई के अलावा के बाद पूरी तरह से फैली हुई नहीं है ।
      नोट: ब्याज की धमनी (संवहनी बिस्तर और प्रजातियों) के औषधीय गुणों के आधार पर अंय vasoconstrictor और (endothelium-निर्भर) vasodilator यौगिकों का इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  7. वैकल्पिक: दबाव धमनी ठीक या मात्रा घनत्व (7 कदम) के लिए कोलेजन और elastin की इमेजिंग के साथ जारी है ।
    1. 1 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1x फास्फेट में बफर खारा (पंजाब) में 4% formaldehyde जोड़ें ।
    2. 1x पंजाब में तय धमनी तीन बार धो और धीरे cannulae बंद धमनी स्लाइड, समुद्री मील के बाहर धमनी के केवल भागों को छूने । नॉट निकालें, जब एक भंडारण ट्यूब करने के लिए स्थानांतरित धमनी पकड़ के लिए उन्हें इस्तेमाल करते हैं ।
    3. elastin और कोलेजन वॉल्यूम घनत्व या अन्य प्रयोजनों के लिए इमेजिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पंजाब में 0.05% सोडियम azide में स्टोर ।
      नोट: फिक्स्ड धमनियों 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पंजाबस/0.05% सोडियम azide में कम से कम 3 महीने के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।

4. दबाव तनाव संबंधों और आंतरिक दीवार कठोरता की गणना

  1. Bloksgaard, एम. एट अल द्वारा बताए गए अनुसार तनाव, उपभेदों, और दीवार की जकड़न की गणना के लिए फार्मूले और गणना चरणों का पालन करें । 13 और सन्दर्भ स्पेसिफिकेशंस ।

5. छवि विश्लेषण-(आंतरिक लोचदार लेमिना) IEL बंटी कोण

  1. फिजी में खुली छवि स्टैक । फ़ाइल पर जाएं । छवि स्टैक चुनने के लिए छवि खोलें
    नोट: IEL (1-2 µm मोटाई) को कवर 2-7 लगातार z-वर्गों के अधिकतम तीव्रता अनुमानों फिजी28,35में कोण उपकरण का उपयोग कर IEL elastin फाइबर शाखाओं में बंटी कोण का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया जाता है । उदाहरण के लिए चित्र 4a को देखें ।
  2. छवि । स्टैक्स | z परियोजना के लिए छवियों और "अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण" का चयन करने के लिए जाओ ।
  3. झगड़ा के रूप में अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण बचाओ ।
  4. के रूप में कई IEL "कोण उपकरण" का उपयोग संभव के रूप में अंक बंटी फाइबर चुनें, और छवियों के माध्यम से व्यवस्थित ढंग से काम करते हैं । प्रत्येक कोण को मापने के लिए ctrl + M क्लिक करें ।
  5. फिजी परिणाम पत्रक सहेजें ।

6. छवि विश्लेषण-Adventitial कोलेजन Waviness

  1. फिजी में खुली छवि स्टैक । फ़ाइल | छवि स्टैक चुनने के लिए छवि खोलें ।
    नोट: 2-7 के अधिकतम तीव्रता अनुमानों लगातार जेड-बाहरी लोचदार लेमिना (मछली, 1-4 µm मोटाई) के बाहर कोलेजन सही वर्गों को कवर करने के लिए उपयोग कोलेजन waviness का उपयोग कर रहे है फिजी NeuronJ प्लगइन का प्रयोग कर36 के रूप में Rezakhaniha, आर द्वारा वर्णित . एट अल. 37 (चित्रा 4B).
  2. स्केल सेट करें । पर जाएं विश्लेषण । पिक्सेल आयाम दर्ज करने के लिए स्केल सेट करें ।
  3. छवि । स्टैक्स | जेड परियोजना के साथ काम करने के लिए छवियों का चयन करने के लिए और "अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण" के लिए जाओ ।
  4. छवि प्रकार को परिवर्तित करने के लिए 8 bitt tiff पर क्लिक करके छवि | प्रकार | 8 bitt और झगड़ा के रूप में अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण बचाने के लिए ।
  5. उपाय कोलेजन फाइबर सीधे फिजी ंयूरॉन जंमू प्लगइन का उपयोग ।
    1. फिजी क्लिक करके NeuronJ प्लगइन खोलें | प्लगइंस । न्यूरॉन जे.
    2. छवि लोड करें क्लिक करके NeuronJ में 8bit झगड़ा खोलें । फ़ाइल का चयन करें
    3. traces जोड़ेंक्लिक करें, और प्रत्येक फाइबर के प्रारंभ और अंत पर क्लिक करके विश्लेषण करने के लिए फाइबर चुनें ।
    4. ट्रेसिंग मापक्लिक करें, संवाद बॉक्स में प्रदर्शन ट्रेस िंग (वामो) और शीर्ष मापन चुनें ।
  6. excel में L0/वामो की गणना (या इसी तरह) और परिणामों को बचाने के ।
    1. कॉपी और पेस्ट फिजी ंयूरॉन जंमू अनुरेखण और वर्टेक्स उत्पादन के लिए excel (या समान) और L0 की गणना करने के लिए शीर्ष मापन से पाइथागोरस के प्रमेय का उपयोग कर । लाइन पर पहला और अंतिम बिंदु एक 2d समंवय प्रणाली में कर्ण के सिरों की स्थिति से संकेत मिलता है ।
      नोट: एक L0/वामो [कोलेजन फाइबर एक सीधी रेखा (L0) के माध्यम से अंत करने के लिए अंत लंबाई बंडल/पूर्ण लंबाई (वामो)] करीब 1 एक लगभग सीधे कोलेजन फाइबर इंगित करता है ।

