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Bioengineering

ラベル無料蛍光顕微鏡によるライブ、人間の抵抗血管のコラーゲンとエラスチンの圧力依存性アーキテクチャを評価します。

doi: 10.3791/57451 Published: April 9, 2018

Summary

同時に機械的テストを記述し、孤立の動脈壁の 3 D イメージング生きる人間の抵抗動脈とエラスチンとコラーゲンの組織およびボリュームの空間密度の定量化のためのフィジーと Ilastik の画像解析.動脈壁の力学の数理モデルでこれらのデータの利用について述べる。

Abstract

抵抗動脈リモデリングの病原性の貢献は、本態性高血圧、糖尿病、メタボリック シンドロームに記載されています。調査と健康と病気の人間の抵抗動脈の機械的性質を理解するための微視組織的動機の数理モデルの開発の理解を支援するために可能性がありますどのように病気と治療人間の微小循環に影響を与えます。これらの数学モデルを開発するには、血管壁の機械とマイクロ アーキテクチャの特性の関係を解読する不可欠です。この作品は、受動的な機械試験とエラスチンとコラーゲン分離人間の抵抗動脈の動脈壁の微細構造の同時ラベル無料三次元イメージングのex vivo法について述べる.画像のプロトコルは、関心の任意の種の抵抗血管に適用できます。画像解析は、i) 圧力誘起変化内弾性板分岐角度とフィジーと Ilastik ソフトウェアを使用して決定 ii) コラーゲンとエラスチンの量密度を使用して外コラーゲン真直度を定量化するため説明します。できればライブ、灌流動脈のすべての機械的およびイメージング測定が実行されます、ただし、再加圧反応槽のポスト固定イメージングの標準ビデオ顕微鏡圧力の組み合わせで図法を使用して代替方法はについて説明します。この代替方法は、解析手法のさまざまなオプションを持つユーザーを提供します。動脈壁の力学の数理モデルの機械的およびイメージングのデータを含めることが論議され、将来の開発と、プロトコルへの追加を提案しました。

Introduction

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病原性の貢献と抵抗動脈改造の効果は、本態性高血圧、糖尿病、メタボリック シンドローム1,2,3,4,5に記載されています。血管壁の機械とマイクロ アーキテクチャの特性の関係を解読するこの協会の数学モデルを開発に不可欠です。このようなモデルは、改造プロセスの理解を向上させる、silico モデル ターゲット疾患動脈壁の改造薬理学的戦略をテストするために便利での開発をサポートします。

理解どのように力学対策を組み込むことにより動脈壁の力学に関連する動脈壁の微細構造、細胞外マトリックス (ECM) の微細構造が大規模に実施されるほとんど専ら焦点を当てた先行研究、マウスまたは豚6,7,8,9,,1011から弾性導管動脈。壁の微細構造のイメージングは、通常コラーゲン、エラスチンと第二高調波発生の蛍光の活用、非線形光学技術を使用して実行されます。これは、細胞外マトリックス、エラスチンやコラーゲン、汚損のための必要性なしの 2 つの主要なコンポーネントの時空間イメージングできます。完全な厚さの動脈壁のイメージングは、厚いチュニカ メディアにおける光の散乱による大規模な導管動脈に挑戦です。ただし、機械のテスト中に、どの動脈壁の構造コンポーネントのアーキテクチャ関連観測の機械的性質を決定する三次元情報を得なければなりません。二軸取付、機械検査と動脈壁7,9,10,の 1-2 cm2個セットの関心領域の画像診断が必要ですこのひと大動脈のような太い動脈の12. 壁の部分だけをイメージ、機械的にテストできます。

任意の種の小さい動脈の (例えば 13人間心嚢、肺14皮下15動脈、ラット腸間膜動脈16,17,18,19,20マウス クレマスター、腸間膜、脳、大腿骨と頚動脈21,22,23,24,25,26,全体の肉厚の27) イメージング、機械試験と組み合わせることができます。これは機械的性質や壁内構造の手配の同時記録を可能します。ただし、直接数学的モデリングの ECM の立体構造の観察された変化と抵抗動脈壁の変更された機械的特性との関係だけに我々 の知識を最大限に報告されている時に最近では人間の抵抗動脈13,15

この作品は、受動的な機械試験とエラスチンとコラーゲン分離人間の抵抗動脈の動脈壁の微細構造の同時 3次元イメージングのための前のヴィヴォメソッドを呼びます。画像のプロトコルは、関心の任意の種の抵抗血管に適用できます。画像解析は、内弾性板分岐角度の外コラーゲン真直度13フィジー28を使用してメジャーを取得する説明します。コラーゲンとエラスチンの量密度は、Ilastik ソフトウェア29を使用して決定され、動脈壁の力学の数理モデルの機械的およびイメージング データの包含を議論する最後に。

技術と数理モデルの組み合わせでは捜査官に説明や理解の体系的なアプローチを提供する画像処理と画像解析を記述するための目標は、抵抗血管の ECM の内圧の変化を観察しました。この方法は 20、40、100 mmHg に ECM の構造を比較することで加圧中に容器内の ECM の変化の定量に集中します。これらの圧力は、それぞれより多くの準拠 (20 mmHg)、堅い (100 mmHg) 中間 (40 mmHg) 状態で動脈壁の構造を決定するために選ばれました。ただし、血管作動性コンポーネント、ヒステリシス、流れ、変化を含むライブの動脈の血管壁の任意のプロセスは調査官によって研究仮説によって示すことができます。

