का आकलन कोलेजन और Elastin दबाव पर निर्भर Microarchitectures रहते हैं, मानव प्रतिरोध धमनियों में लेबल से मुक्त प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
Summary
हम एक साथ यांत्रिक परीक्षण और 3 डी-अलग, जीना मानव प्रतिरोध धमनियों की धमनी की दीवार के इमेजिंग, और फिजी और Ilastik छवि विश्लेषण का वर्णन elastin और कोलेजन स्थानिक संगठन और मात्रा घनत्व के ठहराव के लिए । हम धमनी की दीवार यांत्रिकी के गणितीय मॉडल में इन आंकड़ों के उपयोग पर चर्चा ।
Abstract
प्रतिरोध धमनी remodeling के रोगजनक योगदान आवश्यक उच्च रक्तचाप, मधुमेह और चयापचय सिंड्रोम में प्रलेखित है । जांच और स्वास्थ्य और रोग में मानव प्रतिरोध धमनियों के यांत्रिक गुणों को समझने के लिए microstructurally प्रेरित गणितीय मॉडल के विकास के लिए कैसे रोग और चिकित्सा उपचार समझ सहायता की क्षमता है मानव microcirculation को प्रभावित करता है । इन गणितीय मॉडलों को विकसित करने के लिए, यह microvascular दीवार के यांत्रिक और microarchitectural गुणों के बीच संबंध को समझने के लिए आवश्यक है । इस काम में, हम निष्क्रिय यांत्रिक परीक्षण और अलग मानव प्रतिरोध धमनियों की धमनी की दीवार में elastin और कोलेजन के microarchitecture के एक साथ लेबल मुक्त तीन आयामी इमेजिंग के लिए एक पूर्व vivo विधि का वर्णन. इमेजिंग प्रोटोकॉल ब्याज की किसी भी प्रजाति की प्रतिरोध धमनियों के लिए लागू किया जा सकता है । छवि विश्लेषण मैं बढ़ाता है के लिए वर्णित हैं) दबाव-आंतरिक लोचदार लेमिना शाखाओं में बदलाव प्रेरित और adventitial कोलेजन सीधे फिजी और द्वितीय का उपयोग कर) कोलेजन और elastin मात्रा Ilastik सॉफ्टवेयर का उपयोग कर निर्धारित घनत्व । अधिमानतः सभी यांत्रिक और इमेजिंग माप रहते हैं, perfused धमनियों पर प्रदर्शन कर रहे हैं, तथापि, मानक वीडियो का उपयोग कर एक वैकल्पिक दृष्टिकोण-पुनः दबाव वाहिकाओं के पद निर्धारण इमेजिंग के साथ संयोजन में सूक्ष्म दबाव myography है चर्चा. यह वैकल्पिक पद्धति उपयोगकर्ताओं को विश्लेषण के लिए भिंन विकल्प प्रदान करती है । धमनी की दीवार यांत्रिकी के गणितीय मॉडलों में यांत्रिक और इमेजिंग डेटा के शामिल किए जाने पर चर्चा की है, और भविष्य के विकास और प्रोटोकॉल के लिए परिवर्धन प्रस्तावित कर रहे हैं.
Introduction
रोगजनक योगदान और प्रतिरोध धमनी remodeling के प्रभाव आवश्यक उच्च रक्तचाप, मधुमेह और चयापचय सिंड्रोम1,2,3,4,5में प्रलेखित हैं । microvascular दीवार के यांत्रिक और microarchitectural गुणों के बीच संबंध को समझने के लिए इस संघ के गणितीय मॉडलों के विकास के लिए आवश्यक है । इस तरह के मॉडल को फिर से तैयार करने की प्रक्रिया को समझने में सुधार होगा और silico मॉडल में के विकास का समर्थन करेंगे औषधीय रणनीति धमनी की दीवार के remodeling संबंधित रोग लक्ष्यीकरण के परीक्षण के लिए उपयोगी है ।
पहले अध्ययन कैसे धमनी की दीवार के microarchitecture यांत्रिक उपायों को शामिल करके धमनी की दीवार यांत्रिकी से संबंधित है और extracellular मैट्रिक्स (ECM) के microarchitecture लगभग विशेष रूप से बड़े पैमाने पर प्रदर्शन कर रहे है को समझने में ध्यान केंद्रित , चूहों या सूअर से लोचदार नाली धमनियों6,7,8,9,10,11. दीवार के microstructures की इमेजिंग आम तौर पर रैखिक ऑप्टिकल तकनीक का उपयोग कर, कोलेजन द्वारा elastin और दूसरी सुरीले पीढ़ी के autofluorescence का लाभ लेने के प्रदर्शन किया है । यह extracellular मैट्रिक्स, elastin और कोलेजन के दो प्रमुख घटकों के spatiotemporal इमेजिंग की अनुमति देता है, धुंधला के लिए एक की जरूरत के बिना । पूर्ण मोटाई में धमनी दीवार की इमेजिंग मोटी tunica मीडिया में प्रकाश के बिखराव के कारण बड़े नाली धमनियों में एक चुनौती है । हालांकि, यह निर्धारित करने के लिए कैसे धमनी की दीवार के संरचनात्मक घटकों के microarchitecture मनाया यांत्रिक गुणों से संबंधित है, तीन आयामी जानकारी यांत्रिक परीक्षण के दौरान प्राप्त किया जाना चाहिए । मानव महाधमनी की तरह बड़ी धमनियों के लिए, यह द्विअक्षीय बढ़ते, यांत्रिक परीक्षण और ब्याज के क्षेत्रों की इमेजिंग की आवश्यकता है 1-2 सेमी धमनी की दीवार के2 टुकड़ों में7,9,10, 12. दीवार का केवल एक भाग imaged और यांत्रिक रूप से परीक्षण किया जा सकता है ।