7. कोलेजन और Elastin मात्रा घनत्व के लिए इमेजिंग

  1. पंजाब में (फिक्स्ड) धमनी 1x धो और अंधेरे में 1x पंजाब में 1 µ एम eosin में 15 मिनट के लिए यह दाग । फिक्स्ड धमनियों के लिए, कमरे के तापमान पर इस कदम का प्रदर्शन ।
    नोट: Eosin elastin प्रतिदीप्ति को बढ़ाता है । Eosin ऐसे कोलेजन और सेल कोशिका द्रव्य के रूप में अंय संरचनाओं दाग यदि नमूना विस्तारित समय के लिए धुंधला समाधान में छोड़ दिया है । यदि अन्य संरचनाओं के दाग भी तीव्र है, eosin की एकाग्रता कम करने के लिए 0.3 µ m या दोहराने धोने.
  2. 1x पंजाब में 3x धो लें
    1. फिक्स्ड धमनियों के लिए: इमेजिंग के लिए धमनी माउंट ।
      चेतावनी: गैर-दबाव वाहिकाओं के इमेजिंग किसी भी ज्यामितीय मात्रात्मक जानकारी की पुनर्प्राप्ति की अनुमति नहीं है । जब निरपेक्ष मात्रा की आवश्यकता होती है, ये हमेशा रहते हैं, दबाव धमनियों पर प्राप्त किया जाना चाहिए । मात्रा अनुपात इस पद्धति के साथ गैर दबाव धमनियों पर प्राप्त किया जा सकता है ।
      1. एक वस्तु गिलास के अलावा डबल चिपकने वाला टेप 1-1.5 सेमी के दो टुकड़े प्लेस । डबल चिपकने वाला टेप लगभग 100 µm मोटी है । घुड़सवार होने के लिए धमनी के व्यास से मिलाने के लिए टेप की एक या अधिक परतें लागू करें ।
      2. चौक के बीच में कांच पर पंजाबियों की 10-20 µ एल प्लेस और पंजाब छोड़ में धमनी जगह है ।
        नोट: ड्रॉप जब कवर स्लिप बढ़ते स्थिति से बाहर धमनी धक्का से बचने के लिए संभव के रूप में छोटे और फ्लैट के रूप में होना चाहिए.
      3. डबल चिपकने वाला टेप पर coverslip और प्रेस प्लेस ।
      4. 1x पंजाबियों के साथ coverslip और वस्तु कांच के बीच जलाशय भरें । यह हर घंटे के लिए नमूने के सूखने से बचने के लिए फिर से भरना ।
  3. छवि के लिए ढेर प्राप्त कोलेजन और elastin मात्रा के साथ एक 20X उद्देश्य का उपयोग कर घनत्व > 1 के रूप में संभव के रूप में धमनी की दीवार के रूप में ज्यादा कवर जबकि अभी भी एक अच्छा ऑप्टिकल संकल्प (चित्रा 2d, 2g और 2H) ।
    नोट: एक coverslip के तहत फिक्स्ड धमनियों की इमेजिंग के लिए एक जल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करें, और महत्वपूर्ण धमनियों की इमेजिंग के लिए एक पानी सूई उद्देश्य का उपयोग करें । उद्देश्य एक सुधार कॉलर कवर स्लिप मोटाई के लिए सही करने के लिए नहीं है, तो उद्देश्य के लिए coverslip से मेल करने के लिए सुनिश्चित करें । अधिमानतः इष्टतम पिक्सेल आकार और जेड रिक्ति का उपयोग करें । Nyquist कैलकुलेटर (step 3.3.1.1.) का उपयोग कर इन की गणना करें । वैकल्पिक रूप से, 300 एनएम के ंयूनतम पिक्सेल आकार और 1 µm की z-रिक्ति का उपयोग करें । यह धमनी की लंबाई के साथ तीन छवियों को प्राप्त करने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति के लिए अंतर परख परिवर्तनशीलता निर्धारित करने की सिफारिश की है ।
  4. छवि 820 एनएम उत्तेजना प्रकाश का उपयोग कर elastin और एक 30-60 एनएम चौड़ा bandpass 520 एनएम पर केंद्रित फिल्टर का उपयोग उत्सर्जन इकट्ठा ।
  5. छवि कोलेजन 990 एनएम उत्तेजना प्रकाश का उपयोग करने के लिए elastin और अंय के किसी भी उत्तेजना प्रोटीन से बचने और 10-30 एनएम चौड़ा bandpass 495 एनएम पर केंद्रित फिल्टर का उपयोग कर उत्सर्जन इकट्ठा ।
  6. प्रत्येक चैनल से छवि स्टैक को अलग से TIFF फ़ाइलों के रूप में सहेजें