ライブの動脈の ECM の勉強圧力 (またはその他) による変化第 1 報圧力との組み合わせにおける 2 光子励起蛍光顕微鏡 (TPEM) の使用を強調しました。まず、高品質の 3次元情報ラベル無料取得とともに動脈の壁 (径および壁厚) の全体的な 3次元構造の同時取得できる、ために詳細コラーゲンとエラスチンの画像説明13自発蛍光をエラスチンとコラーゲンの第二高調波発生 (SHG) 信号30を利用して見学。次に、TPEM により組織およびこうして、血管壁内で正確に同じ位置に繰り返し画像の光損傷を最小限に抑え、低エネルギー近赤外励起光の使用を許可すると、許可する繰り返し測定と解析の観察変更します。

動脈を固定圧力の共焦点イメージングを用いた代替アプローチの使用は、TPEM にアクセスすることがなく同様の記載されているメソッドを使用する機会をできるように説明します。ECM の構造とボリュームの密度については、例えば31,32で定義されているシリアルの断面組織の 2次元解析からも取得できます。ただし、だけでなく、このメソッドを使用して条件を変更する時に動脈の長さスケールで立体構造情報を取得する可能性の欠如、それは圧力の調査のためのこのアプローチを使用してはお勧めしませんし、治療は、ECM の三次元変化を誘発します。

ここに記述された方法を適用する治験責任医師の最低限の要件は、挿管および共焦点または 2 光子励起蛍光顕微鏡との組み合わせで動脈の加圧のセットアップへのアクセスです。次のプロトコルで説明されているセットアップは、カスタム構築された倒立 2 光子励起蛍光顕微鏡に合わせて建てられた縦力の変換器を用いた特注圧力第 1 報です。

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Protocol

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この作業で使用するため人間の頭頂部心膜の生検のコレクションは、前述の33として書面によるインフォームド コンセント後行われました。ヒト組織の研究はヘルシンキ宣言34で説明した原則に準拠しているし、(S-20100044 および S-20140202) 南デンマークのデンマーク語データ保護庁健康研究倫理、地域委員会によって承認されました。

1. 組織と分離 (人間) 抵抗動脈を収集します。

  1. 興味にすぐに、手術中に切除の組織サンプルを収集します。転送組織 4 ° c HEPES 緩衝生理食塩水 (HBS) すぐにコレクションに HBS に格納.
    注: 生体のみ収集されます承認を経て患者の文書による同意と同様、関連する制度や倫理委員会によって。MM HBS 成分: 塩化ナトリウム 144 KCl 4.7、CaCl2 2.5、MgSO4 1.2、KH2PO4 1.2、HEPES 14.9 グルコース 5.5。、NaOH で pH 7.4 を調整し、ソリューションが 0.2 μ m のフィルターをフィルター処理します。
  2. 麻酔薬を洗い流すために一晩 4 ° C で滅菌 HBS に収集の組織を残します。
    注: 容器の完全性および機能に対する夜の記憶の効果は、個々 の研究所によってチェックしなければなりません。
  3. 慎重に鋭い先端の鉗子、マイクロ解剖はさみのペアを使用してサイズの抵抗動脈 (± 200 μ m の内腔の直径) を分離します。
  4. イメージング/圧力室をプライミング中冷たい HBS に 4 ° C で動脈を格納します。

2. 圧力第 1 報で孤立した動脈をマウントします。

  1. カニューレ ホルダーのヒント 〜 80 μ m の直径を持つガラス カニューレをマウントします。商工会議所のガラス下に上記ヒント約 150 μ m を位置します。
    注: 45 ° 曲げ先端カニューレは、ガラスの下に上記の船の正確な位置決めできるがあります。
  2. インレットとアウトレット チューブ 1 %bsa と HBS の両方を入力し、圧力システムに接続します。
    注: BSA が内皮細胞の機能を維持するために含まれます。
  3. カニューレあたり 2 つの二重結び目縫合糸を使用して孤立した動脈をマウントします。
    注: ノットが事前に準備、必要になるまでダブル粘着テープに保存されています。
  4. HBS とチャンバー、各ガラスのカニューレに 2 つの二重結び目。
    注: 動脈筋トーンを表示を使用している場合 HBS は無料 HBS 補完グリコールエーテルジアミン四酢酸 3 μ M と 3 μ M のニトロプルシド ナトリウム カルシウム交換必要があります。
  5. 鋭い先端の鉗子の 2 つのペアを使用して 1 つの端で優しく動脈を保持します。動脈の内腔を開き、カニューレに軽くスライドします。2 つの結び目を使用してカニューレを修正します。
  6. 優しく HBS/1% の内腔をフラッシュする 5 mmHg の圧力を適用 BSA。
  7. 動脈のもう一方の端を cannulate、2 つの二重結び目を使用してカニューレを固定します。
  8. 顕微鏡のステージに、第 1 報を転送し、5 mmhg 動脈を加圧 (入口圧力 = 出口圧力)、30 分の 37 ° C に熱し。
  9. オプション: 製造元の指示 (1 g = 9.81 mN) に従って縦力トランスデューサーを調整します。
    注: それは加熱温度に敏感である後力探触子を校正することが欠かせません。