किसी भी प्रजाति की छोटी धमनियों के लिए (जैसे, मानव pericardial13, फुफ्फुसीय14 और चमड़े के नीचे15 धमनियों, चूहे mesenteric धमनियों16,17,18 , 19 , 20, माउस cremaster, mesenteric, सेरेब्रल, ऊरु और मन्या धमनियों21,22,23,24,25,26, 27) पूरी दीवार मोटाई के इमेजिंग संभव है और यांत्रिक परीक्षण के साथ जोड़ा जा सकता है । यह एक साथ यांत्रिक संपत्तियों और दीवार के भीतर संरचनात्मक व्यवस्था की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है । हालांकि, ECM के तीन आयामी संरचना में मनाया परिवर्तन के बीच संबंधों के प्रत्यक्ष गणितीय मॉडलिंग और प्रतिरोध धमनी दीवार के यांत्रिक गुणों को बदल दिया है, हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए ही है पर रिपोर्ट मानव प्रतिरोध धमनियों में हाल ही में13,15.
इस काम में, निष्क्रिय यांत्रिक परीक्षण और अलग मानव प्रतिरोध धमनियों की धमनी की दीवार में elastin और कोलेजन के microarchitecture के एक साथ तीन आयामी इमेजिंग के लिए एक पूर्व vivo विधि वर्णित है । इमेजिंग प्रोटोकॉल ब्याज की किसी भी प्रजाति की प्रतिरोध धमनियों के लिए लागू किया जा सकता है । छवि विश्लेषण आंतरिक लोचदार लेमिना शाखाकरण कोण और adventitial कोलेजन सीधे13 का उपयोग फिजी28के उपायों को प्राप्त करने के लिए वर्णित हैं । कोलेजन और elastin मात्रा घनत्व Ilastik सॉफ्टवेयर का उपयोग कर निर्धारित कर रहे हैं29 और अंत में, यांत्रिक और इमेजिंग डेटा के गणितीय मॉडल में धमनी की दीवार यांत्रिकी के शामिल किए जाने पर चर्चा की है ।
गणितीय मॉडलिंग के साथ संयोजन में इमेजिंग और छवि विश्लेषण तकनीक का वर्णन करने का लक्ष्य जांचकर्ताओं का वर्णन करने के लिए एक व्यवस्थित दृष्टिकोण प्रदान करने और समझने के लिए प्रतिरोध धमनियों के ECM में परिवर्तन प्रेरित दबाव है । वर्णित विधि प्रणा के दौरान एक पोत में ECM में परिवर्तन को बढ़ाता है, 20, 40 और 100 mmHg पर ECM की संरचना की तुलना द्वारा ध्यान केंद्रित है । इन दबावों को अपने अधिक अनुरूप (२० mmHg), कड़ा (१०० mmHg) और मध्यवर्ती (४० mmHg) राज्य में, क्रमशः धमनी की दीवार की संरचना निर्धारित करने के लिए चुना गया. हालांकि, लाइव धमनियों की संवहनी दीवार में किसी भी प्रक्रिया, vasoactive घटकों, हिस्टैरिसीस और प्रवाह द्वारा प्रेरित परिवर्तन सहित, quantified जा सकता है, अंवेषक द्वारा प्रश्न में अनुसंधान परिकल्पना पर निर्भर करता है ।
दाब का अध्ययन करने के लिए दाब myograph के साथ संयोजन में दो-फोटॉन उत्तेजना प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TPEM) का प्रयोग (या अन्य) जीने की धमनियों के ECM में प्रेरित परिवर्तन पर बल दिया जाता है. सबसे पहले, क्योंकि यह समग्र तीन के एक साथ अधिग्रहण की अनुमति देता है, धमनी की दीवार के आयामी संरचना (व्यास और दीवार मोटाई) तीन आयामी लेबल के साथ उच्च गुणवत्ता, कोलेजन और elastin की विस्तृत छवियों के मुक्त अधिग्रहण के साथ microarchitectures के रूप में वर्णित13 elastin autofluorescence और कोलेजन दूसरा हार्मोनिक उत्पादन संकेत (स्वसहायता)30का लाभ लेने के द्वारा । दूसरा, TPEM कम ऊर्जा के पास के उपयोग की अनुमति देता है-अवरक्त उत्तेजना प्रकाश, ऊतक के धूप को कम करने और इस प्रकार, दोहराया इमेजिंग नाड़ी दीवार के भीतर बिल्कुल एक ही स्थिति में अनुमति दी है, दोहराया की अनुमति-माप विश्लेषण मनाया परिवर्तन.