8. Elastin और कोलेजन वॉल्यूम घनत्व Ilastik का उपयोग कर निकालने के लिए छवि विश्लेषण

  1. परिवर्तित TIFF छवि स्टैक्स का उपयोग कर HDF5 फिजी28,35 पर क्लिक करके फ़ाइल चुनें । इस रूप में सहेजें.. । HDF5
  2. कंप्यूटर हार्ड ड्राइव पर दो डेटा फ़ाइल फ़ोल्डर बनाएं, elastin के लिए एक, कोलेजन छवि ढेर के लिए एक, क्रमशः । प्रासंगिक फ़ोल्डर में प्रासंगिक छवि स्टैक की प्रतिलिपि बनाएं ।
  3. Ilastik सॉफ्टवेयर, elastin में से एक, कोलेजन के लिए एक, क्रमशः में दो नए Ilastik परियोजनाओं बनाएं ।
    1. ओपन Ilastik | नई परियोजना बनाएं । पिक्सेल वर्गीकरण । नई परियोजना । डेटा जोड़ें और चरण 8.2 में बनाए गए छवि फ़ोल्डर का चयन करें ।
      नोट: Ilastik विज़ार्ड का पालन करें ।
  4. सॉफ्टवेयर को प्रशिक्षित करने के लिए एक 3 डी छवि स्टैक आयात करें ।
    1. इनपुट डेटा एप्लेट का चयन करें । मुख्य कार्यस्थान क्षेत्र । रॉ डेटा टैब । नया जोड़ें... । अलग छवि (ओं) जोड़ें और वांछित छवि डेटा का चयन
  5. सॉफ्टवेयर में प्रासंगिक सुविधाओं का चयन करें ।
    1. सुविधा चयन एप्लेट खोलें । सुविधा का चयन करें जो एक नया संवाद खोलता है । विवरण के लिए चित्र 5 ए देखें ।
  6. प्रशिक्षण एप्लेट के अंतर्गत लेबल जोड़ें बटन का उपयोग करके कम से कम दो लेबल जोड़ें ।
    नोट: प्रत्येक लेबल किसी ऑब्जेक्ट प्रकार से संबंधित होगा जिसे पृथक करने की आवश्यकता है । इस काम में, तीन लेबल elastin के लिए उपयोग किया जाता है: elastin ही, चमकीले धब्बे (बाहर रखा जा करने के लिए), और पृष्ठभूमि (बाहर रखा जा करने के लिए).
  7. पेंट ब्रश स्टाइल एनोटेशन उपकरण का उपयोग कर raw छवि स्टैक के शीर्ष पर लेबल्स आरेखित करना ।
    1. उपयुक्त लेबल का चयन करें: ब्रश उपकरण क्लिक करें और आरेखण प्रारंभ ।
  8. छवि स्टैक का विश्लेषण करने और लाइव अद्यतन सक्षम करेंक्लिक करके समान सुविधाएं देखने के लिए प्रॉंप्ट Ilastik ।
  9. पूर्वानुमान मानचित्र (चित्र 5d) को सावधानीपूर्वक जांचें ।
    नोट: raw छवि से एक पूर्ण पूर्वानुमान मैप करने के लिए प्रक्रिया चित्रा 5में दिखाया गया है । Ilastik के अनुसार छवि स्टैक को सेगमेंट करने के लिए पूर्वानुमान मैप का उपयोग करता है जिसके लिए लेबल पिक्सेल संबद्ध होने की अधिक संभावना होती है (चित्र 5d) ।
  10. थ्रेशोल्ड लागू करें ।
    1. थ्रेशोल्ड एप्लेटका चयन करें, कोई उपयुक्त विधि, इनपुट लेबल, स्मूथ, थ्रेशोल्ड और आकार फ़िल्टर पैरामीटर्स चुनें, और अंतत: लागू करें क्लिक करे ।
      नोट: यह असतत वस्तुओं में इसी तरह की छवि के लेबल भागों अलग । elastin और कोलेजन की तरह अत्यधिक जुड़े ऊतक, अलग होने की जरूरत नहीं है, इसलिए, 0.4 की दहलीज (डिफ़ॉल्ट 0.5 है) लागू किया जाता है । चित्र 5E और 5F थ्रेशोल्ड लागू करने के परिणाम को वर्णन करें ।
  11. दोहराने Ilastik के प्रशिक्षण जब तक परिणाम संतोषजनक है (केवल elastin, क्रमशः कोलेजन संबंधित विश्लेषण के लिए मांयता प्राप्त है) ।
    1. अक्सर इस प्रक्रिया के दौरान प्रशिक्षण और विभाजन (और कभी-कभार भी थ्रेशोल्ड) एप्लेट्स के बीच स्विच करें । पुनः प्रशिक्षण Ilastik के प्रभाव का एक उदाहरण चित्रा 6में दिखाया गया है ।
  12. बैच समान छवि डेटा का विश्लेषण: बैच पूर्वानुमान इनपुट चयन का चयन करें और प्रासंगिक फ़ाइलें जोड़ें ।
    नोट: Ilastik उत्पादन छद्म 1bit 3 डी छवि के ढेर (छवि मास्क) के साथ 0 (शूंय) elastin (या कोलेजन) और 1 (एक) की उपस्थिति को ध्यान में रखने के अभाव टिप्पण करण (वास्तविक बिट गहराई है 8 बिट) का एक संग्रह है ।
  13. नेत्रहीन छवि मास्क और raw छवि फ़ाइलों की तुलना करके प्रत्येक छवि स्टैक के लिए परिणाम सत्यापित करें ।
  14. ऑप्टिमाइज़ करें Ilastik मास्क (चरण 8.4-8.9) और पुनः विश्लेषण किसी भी छवि के ढेर असंतोषजनक परिणामों के साथ ।
  15. MATLAB का उपयोग Ilastik छवि मास्क से elastin और कोलेजन मात्रा घनत्व की गणना
    1. MATLABखोलें ।
    2. MATLAB "वर्तमान फ़ोल्डर" विंडो में ilastik छवि मास्क के साथ फ़ोल्डर का चयन करें ।
    3. MATLAB स्क्रिप्ट को अनुपूरक फ़ाइल 1 से MATLAB संपादक में कॉपी करें और कंप्यूटर हार्ड ड्राइव पर MATLAB फ़ोल्डर में volumeCalculator. m के रूप में कोड सहेजें.
    4. स्क्रिप्ट लाइंस में पिक्सेल आकार और पिक्सेल ऊंचाई दर्ज करें
      pixelSize = 0.1230000 * 0.1230000; % माइक्रोन * माइक्रोन
      pixelHeight = 0.9; % माइक्रोन
    5. स्क्रिप्ट सहेजें ।
    6. MATLAB आदेश विंडो पर जाएं और स्क्रिप्ट लोड करने के लिए "volumeCalculator (' पथ-से-डेटा ')" दर्ज करें ।
    7. enter क्लिक करें । प्रत्येक छवि मुखौटा अब अभिव्यक्त किया है और (ज्ञात) पिक्सेल/voxel मात्रा (z-अक्ष संकल्प द्वारा गुणा एक पिक्सेल के भौतिक आयाम) से गुणा । MATLAB से उत्पादन प्रत्येक छवि ढेर में elastin और कोलेजन की कुल मात्रा है ।
  16. परिणामों को सहेजें ।