動脈径、壁の厚さとコラーゲンとエラスチン マイクロアーキテクチャーの TPEM を使用してのイメージング実験を実行します。

  1. 5 mmHg に血管径および壁厚を評価するために 20 × 対物 (開口数 (NA) ≥ 0.8) と低消費電力の励起光を使用して 5 mmhg 加圧 ● キャニュレイテッド動脈を簡単にスキャンします。
    注: 倒立顕微鏡使用水浸対物レンズです。正立顕微鏡用対物を浸漬水を使用します。使用目的と使用のカバー スリップを合わせて目的にカバー スリップの厚さを補正する補正カラーが設定されていない場合を確認します。ソフトウェアの設定と説明は、ユーザー間期、顕微鏡および使用しているソフトウェアによって異なる場合があります。
    1. 光パスをセットアップします。
      1. マイタイ二光子励起レーザーをアクティブにし、820 nm 励起光に設定。
        注意: は、目に見えると目に見えないレーザー光への露出を避けます。
      2. 2 つのチャンネルで同時に発光を収集します。放射光を 460 nm ロングパス ダイクロイック ミラーと 520 を中心とした 30-60 nm 幅のバンドパス フィルターを用いた収集の放出を使用してフォトマルの間を分割 nm (エラスチン)、410 nm (コラーゲン)、それぞれ。
    2. 視野率 100% のピクセル 10 μ s レーザー ドウェル時間/ピクセルと 512 × 512 連続スキャンを有効にします。
    3. 動脈の最大径が観察される深さを決定するを手動でスキャンします。
    4. 動脈の広い直径をカバー長方形スライスを選択し、ピクセル サイズ ≦ 300 nm/ピクセル (図 2) と 1 つのフレームをスキャンします。低励起光パワーとライブ動脈 photodamaging を避けるために可能な限りピクセル滞留時間として使用します。
      注: 長方形、例えばを取得お勧め。、時間を節約し、組織の光子露出 (図 2) を制限するこの位置に二次画像ではなく、100 × 1024 ピクセルの画像。
    5. 後の分析のイメージを保存します。
  2. 動脈の最大径で内腔径および壁厚を決定します。
    1. フィジーのイメージを読み込みます。
    2. メイン メニューをクリックして尺度を設定する |分析 |縮尺を設定する(ピクセル比 1:1 を維持するが推奨高い) μ m/ピクセルとピクセル比を入力します。
    3. フィジーラインツールと血管内腔のそれぞれの側で 2 つの内部弾性板のけじめし、 ctrl キーを押しながら Mをクリックします。フィジーは、結果のテーブルの既定値として長さを報告します。
    4. 同様に、それぞれの壁の厚さを測定する複数の線を描画しをクリックしてctrl キーを押しながら M次のマークアップを測定します。
    5. 測定値を保存します。
  3. 動脈の長さに沿う興味の 1-3 地域の良質の 3 D 画像のスタックを取得、動脈壁の全体の厚さをスキャンすることによって 5 mmHg にコラーゲンとエラスチンのマイクロアーキテクチャーをイメージ。
    1. 目的、NA ≥ 1、最適化されたピクセル サイズ、z 間隔 X 60 を使用して動脈の壁が全体を通して画像のスタックを取得します。
      1. 光の経路は、浸漬媒体に従って最適な撮像条件 (ピクセル サイズ、z ステップ間隔) を計算して科学的なボリューム イメージング ナイキスト計算機 (https://svi.nl/NyquistCalculator) を使用して屈折のサンプルします。
        注: は、セクション 3.4 に最適なピクセル サイズとアドバイス対 z 間隔の違いにここで注意を払ってください。上記の最大ピクセル サイズを使用します。
    2. (3.1.1) 上記と同じ刺激および放出設定を使用します。
    3. Z スタックの厚さを決定するため上記のように血管壁をすばやくスキャンします。
    4. Z スタック開始と終了深度、z ステップ間隔とピクセル密度 (3.3.1.1 計算されます。) を定義し、z スキャンを実行します。各チャンネルを個別に保存します。
      注: 画像は、それに続く画像解析における曲率の影響を避けるために容器のサイズによって十分に小さい例えば30 μ m x 30 または 50 × 50 μ m をする必要があります。
  4. 動脈径、壁の厚さ、およびプロトコルの残り圧力でエラスチンとコラーゲンのマイクロ アーキテクチャを決定します。
    1. 圧力 10 から 20 mmHg で 3.1 3.2 を繰り返し、圧力 20 mmHg に 3.3 を繰り返し。
    2. 3.1 と 3.2 圧 40 mmHg で繰り返します。
    3. 3.1 3.2 圧力 60、80、および 100 mmHg でを繰り返し、繰り返し、100 mmHg に 3.3。
      注: 3.1 3.3 は、すべての圧力と圧力 (例えばシリーズ/の組み合わせだけでなく、減少の増加の圧力)、テストする仮説によっての組み合わせで繰り返すことができます。エオシン エラスチン蛍光退色の場合を強化する濃度 0.3 - 1 μ M を追加ことがあります。退色は、低消費電力励起された可能な限り光として適用することで回避できます。
    4. 新鮮な 37 ° C HBS で圧力の各ステップの後第 1 報室でバッファーを置き換えます。次の圧力の変更イメージ作成前 5 分に適応する動脈を許可します。
  5. 画像解析の個別にチャネル スタックを格納します。
  6. 動脈の実行可能性をテストします。
    1. 適用 10 μ M 第 1 報室 U46619 添加に続いて 10 μ M ブラジキニンの安定した収縮が観察されるとき。
    2. 3.1 次の各化合物のアプリケーションのセクションで前述の直径、肉厚を記録します。
    3. 動脈はさらにブラジキニンとレコードの径や壁の厚さを完全に拡張されていない場合は、ニトロプルシド ナトリウム 3 μ M を追加します。
      注: 関心 (血管床と種) の動脈の薬理学的特性に応じて他の血管収縮と (内皮依存性) 血管拡張薬化合物使用できます。
  7. オプション: 高圧の動脈を修正またはコラーゲンとエラスチン量密度 (ステップ 7) のためのイメージングを続行します。
    1. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 37 ° C 1 時間で × 1 で 4% のホルムアルデヒドを追加します。
    2. 1x PBS で固定の動脈を 3 回洗浄し、カチッと動脈カニューレ、結び目外動脈の部分だけに触れるから。結び目を削除、蓄積管に転送する際に動脈を保持するためにそれらを使用しないでください。
    3. 1 × PBS/0.05% ストア エラスチンとコラーゲンのボリューム密度または他の目的の画像まで 4 ° C でアジ化ナトリウム。
      注意: 固定動脈が 1 × PBS/0.05% で、少なくとも 3 ヵ月保存できます 4 ° C でアジ化ナトリウム