एक वैकल्पिक करने के लिए दबाव स्थिर धमनियों के फोकल इमेजिंग का उपयोग दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए उपयोग के लिए एक अवसर के रूप में अच्छी तरह से वर्णित विधि का उपयोग TPEM के बिना प्रयोक्ताओं की अनुमति पर चर्चा की है । ECM संरचना और मात्रा घनत्व पर सूचना भी धारावाहिक में खोदी ऊतकों के दो आयामी विश्लेषण से प्राप्त किया जा सकता है, उदाहरण के रूप में31,32द्वारा वर्णित. हालांकि, संभावना की कमी के कारण धमनी की लंबाई तराजू पर तीन आयामी संरचनात्मक जानकारी को पुनः प्राप्त करने के साथ ही बदलती परिस्थितियों के दौरान इस पद्धति का उपयोग कर, यह अनुशंसा नहीं है दबाव की जांच के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग कर और उपचार ECM में तीन आयामी परिवर्तन प्रेरित ।
अन्वेषक के लिए न्यूनतम आवश्यकता के साथ साथ वर्णित विधि लागू करने के लिए एक cannulation और प्रणा के साथ संयोजन में धमनियों के लिए एक सेटअप करने के लिए उपयोग है या दो फोटॉन उत्तेजना प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप. सेटअप निंनलिखित प्रोटोकॉल में वर्णित एक कस्टम निर्मित दबाव myograph एक अनुदैर्ध्य बल transducer, एक कस्टम पर फिट करने के लिए बनाया औंधा दो फोटॉन उत्तेजना प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ बनाया गया है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह काम एक मानकीकृत, संयुक्त इमेजिंग और दबाव myography दृष्टिकोण के लिए हमारे सुझाव का प्रतिनिधित्व करता है, प्रतिरोध धमनियों और धमनी की संरचना में दबाव से संबंधित परिवर्तन के यांत्रिक गुणों का एक साथ मूल्या…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक प्राकृतिक विज्ञान, दक्षिणी डेनमार्क के विश्वविद्यालय के संकाय में डेनमार्क आणविक जैव चिकित्सा इमेजिंग केंद्र, प्रयोगशालाओं और माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए धंयवाद । Kristoffer Rosenstand और उल्ला Melchior दबाव myography और इमेजिंग के साथ उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार कर रहे हैं ।
Materials
| Fine Science Tools | 15401-12 | |
| Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Nikon | SMZ800N | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 761028 | for dissection purpose |
| Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark | 1.63, 2.13, 210mm | |
| Smiths medical Intl, UK | ||
| Ethicon | Ethilon 11-0 | |
| Custom built | DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt | |
| Mettler toledo | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | B3259 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | A7030 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | C5670 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | G7021 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | E3889 | |
| Merck Millipore, Hellerup, Denmark | 1.00496.9010 | Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | H3784 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P9666 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P5655 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | M2643 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S2002 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5886 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5761 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 1.06462 | |
| Gibco, ThermoFisher Scientific | 10010015 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | PHR1423 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | Z370525 | |
| Tocris Bioscience, Bristol, UK | 538944 | |
| Nikon | Custom built | |
| Spectra Physics, Mountain View, CA | ||
| Nikon | CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27 | |
| Nikon | CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75 | |
| Hamamatsu, Ballerup, Denmark | H7422P-40 | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | ChromaET 460 nm long pass dichroic | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Chroma ET402/15X | |
| Scotch TM | ||
| coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip |
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