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Representative Results

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इस कार्य में प्रयुक्त इमेजिंग के लिए कस्टम-बिल्ट प्रेशर myograph आरेख 1में दिखाया गया है । myograph के डिजाइन के लिए विशेष ध्यान i के लिए भुगतान किया गया था) एक छोटी सी मात्रा के साथ चैंबर (2 एमएल) और द्वितीय) cannulae के करीब स्थिति के लिए संभावना है, और कांच के नीचे के साथ समानांतर (आंकड़ा 1b) । चैंबर के नीचे एक 50 × 24 मिमी #1 .5 ग्लास coverslip (बदली) फिट बैठता है । दबाव नियंत्रक एक मानक 1 एल कांच की बोतल और एक रक्तदाबमापी (हटाया कफ) से बनाया गया था । प्रवाह आवश्यकताओं के साथ एक myograph सेटअप के लिए, एक इमदादी दबाव नियंत्रक का उपयोग अनुशंसित है ।

चित्र 2 प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रयोग के दौरान एकल छवियां और छवि स्टैक प्राप्त करने के लिए अनुशंसित स्थितियां दिखाता है । चित्रण प्रयोजनों के लिए, घुड़सवार धमनी की एक संचरण प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवि चित्रा 2aमें शामिल है । गाँठ-गाँठ की घुड़सवारी की लम्बाई लगभग १.६ मि. ग्रा. धमनी व्यापक व्यास (चित्रा 2 बी) मनाया जाता है जब तक स्कैन किया जाता है, और इस बिंदु पर, व्यास और दीवार मोटाई निर्धारित कर रहे हैं (चित्रा 2c). इसी तरह, धमनी के एक संचरण प्रकाश छवि चित्रा 2dमें शामिल है, स्थिति और कोलेजन का microarchitectures (चित्रा 2E) और elastin (चित्रा 2F, छोटे निर्धारित करने के लिए छवि ढेर की सिफारिश की चौड़ाई दिखा रहा है चित्रा 2dमें स्क्वायर) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कोलेजन (चित्रा 2g) और elastin (चित्रा 2H) मात्रा घनत्व (बड़ा वर्ग, चित्र 2d) का निर्धारण करने के लिए छवि ढेर । इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, दबाव व्यास curves के निर्माण के लिए डेटा, इसके बाद इसी तनाव की गणना-दबाव घटता दाब, व्यास और दीवार मोटाई माप (चित्रा 2c) से प्राप्त किया जा सकता है ।

Bloksgaard एट अलके अनुसार तनाव के दबाव संबंध के एक एकल घातीय फिट । 13 और संदर्भ के साथ साथ, β-मूल्य, वृद्धिशील लोचदार मापांक के लिए आनुपातिक दीवार कठोरता के एक ज्यामिति स्वतंत्र उपाय प्रदान करता है, ईइंक। विभिंन दबावों पर जो कोलेजन और elastin microarchitectures के लिए छवियों को प्राप्त कर रहे थे ईइंक की गणना, कोलेजन और elastin के microarchitectures में दबाव प्रेरित परिवर्तन के बीच संबंधों का सीधा विश्लेषण की अनुमति देता है और विभिन्न दबावों पर वृद्धिशील लोचदार मापांक (चित्र 3) । IEL शाखाओं में बंटी कोण और कोलेजन सीधे का माप चित्रा 4में सचित्र है ।