4. 応力-歪関係と本質的な壁の剛性の計算

  1. 数式と計算応力、ひずみおよび Bloksgaard、M. et al.による記述で壁の剛性を計算するための手順に従ってください。13ここ参照。

5 画像分析 - (内弾性板) IEL 分岐角度

  1. フィジーで開いている画像のスタック。ファイル | オープン画像画像のスタックを選択します。
    注: 2-7 連続 z セクション カバー IEL (1-2 μ m 厚) の最大強度突起は、フィジー28,35角度ツールを用いた IEL エラスチン繊維分岐角度を決定するために使用されます。図図 4 aを参照してください。
  2. 画像 | スタック | z プロジェクト...画像,「最大強度投影」を選択します。
  3. 最大強度投影を TIFF として保存します。
  4. 「角度ツール」を使用して、できるだけ多く IEL ファイバーの分岐ポイントを選択し、画像を体系的に作業します。Ctrl キーを押しながら M各角度の測定をクリックします。
  5. フィジー結果シートを保存します。

6. 画像解析 - 外コラーゲンうねり

  1. フィジーで開いている画像のスタック。ファイル | 開く画像のスタックを選択するイメージ。
    注: 最大輝度投影相関 2 7 連続 z セクションの R Rezakhaniha で説明されているようにフィジー NeuronJ プラグイン36を使用してコラーゲンのうねりを決定するため使用されるコラーゲンのすぐ外弾性板 (うなぎ、1-4 μ m の厚み) 外をカバー.37(図 4 b)。
  2. スケールを設定します。分析 | 尺度を設定ピクセル寸法を入力します。
  3. 画像 | スタック | z プロジェクト...の画像を操作し、「最大強度投影」を選択します。
  4. クリックして 8 係船柱 TIFF に画像の種類を変更画像 | 種類 | 8 係船柱最大強度投影を TIFF として保存。
  5. フィジー ニューロン J プラグインを使用してコラーゲン繊維の真直度を測定します。
    1. フィジーをクリックして NeuronJ プラグインを開く |プラグイン |ニューロン J
    2. 画像の取り込みをクリックして NeuronJ で 8 ビット TIFF を開く |ファイルを選択して
    3. トレースを追加、] をクリックし、各繊維の始点と終点をクリックして分析する繊維を選択します。
    4. 測定トレースをクリックし、ダイアログ ボックスでトレースを表示(Lf) と頂点の測定を選択します。
  6. L0/Lf を計算 excel (または類似の) 結果を保存します。
    1. コピーして excel にフィジー ニューロン J 頂点とトレース出力を貼り付ける (または類似の) L0 を計算する頂点測定からピタゴラスの定理を使用して。線上の最初と最後の点は、2 D 座標系の斜辺の両端の位置を示します。
      注: L0/Lf [コラーゲン繊維束エンド ツー エンド長直線 (L0)/フル (Lf) の長さ] 1 に近いほぼ直線のコラーゲン繊維を示します。