यांत्रिक डेटा की व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण ब्याज की दो या अधिक समूहों की तुलना, ग्रस्त बनाम normotensive रोगियों के उदा , elastin और कोलेजन की सामग्री का दृढ़ संकल्प है । इसके लिए, Ilastik में एक स्वचालित विश्लेषण विधि, एक फ्रीवेयर छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर है कि कुछ छवि सुविधाओं को पहचानने के लिए प्रशिक्षित किया जा सकता है, विकसित किया गया था । Ilastik में कार्य-प्रवाह चित्रा 5में सचित्र है ।

elastin और कोलेजन की मात्रा घनत्व के लिए स्वत: पता लगाने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि वहां एक अच्छा संकेत प्राप्त छवियों में शोर अनुपात है । मानव नमूनों में, कोलेजन से महत्वपूर्ण autofluorescence अक्सर कोलेजन स्वसहायता संकेत के अलावा में मनाया जाता है । यह elastin का पता लगाने के लिए सिग्नल-टू-शोर अनुपात घटाता है । चित्रा 6 दिखाता है कैसे पुनः Ilastik कार्यक्रम के प्रशिक्षण "ग्रीन"/elastin चैनल में महत्वपूर्ण कोलेजन autofluorescence के साथ एक नमूने में पतली elastin फाइबर की बेहतर मांयता में परिणाम कर सकते हैं । यदि खून-कोलेजन स्वसहायता चैनल में autofluorescence संकेत के माध्यम से एक समस्या है, स्वसहायता समूहों का उपयोग कर संकेत प्राप्त एक लंबा उत्तेजना तरंग दैर्ध्य मदद कर सकते हैं । अगर चैनल खून के माध्यम से eosin के साथ धुंधला के बाद होता है, eosin के लागू समाधान की एकाग्रता कम किया जाना चाहिए । Eosin आसानी से धोया बाहर है, तो दाग नमूने के दोहराया धोने भी संकेत कम हो सकता है ।

Figure 1
चित्र 1 . कस्टम निर्मित प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए दबाव myograph । (क) micromanipulators से जुड़ी काँच की केशिकाओं के साथ छिड़काव चेम्बर, जो एक बल transducer (अनुदैर्ध्य बल) पर चढ़कर जाता है. (ख) 2 मिलीलीटर इमेजिंग चैंबर । cannulae के 45 ° झुकने एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग इमेजिंग की सुविधा. (ग) दाब नियंत्रक । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . संयुक्त दबाव myography और प्रतिदीप्ति इमेजिंग रणनीति । (क) के चित्रण के साथ धमनी की संचरण प्रकाश छवि (ख) धमनी की पूर्ण चौड़ाई का स्कैन. कोलेजन स्वसहायता समूहों हरे रंग में दिखाया गया है, और रानी में elastin autofluorescence । (C). धमनी लुमेन व्यास (यहां 238 µm) और दीवार की मोटाई (यहां 17 और 18 µm ऊपर और नीचे क्रमशः) इक्वेटोरियल क्षेत्र (सबसे बड़ा व्यास मनाया) में निर्धारित होता है धमनी । (घ) जेड की स्थिति के चित्रण के साथ धमनी के संचरण प्रकाश छवि-(ई) कोलेजन सीधे निर्धारित करने के लिए एक 10-50 µm पैमाने पर प्राप्त ढेर, (च) आंतरिक लोचदार laminae के शाखाकरण कोण, और (छ) z-पोट एक कैलरी µm पर प्राप्त प्राप्त करने के लिए स्केल कोलेजन और (ज) elastin मात्रा घनत्व । छवियां B/C: ऊंचाई 300 µm (बार 20 µm), E/F: 50 x 50 µm (बार 10 µm), G/H 130 × 130 × 30 µm (बार = 30 µm) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . adventitial कोलेजन और आंतरिक लोचदार लेमिना (IEL) और उनके संबंध में Microstructural परिवर्तन circumferential वृद्धिशील लोचदार moduli पर 20, 40 और 100 mmHg । (क) IEL में elastin तंतुओं के कोण बंटी. (ख) adventitial कोलेजन फाइबर की सीधे बाहरी लोचदार लेमिना के करीब । p-मान और F-मान दोहराए गए माप का उपयोग करके निर्धारित किए गए थे एक-तरफ़ा ANOVA: p/F-values A: 0.0014/24.18, B: 0.0002/37.38 । (ग) IEL शाखाओं को ईइंकके साथ रेखीय रूप से संबद्ध कर रहा है । (घ) कोलेजन सीधे ईइंकके साथ रैखिक को संबद्ध । डेटा मतलब ± एसई के रूप में दिखाया जाता है । Microstructural परिवर्तन (ए और बी, और सी और डी के एक्स अक्षों) महत्वपूर्ण इमेजिंग के अधीन 6 प्रतिरोध धमनियों के लिए निर्धारित किया गया था, जबकि ईइंक (सी और डी) 20 अंय एक मानक में दबाव myography के अधीन धमनियों के लिए गणना की गई थी दाब myograph. प्रत्येक धमनी का अध्ययन एक अलग व्यक्ति से किया गया था । यह आंकड़ा Bloksgaard एट अलसे संशोधित किया गया है । 13. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4 . IEL शाखाओं की माप का चित्रण और फिजी में कोलेजन सीधे । (क) IEL शाखाओं में बंटी कोण मैन्युअल रूप से चिह्नित और फिजी कोण उपकरण का उपयोग कर मापा जाता है. (ख) कोलेजन सीधे की समाप्ति के अनुपात के रूप में फिजी ंयूरॉन जंमू प्लगइन का उपयोग कर निर्धारित किया जाता है एक सीधी रेखा से (सफेद) के माध्यम से एक एकल कोलेजन फाइबर की लंबाई अंत फाइबर (नारंगी) की वास्तविक अंत करने के लिए अंत लंबाई से विभाजित । बार का आकार: 20 µm ।

Figure 5
चित्र 5 . Ilastik कार्यप्रवाह । (एक) चयनित सुविधाओं के संकेत के साथ सुविधा चयन विंडो. (ख) के साथ उदाहरण रॉ छवि (ग) elastin फाइबर के लिए लेबल, चमकीले धब्बे (अवांछित) और पृष्ठभूमि में प्रकाश डाला लाल, हरे और नीले, क्रमशः । (घ) छवि के लिए परिणामी भविष्यवाणी नक्शा (ख) में संकेत लेबल के साथ (C) । (ङ) (घ) से पहले (ङ) और उसके बाद (च) 0.5 की सीमा लागू करने में पूर्वानुमान नक्शे के आधार पर विभाजन. पीला रंग जुड़ा अलग सुविधा (elastin) के लिए इसी पिक्सेल से पता चलता है । बार का आकार: 25 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6 . उदाहरण छवियों से पहले और Ilastik भविष्यवाणी पुनः के प्रभाव को दिखाने के नक्शे के अनुकूलन के बाद उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के साथ एक नमूना में elastin फाइबर की पहचान के लिए Ilastik कोलेजन से (उप इष्टतम शोर अनुपात करने के लिए संकेत). (क) मूल छवि, (ख) पहली Ilastik विश्लेषण का परिणाम है, जहां विशेष रूप से पतली elastin फाइबर (छवि बी के बाईं ओर) विभाजन में शामिल नहीं हैं और (ग) पूर्वानुमान नक्शे के अनुकूलन के बाद अंतिम परिणाम. बार का आकार: 25 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

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यह काम एक मानकीकृत, संयुक्त इमेजिंग और दबाव myography दृष्टिकोण के लिए हमारे सुझाव का प्रतिनिधित्व करता है, प्रतिरोध धमनियों और धमनी की संरचना में दबाव से संबंधित परिवर्तन के यांत्रिक गुणों का एक साथ मूल्यांकन के लिए मूल्यवान एक दबाव सीमा से अधिक 0 से 100 mmHg दीवार । प्रस्तुत दृष्टिकोण कस्टम निर्मित उपकरण का उपयोग कर विकसित किया गया था, तथापि, किसी भी दबाव myograph कि एक दो फोटॉन उत्तेजना प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर फिट बैठता है, इस्तेमाल किया जा सकता है जब दोनों उपकरणों के डिजाइन धमनी की दीवार के इमेजिंग की अनुमति देता है । विशेष ध्यान उद्देश्य के आकार, चौड़ाई और काम की दूरी के लिए भुगतान किया जाना चाहिए, और शर्तों जिसके तहत इमेजिंग प्रदर्शन किया जाएगा । ईमानदार सूक्ष्मदर्शी पानी की सूई उद्देश्यों के उपयोग की आवश्यकता होती है, जबकि पानी विसर्जन उद्देश्यों के उपयोग के नमूने और उद्देश्य के बीच अपवर्तन सूचकांकों में अंतर से बचने के लिए औंधा सूक्ष्मदर्शी के लिए सिफारिश की है । इसके अलावा, ध्यान coverslip मोटाई के लिए भुगतान किया जाना चाहिए, या तो उद्देश्य और coverslip उद्देश्य पर सुधार कॉलर का उपयोग कर के बीच एक बेमेल के लिए एक सुधार लागू करने के द्वारा (यदि वर्तमान) या उद्देश्य के साथ coverslip मोटाई मिलान के द्वारा इस्तेमाल किया.