7. コラーゲンとエラスチン量密度イメージング

  1. (固定) 動脈 1 を洗う PBS で x と暗闇の中で 1 × PBS で 1 μ M エオシンで 15 分間染色します。固定の動脈の室温でこの手順を実行します。
    注: エオシン エラスチン蛍光が強化されます。サンプルは染色液に長時間残っている場合、エオシンはコラーゲンと細胞の細胞質など他の構造を染色します。その他の構造の染色があまりにも激しい場合 0.3 μ M にエオシンの濃度を下げるまたは洗浄を繰り返します。
  2. 3 動脈を洗う x 1x PBS で
    1. 固定の動脈の: イメージングの動脈をマウントします。
      注意: 非加圧容器の画像は、任意の幾何学的な定量的情報の取得を許可しません。絶対数量が必要な場合、これらは常にライブ、加圧の動脈に得られなければならない.体積比は、この方法で非加圧動脈で入手できます。
      1. 二重接着剤の場所 2 個テープ オブジェクト ガラスの 1 〜 1.5 cm です。二重粘着テープは、約 100 μ m 厚です。マウントする動脈の直径に合わせてテープの 1 つまたは複数のレイヤーを適用します。
      2. 広場の真ん中にガラスの上 10-20 μ L の PBS を置き、PBS のドロップで動脈を配置します。
        注: ドロップは小さいよう、カバー スリップをマウントするとき、位置から動脈を押すことを避けるために可能な限りフラットにする必要があります。
      3. Coverslip を置き、二重粘着テープ上に押します。
      4. 1x PBS で、coverslip とオブジェクト ガラスのリザーバーします。サンプルの乾燥を避けるために 1 時間ごとに補充します。
  3. コラーゲンとエラスチンの画像スタック 20 × 対物を用いた NA 量密度を取得 > 1 (図 2 D2 G と 2 H) 良いの光学解像度を有しながら可能な限り動脈壁のカバーに。
    注: 水浸対物レンズ イメージング観察下で動脈を固定のため、重要な動脈のイメージングのための目的を浸漬水を使用します。目的に coverslip に合わせて目的にカバー スリップの厚さを補正する補正カラーが設定されていない場合を確認します。できれば最適なピクセル サイズと z 間隔を使用します。ナイキスト計算機 (ステップ 3.3.1.1。) を使用してこれらを計算します。また、300 nm の最小ピクセル サイズと z - 1 μ m の間隔を使用します。測定内変動を決定するユーザーを許可する動脈の長さに沿って 3 つの画像を取得することをお勧めします。
  4. 820 nm 励起光と収集の放出を使用して 30-60 nm の広帯域通過フィルターを用いた画像エラスチン中心 520 nm。
  5. 画像コラーゲン エラスチンおよび他の蛍光タンパク質の任意の励起を避けるために、排出ガスを使って 10-30 nm の広帯域通過フィルター 495 を中心とした収集 990 nm 励起光を用いた nm。
  6. TIFF ファイルとして個別に各チャンネルから画像のスタックを保存します。

8 エラスチンとコラーゲン量密度 Ilastik を使用して抽出するため画像解析

  1. フィジー28,35を使用してファイルを選択をクリックして hdf5 TIFF 画像のスタックに変換 |としてを保存.HDF5
  2. コンピューターのハード ドライブ、エラスチン、コラーゲンの画像のスタックにそれぞれ 2 つのデータ ファイル フォルダーを作成します。関連画像のスタックを該当するフォルダーにコピーします。
  3. エラスチン、コラーゲン、1 つの Ilastik ソフトウェアでそれぞれ 2 つの新しい Ilastik プロジェクトを作成します。
    1. Ilastik を開く |新しいプロジェクトを作成する |ピクセルの分類 |新しいプロジェクト |データを追加すると選択画像フォルダー手順 8.2 で作成します。
      注: Ilastik ウィザードに従ってください。
  4. ソフトウェアを訓練する 1 つの 3 D 画像のスタックをインポートします。
    1. 入力データ アプレットを選択 | メイン ワークスペース領域 |Raw データ] タブ |... 新規追加 |別の画像を追加し目的の画像データを選択
  5. ソフトウェアに関連する機能を選択します。
    1. 機能の選択アプレットを開く |フィーチャーを選択を新しいダイアログが表示されます。詳細については、図 5 aを参照してください。
  6. トレーニング アプレット [ラベルの追加] ボタンを使用して、少なくとも 2 つのラベルを追加します。
    注: 各ラベルは分離する必要があるオブジェクト型に対応します。エラスチンこの作品で 3 つのラベルが使用されます: 自体エラスチン、(除外) に明るいスポットと背景 (除外) します。
  7. スタイルのアノテーション ツール ペイント ブラシを使用して raw 画像のスタックの上にラベルを描画します。
    1. 適切なラベルを選択:ブラシツールと描画を開始] をクリックします。
  8. 画像のスタックを分析してLive Update を有効にするをクリックして似たような機能のために Ilastik を求めます。
  9. 予測マップ (図 5) を慎重に確認します。
    注: 完全な予測マップに raw 画像からのプロセスは、図 5に示すです。Ilastik を使用してイメージを分割する予測地図がどちらのラベルのピクセルがするより可能性がありますによるとスタックには、(図 5) が関連付けられています。
  10. しきい値を適用します。
    1. 閾値アプレットを選択、適切なメソッド、入力ラベル、滑らかなしきい値を選択、フィルター パラメーターをサイズ、最後に [適用] をクリックします。
      注: これは、個別のオブジェクトにイメージの同様にラベル付けされた部分を分離します。エラスチンやコラーゲンのような高度に接続された組織を分離することを必要としない、したがって、0.4 のしきい値が適用されます (デフォルトは 0.5 です)。図 5 eおよび5 fは、しきい値を適用した結果を示しています。
  11. Ilastik のトレーニングを繰り返して、結果は満足のいく (それぞれコラーゲン、エラスチンだけはそれぞれの解析の認識)。
    1. このプロセスの間に頻繁間訓練とセグメンテーション (時々 また、閾値) スイッチ アプレット。Ilastik を再訓練の効果の例を図 6に示します。
  12. バッチと同様のイメージ データの分析:バッチ予測入力の選択を選択し、関連するファイルを追加します。
    注: Ilastik 出力エラスチン (またはコラーゲン) の有無と 1 (1) 本契約の存在を示す (ゼロ) を示す 0 と 1 ビット疑似 3 D 画像スタック (画像マスク) のコレクションは、(実際のビット深度 8 ビットです)。
  13. イメージ マスクと raw イメージ ファイルを視覚的に比較して各画像のスタックの結果を確認します。
  14. Ilastik マスク (8.4 8.9 の手順) を最適化し、不満足な結果に任意の画像のスタックを再分析します。
  15. MATLAB を使用して Ilastik 画像マスクからエラスチンやコラーゲンの量密度を計算します。
    1. MATLABを開きます。
    2. MATLAB「現在のフォルダー」に ilastik イメージ マスクとフォルダーの選択] ウィンドウ。
    3. MATLAB エディターに補助ファイル 1から MATLAB スクリプトをコピーし、コードを MATLAB フォルダーに volumeCalculator.m としてコンピューターのハード ドライブに保存します。
    4. スクリプト行のピクセル サイズとピクセルの高さを入力してください。
      ピクセル サイズ = 0.1230000 * 0.1230000;% ミクロン * ミクロン
      ための pixelHeight = 0.9。% ミクロン
    5. スクリプトを保存します。
    6. MATLAB コマンド ウィンドウに移動し、入力してください"volumeCalculator (' パスのデータ ')"スクリプトを読み込めません。
    7. [入力します。各画像のマスクは今総括、(知られている) ピクセル/ボクセル ボリューム (z 軸の解像度を掛けたピクセルの物理的な寸法) を掛けた。MATLAB からの出力は、各画像のスタックのコラーゲンとエラスチンの総ボリュームです。
  16. 結果を保存します。