वर्णित प्रोटोकॉल में, लाभ कम ऊर्जा का लिया है, इमेजिंग elastin autofluorescence और कोलेजन स्वसहायता के लिए निकट अवरक्त प्रकाश । यह समय की विस्तारित अवधि के लिए इमेजिंग की अनुमति देता है । मानव प्रतिरोध धमनियों में इस अध्ययन में प्रयोग किया जाता है, IEL एक longitudinally संरेखित फाइबर के शामिल है, परस्पर elastin फाइबर के नेटवर्क की तरह13,33, मानव चमड़े के नीचे प्रतिरोध के IEL की संरचना के समान धमनियों (hSCA)38,39. IEL में elastin फाइबर के कोण शाखाओं में परिवर्तन का मूल्यांकन किया गया और एक साथ adventitial कोलेजन फाइबर के क्रमिक uncoiling के उपायों के साथ प्रयोग किया जाता है बढ़ाने के लिए37 दबाव के microarchitecture में परिवर्तन का आकलन करने के लिए और elastin कोलेजन क्रमशः । elastin और कोलेजन microarchitectures का आकलन करने के लिए छवियों को अलग दबाव में धमनी की दीवार के भीतर ब्याज की एक ही क्षेत्र में प्राप्त किया गया । यह दोहराया-माप विश्लेषण की अनुमति देता है । जब संभव हो, अंवेषक एक आयाम में छवि आकार 10-50 µm के साथ, ब्याज की कम से कम 3 क्षेत्रों में छवियों को प्राप्त करने में लक्ष्य सकता है । हालांकि, नमूना पर निर्भर करता है, विशेष रूप से धमनी की दीवार की मोटाई, एक समझौता करने के लिए ब्याज की स्कैन क्षेत्रों की संख्या और प्रयोग की संभव अवधि के बीच किया जाना है । मानव pericardial प्रतिरोध धमनियों के मामले में, धमनियों प्रयोग के कम से 8-12 ज के लिए जीवित रहे । ब्याज के कई क्षेत्रों स्कैनिंग अंतर बनाम इंटर-नमूना परिवर्तनशीलता के मूल्यांकन की अनुमति देता है और इस प्रकार प्राप्त निष्कर्षों पर निष्कर्ष का समर्थन करता है ।

यह सूचना है कि phototoxic क्षति उत्प्रेरण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, इमेजिंग उच्च शक्ति उत्तेजना प्रकाश का उपयोग कर जब जीवित ऊतक नमूनों पर काम करने से बचा जाना चाहिए । इस के प्रकाश में, यह प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के अंत में कोलेजन और elastin मात्रा घनत्व के लिए बड़ी छवि ढेर प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है, वैकल्पिक रूप से तय नमूनों पर । जब ECM घटकों की निरपेक्ष मात्रा की आवश्यकता होती है, तो मात्रा घनत्व पर निर्धारण का कोई भी प्रभाव quantified और खाते में लिया जाना चाहिए । निर्धारण और धमनियों के permeabilization इसके अलावा ब्याज की intracellular लक्ष्य के धुंधला जब आवश्यक अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल में, elastin के लिए दाग लाइव धमनी पर eosin का उपयोग किया जाता है । विशिष्ट जांच द्वारा elastin के दाग (जैसे, alexa 633 हयद्रज़ीदे40) और कोलेजन (जैसे, CNA3541), अंय दाग (जैसे, phalloidin42) या डीएनए के साथ एक साथ लागू किया जा सकता है, के लिए आकलन की सुविधा धमनी की दीवार में ब्याज की अंय संरचनाओं के volumetric घनत्व और संरचनात्मक संगठन के । यह अवसर एकल-फोटॉन फोकल सूक्ष्मदर्शी के साथ अनुसंधान प्रयोगशालाओं को प्रतिरोध धमनियों में microstructural परिवर्तनों की जांच करने का अवसर प्रदान कर सकता है । एक ही धमनी से खंडों अलग शर्तों के तहत इलाज किया जा सकता है, दबाव के तहत तय की और बाद के चरण में imaged लागू उपचार के प्रभाव की तुलना । ब्याज के लक्ष्य इमेजिंग द्वारा पुन: cannulated, फिर से दबाव और सना हुआ जहाजों visualized किया जाना चाहिए । फिर से cannulation और पुनः प्रणा आवश्यक है जब संरचनात्मक परिवर्तन पर विचार कर रहे हैं, के रूप में elastin तय नहीं किया जा सकता है और इसलिए हटना और तय धमनी43के 3d संरचना में परिवर्तन होगा,44। फिक्स्ड धमनियों में संरचनात्मक परिवर्तन का निर्धारण करने की खामी यह है कि कई खंडों की तुलना के लिए तय किया जाना है, और दोहराया-माप विश्लेषण नहीं किया जा सकता है ।

डेटा इमेजिंग का उपयोग करने के लिए सीधे दीवार तनाव और उपभेदों की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और संवहनी दीवार के यांत्रिकी समझ का समर्थन, के रूप में Bloksgaard में वर्णित, एम एट अल13। इस काम में, एक गणितीय मॉडल को elastin और धमनी की दीवार के कोलेजन घटकों की आंतरिक कठोरता विशेषताएं और कोलेजन भर्ती उपभेदों45,गणना के आधार पर46 का अनुमान लगाने के लिए लागू किया गया था तनाव से रिश्तों पर दबाव । इमेजिंग गणितीय मॉडलिंग से निष्कर्षों का समर्थन किया, कि मानव प्रतिरोध धमनियों में कोलेजन पहले से ही कम circumferential तनाव और दीवार तनाव में भर्ती कराया गया था । इस प्रोटोकॉल में वर्णित elastin और कोलेजन के microarchitecture के मात्रात्मक उपायों को आगे बढ़ाया जा सकता है, मन्या धमनियों6,8,47पर किए गए व्यापक कार्य से प्रेरित, 48 , 49 और महाधमनी7,9,10,50,51: अतिरिक्त विश्लेषणों में शामिल हो सकते है स्थानिक वितरण और कोलेजन के microarchitecture का आकलन और धमनी की दीवार के रूप में अच्छी तरह से फाइबर अभिविन्यास कोण के विभिन्न परतों के भीतर elastin फाइबर (अनुदैर्ध्य अक्ष के संबंध में अभिविन्यास). बेल एट अल. 15 एक बहु परत विश्लेषणात्मक मॉडल सहित IEL और adventitial कोलेजन का दबाव प्रेरित पुनर्गठन को संबोधित किया धमनी की दीवार के प्रत्येक परत में कठोरता और तनाव की गणना । इन लेखकों15 मानव चमड़े के नीचे प्रतिरोध स्वस्थ स्वयंसेवकों से प्राप्त की धमनियों का इस्तेमाल किया, और संबंधित संरचना और दीवार पर तनाव 3 और 30 mmHg, क्रमशः ।