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Representative Results

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この作業で使用するイメージング用特注圧力第 1 報を図 1に示します。I) 商工会議所少量 (2 mL) と ii) カニューレに近いとガラスの下部 (図 1 b) と平行に位置決めのための可能性に、第 1 報の設計のための特別な注意を払いました。チャンバーの下部に収まる 50 × 24 mm #1.5 ガラス基盤 (交換可能)。圧力コント ローラーは、標準的な 1 リットルのガラス瓶と血圧計 (削除カフ) から構築されました。フロー制約を持つ第 1 報セットアップ、サーボ圧力コント ローラーの使用をお勧めします。

図 2は、プロトコルに記載されている実験中に 1 つの画像と画像のスタックを取得するための推奨される位置を示しています。例示のため、図 2 aにマウントされた動脈の透過光顕像が含まれます。マウントされた動脈の結び目の結び目の長さは約 1.6 mm です。広い直径観察 (図 2 b)、この時点で、径および壁の厚さまで動脈がスキャンされ (図 2) を決定します。同様に、動脈の透過光像を図 2 Dで位置を示す含まれてあり、(図 2 e) コラーゲンとエラスチン (図 2 階、小の見学を決定するための画像のスタックの幅を推奨図 2 Dの四角形) (図 2) コラーゲンとエラスチン (図 2 H) ボリューム密度 (より大きい正方形、図 2 D) を決定する画像のスタックだけでなく。このアプローチを使用すると、圧力、径、壁の厚さの測定 (図 2) から圧径曲線、対応する応力-ひずみ曲線の計算の順を構築するためのデータを取得できます。

Bloksgaardによると応力-ひずみ関係の単一指数フィット。13と参照ここで、β 値、壁剛性増分弾性係数、Eに比例してのジオメトリの独立した基準を提供します。コラーゲンの見学の内圧変化とエラスチンとの関係の直接分析により、コラーゲンとエラスチンの画像で見学が得られた、さまざまな圧力で電子株式会社の計算さまざまな圧力 (図 3) で増分弾性率。IEL 分岐角度とコラーゲンの真直度の測定は、図 4に示します。

エラスチンとコラーゲンの量の測定は興味、例えば高血圧対正常血圧患者、2 つ以上のグループを比較する機械のデータの解釈のために重要です。このため、Ilastik、イメージの特定の機能を認識するように訓練することができますフリーウェアの画像解析ソフトで自動分析法が開発されました。Ilastik で作業フローを図 5に示します。

容積密度のコラーゲンとエラスチンの自動検出、得られた画像は良い信号対雑音比が重要です。人間のサンプルでは、コラーゲン SHG 信号に加えてコラーゲンから重要な蛍光がよく見られます。これは、エラスチンの検出のための信号対雑音比を減少します。図 6は、どのように「緑」に重要なコラーゲン蛍光サンプルで薄いエラスチン繊維のよりよい認識の結果することができます Ilastik プログラムの再訓練を示しています/エラスチン チャネル。写りコラーゲン SHG チャネルに蛍光信号の問題は、長い励起波長を用いた SHG 信号を得ることは助けるかもしれない。チャネルが裏写りが発生します、エオシンで染色後エオシンの塗布液の濃度を下げる必要があります。エオシンは簡単に洗浄、染色サンプルの繰り返し洗濯も信号を減らすかもしれないので。