इस प्रोटोकॉल में प्रस्तावित विधि उंमीद है कि आगे की जांच और स्वास्थ्य और रोग में मानव प्रतिरोध धमनियों के यांत्रिक गुणों को समझने के लिए microstructurally प्रेरित गणितीय मॉडलों के विकास को प्रेरित करती है । विधि के आगे संशोधन के साथ भी कोलेजन और elastin अनुदैर्ध्य धुरी के साथ अभिविन्यास कोण, चिकनी मांसपेशी कोशिका मात्रा घनत्व, धमनी की दीवार के भीतर स्थानिक वितरण और अभिविन्यास शामिल करने के लिए, कोलेजन और elastin वितरण और tunica मीडिया में अभिविन्यास, और elastin संगठन और tunica adventitia में वितरण, इमेजिंग डेटा गणितीय मॉडल के आगे विकास फ़ीड कर सकते हैं, उच्च रक्तचाप, मधुमेह और में रिमॉडलिंग प्रक्रिया की समझ को सुविधाजनक बनाने चयापचय सिंड्रोम । इसी तरह, के रूप में कोरोनरी microcirculation के लिए चेन और Kassab द्वारा सुझाए गए52,53, मानव प्रतिरोध धमनियों के microstructure आधारित मॉडल मैक्रो पर धमनी यांत्रिक प्रतिक्रियाओं के पूर्वानुमान प्रदान कर सकते हैं-(पूरी धमनी) और सूक्ष्म (संरचना) प्रत्येक घटक के लिए यांत्रिक स्तर । इस तरह के मॉडल संरचनात्मक मापदंडों और दोनों स्वस्थ स्वयंसेवकों और विभिन्न रोगों से पीड़ित रोगियों से उत्पन्न धमनियों की धमनी की दीवार में व्यक्तिगत परतों और घटकों के यांत्रिक गुणों के मात्रात्मक डेटा पर आधारित होना चाहिए, विभिन्न औषधीय उपचार प्राप्त. डेटा एक मानकीकृत तरीके से एकत्र कर रहे है और विभिंन जोखिम कारक, रोग और उपचार प्रोफाइल के साथ व्यक्तियों के पार की तुलना में । विधि कैसे रोग और चिकित्सा उपचार मानव microcirculation को प्रभावित समझ सहायता की क्षमता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक प्राकृतिक विज्ञान, दक्षिणी डेनमार्क के विश्वविद्यालय के संकाय में डेनमार्क आणविक जैव चिकित्सा इमेजिंग केंद्र, प्रयोगशालाओं और माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए धंयवाद । Kristoffer Rosenstand और उल्ला Melchior दबाव myography और इमेजिंग के साथ उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार कर रहे हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine Science Tools 15401-12
Fine Science Tools 11251-23
Nikon SMZ800N
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. 761028 for dissection purpose
Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark 1.63, 2.13, 210mm
Smiths medical Intl, UK
Ethicon Ethilon 11-0
Custom built DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt
Mettler toledo
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. B3259
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. A7030
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. C5670
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. G7021
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. E3889
Merck Millipore, Hellerup, Denmark 1.00496.9010 Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution 
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. H3784
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. P9666
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. P5655
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. M2643
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S2002
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S5886
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S5761
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. 1.06462
Gibco, ThermoFisher Scientific 10010015
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. PHR1423
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. Z370525
 Tocris Bioscience, Bristol, UK 538944
Nikon Custom built
Spectra Physics, Mountain View, CA
Nikon CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27
Nikon CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75
Hamamatsu, Ballerup, Denmark H7422P-40
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). ChromaET 460 nm long pass dichroic
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). Chroma ET402/15X 
Scotch TM
coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip

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का आकलन कोलेजन और Elastin दबाव पर निर्भर Microarchitectures रहते हैं, मानव प्रतिरोध धमनियों में लेबल से मुक्त प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
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Bloksgaard, M., Thorsted, B., Brewer, J. R., De Mey, J. G. R. Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (134), e57451, doi:10.3791/57451 (2018).More

Bloksgaard, M., Thorsted, B., Brewer, J. R., De Mey, J. G. R. Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (134), e57451, doi:10.3791/57451 (2018).

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