Figure 1
図 1.特注蛍光イメージングのための圧力を第 1 報。(力変換器 (縦力) にマウントされているガラス管をマニピュレーターに接続されていると A) 灌流チェンバ(B) 2 mL の商工会議所の画像します。倒立顕微鏡を用いたイメージングを容易に、カニューレの 45 ° 曲げ。(C) 圧力コント ローラー。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2.圧力図法と蛍光イメージング戦略を結合します。(動脈の A) 透過光像 (B) 動脈の完全な幅のスキャンのイラスト。コラーゲン SHG が緑とエラスチン蛍光マゼンタ色で表示されます。(C). 血管内腔径 (ここ 238 μ m) と壁の厚さ (ここ 17 および 18 μ m 上および底、それぞれ) 動脈の赤道域 (最大径観察) で決定されます。(Z-スタック (E) コラーゲン真直度等を決定するための 10-50 μ m スケールで得られた内部弾性板の分岐角度依存性 (F) および (G) z-スタック 50-100 μ m で得られた位置のイラストを動脈 D) 透過光像コラーゲンとエラスチン (H) ボリューム密度を取得するためのスケール。画像 B/c: (20 μ m)、バー高さ 300 μ m (10 μ m)、バー 50 μ m × E/f: 50 G/H 130 × 130 × 30 μ m (バー = 30 μ m)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3.外コラーゲンと内弾性板 (IEL) と 20、40、100 mmHg に円周方向の増分弾性率の関係で組織を変更します。(A)、IEL にエラスチン繊維の分岐角度。(B) 外弾性板に近い外のコラーゲン線維の真直度。p-値と F 値によるとは、繰り返し測定を用いて決定した一方向の分散分析: p/F-values a: 0.0014/24.18, b: 0.0002/37.38。(C) IEL 分岐角度集束電子株式会社と関連付けています。(D) コラーゲン直線形電子株式会社と関連付けています。平均 ± SE 組織にデータが表示されます (A、B、および C と D の x 軸) の変更を求めた 6 抵抗動脈圧標準的な図法を受ける 20 の他の動脈の電子株式会社(C と D) を計算したとき、重要なイメージングを受ける。第 1 報圧力。検討した各動脈は、異なる個人からだった。この図は、Bloksgaardから変更されています。13.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4.IEL 分岐角度とフィジーでコラーゲンを真直度の測定のイラスト。(A) IEL 分岐角度は手動でマークされ、フィジー角度ツールを使用して測定します。(真直度 B) コラーゲンは、繊維 (オレンジ) の実際のエンド ツー エンドの長さで割った値直線 (ホワイト) を介して単一のコラーゲン線維のエンド-エンド長さの比率としてフィジー ニューロン J プラグインを使用して決定されます。バーのサイズ: 20 μ m。

Figure 5
図 5.Ilastik ワークフロー 。(A) 機能選択ウィンドウ選択されている機能の表示。(B) 例エラスチン繊維、明るい (好ましくない) および背景の (C) ラベルを持つ raw 画像それぞれ赤、緑、青で強調表示されます。(D) (C) に示されたラベルを持つ予測地図画像 (B) を生じる。((E) (D) の予測マップに基づく分割 E) と (F) 後 0.5 のしきい値を適用します。黄色の色は、分離の機能 (エラスチン) に対応する接続されているピクセルを示します。バーのサイズ: 25 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6.Ilastik 予測の最適化前に、と後の例の画像マップ サンプルのエラスチン繊維の認識のコラーゲン (サブ最適な信号対雑音比) の高いバック グラウンド蛍光を用いた Ilastik を再訓練の効果を示すします。(A) 元画像、(B) (画像 B の左側) 薄いエラスチン繊維特にがセグメンテーションに含まれていない最初の Ilastik 解析の結果、次の予測マップの最適化 (C) 最終的な結果。バーのサイズ: 25 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

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この作業が標準化された、結合されたイメージングと圧力図法のアプローチ、抵抗血管や動脈の構造の変化を圧力関連の機械的性質の評価を同時に貴重な提案を表します0 ~ 100 mmHg の圧力範囲上の壁。動脈壁のイメージングは、両方の機器の設計するときは、第任意圧力の 1 報 2 光子励起蛍光顕微鏡に合ったが使用できますただし、提示されたアプローチは、カスタム内蔵機器を使用して開発されました。形状、幅、客観的、イメージングの実行される条件の作業距離に特別な留意が必要です。正立顕微鏡倒立顕微鏡サンプルと目的の間の屈折率の違いを避けるために水浸漬の目的の使用が推奨に対し、目標を浸漬水の使用が必要です。さらに、注目される coverslip の厚さに目的と補正首輪を使用して (存在する場合) の目的に coverslip の不一致の補正を適用することによって、または目的の coverslip 厚さを照合することによって使用されます。

記載されているプロトコルの利点は低エネルギー、近赤外光イメージング蛍光がエラスチンとコラーゲン SHG の取得されます。これにより長時間の画像です。本研究で使用される人間の抵抗動脈、IEL は相互接続されたエラスチン繊維13,33, 人間の皮下の抵抗の IEL の構造と同様の縦一直線に並べられた繊維のようなネットワークの構成します。動脈 (hSCA)38,39。IEL にエラスチン繊維の分岐角度の変化が評価され、エラスチンの微細構造の変化を評価するために増加する圧力37と外のコラーゲン線維の漸進的な上体の対策と併用し、コラーゲンそれぞれ。エラスチンとコラーゲンのアーキテクチャを評価するための画像が異なる圧力で動脈の壁内の同じ領域で得られました。これにより、繰り返し測定と解析。可能であれば、捜査官は可能性があります各次元画像サイズ 10-50 μ m、関心の少なくとも 3 つの領域の画像を得ることを目指します。ただし、サンプルでは、特に動脈の壁の厚さに応じて妥協は関心の領域をスキャンしたの数と実験の実現可能な期間の間にあります。人間の心膜抵抗動脈の場合動脈は実験の 8-12 時間、少なくとも生きている残った。興味のいくつかの地域をスキャン サンプル間変動対の内の評価ができこうして得られた調査結果の結論を支持します。

それは光毒性損傷の誘発を避けるために注意して、高出力励起光を用いたイメージング ライブの組織標本で作業するときに避ける必要があります。この点を踏まえて、また実験的プロトコルの最後でボリューム密度コラーゲンとエラスチンの大きな画像のスタックを取得することは勧め固定サンプルに。ECM 成分の絶対量が必要なボリューム密度に定着剤の影響を定量化し、考慮する必要があります。固定と動脈の透過により、さらに必要に応じて細胞内ターゲットの染色します。このプロトコルではエラスチン染色を用いてエオシン ライブの動脈。(例えば、ファロイジン42) の他の汚れと共に特定のプローブ (例えば、 alexa 633 ヒドラジド40)、コラーゲン (例えば、 CNA3541) によるエラスチンの染色を適用する可能性がありますまたは DNA、評価を容易にする体積密度と動脈壁への関心の他の構造の構造組織。この機会は可能性があります単一光子顕微鏡抵抗血管の微細構造の変化を調査する機会、研究所を提供します。同じ動脈からセグメントは、異なる条件の下で扱われ、圧力の下で固定および応用治療の効果を比較する後の段階でイメージを作成可能性があります。● キャニュレイテッド再、再加圧およびステンド グラスの容器をイメージングによる興味のターゲットを視覚化する必要があります。再穿刺と再加圧は、エラスチンと修正することはできませんが、反動し、固定動脈43,44の 3 D 構造を変更、したがって、構造変化を考慮する場合に必要です。固定の動脈の構造変化を決定する欠点は、いくつかのセグメントを比較のため修正する必要繰り返し測定解析を実行できません。

イメージングを使用して得られたデータは、直接壁応力と歪みを計算し、血管壁の力学を理解することをサポートする Bloksgaard、M. et al13で説明するように使用できます。この作品でエラスチンの本質的な剛性を特徴付けるに数理モデルを適用し、コラーゲン コンポーネントに基づいてコラーゲンのリクルート株45,46を推定して動脈壁の計算応力-歪関係。イメージングは、調査結果をサポートされている数理モデルから人間の抵抗血管のコラーゲンは既に低周方向ひずみと壁面応力で採用されました。このプロトコルで記述されているコラーゲンとエラスチンの微細構造の定量的な対策をさらにすることができます拡張、頚動脈6,8,47,の実施広範な作品に触発48,49と大動脈7,9,10,50,51: 空間分布とコラーゲンの微細構造を評価する追加の分析を含めることができ、エラスチン繊維配向方向 (長手方向軸線に対しての方向性) と同様に、動脈壁のさまざまな層の内で。ベル15は、剛性と動脈壁の各層の応力を計算する IEL と多層解析モデルを含む外のコラーゲンの圧力誘起再編を対処しました。これらの著者の15は、それぞれ健康なボランティアおよび関連構造と 3 と 30 mmHg で壁応力から得られた人間の皮下抵抗動脈を使用します。

このプロトコルの提案方法うまくいけばそれ以上の調査と健康および病気の人間の抵抗動脈の機械的性質を理解するための微視組織的動機の数理モデルの開発動機を与えます。さらに長手方向の軸線に沿ってコラーゲンとエラスチンの方位角を含むように法改正、平滑筋細胞の体積密度、分布および動脈壁、コラーゲンとエラスチンのディストリビューション内向きと画像データが高血圧、糖尿病で改造のプロセスの理解を促進する、数理モデルの開発をフィードできるチュニカ メディアとエラスチン組織向きと外膜に分布とメタボリック シンドローム。同様に、冠微小循環の52,53陳とプロジェクトシエラによって提案されるように人間の抵抗血管の微細構造に基づくモデルがマクロ-(全体動脈) 血管の機械的反応の予測を提供できます。各成分の micro-(structure) 機械レベル。このようなモデルは構造パラメーターの定量的なデータと個々 のレイヤーと健常者と、さまざまな病気を患っている患者から動脈の動脈壁成分の機械的性質に基づく必要があります。さまざまな薬理学的治療法を受けます。データを標準的な方法で収集されます、プロファイル別危険因子、疾患治療と個人間で比較します。メソッドには、人間の微小循環が、病気と治療によってどのように影響を理解することを支援するために可能性があります。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

著者らは、研究所、顕微鏡の使用のためデンマーク分子医用イメージング センター南デンマーク大学自然科学部をありがとうございます。クリストファー Rosenstand、ウラ メルヒオールは、図法・ イメージング圧力と優れたテクニカル サポートに認められています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine Science Tools 15401-12
Fine Science Tools 11251-23
Nikon SMZ800N
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. 761028 for dissection purpose
Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark 1.63, 2.13, 210mm
Smiths medical Intl, UK
Ethicon Ethilon 11-0
Custom built DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt
Mettler toledo
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. B3259
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. A7030
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. C5670
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. G7021
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. E3889
Merck Millipore, Hellerup, Denmark 1.00496.9010 Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution 
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. H3784
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. P9666
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. P5655
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. M2643
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S2002
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S5886
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S5761
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. 1.06462
Gibco, ThermoFisher Scientific 10010015
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. PHR1423
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. Z370525
 Tocris Bioscience, Bristol, UK 538944
Nikon Custom built
Spectra Physics, Mountain View, CA
Nikon CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27
Nikon CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75
Hamamatsu, Ballerup, Denmark H7422P-40
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). ChromaET 460 nm long pass dichroic
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). Chroma ET402/15X 
Scotch TM
coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip

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References

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Bloksgaard, M., Thorsted, B., Brewer, J. R., De Mey, J. G. R. Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (134), e57451, doi:10.3791/57451 (2018).More

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