Vi beskriver samtidig mekanisk testing og 3D-bildebehandling av arterieveggen av isolert, live menneskelig motstand arterier og Fiji og Ilastik bilde analyser for kvantifisering av elastin og kollagen romlig organisering og volum tettheter. Vi diskuterer bruken av disse dataene i matematiske modeller av arterieveggen mekanikk.
Patogene bidrag av motstand arterien remodeling dokumentert viktig hypertensjon, diabetes og Metabolsk syndrom. Undersøkelser og utvikling av microstructurally motiverte matematiske modeller for å forstå de mekaniske egenskapene av menneskelig motstand arterier i helse og sykdom har potensial til å hjelpe forstå hvordan sykdommen og medisinske behandlinger påvirke menneskelig blodsirkulasjonen. For å utvikle disse matematiske modeller, er det viktig å dechiffrere forholdet mellom mekanisk og mikroarkitekturstruktur egenskapene til mikrovaskulær veggen. I dette arbeidet beskriver vi en ex vivo metode for passiv mekanisk testing og samtidige etikett-fri tredimensjonale imaging av mikroarkitektur av elastin og kollagen i arterieveggen av isolerte menneskelig motstand arterier. Tenkelig protokollen kan brukes på motstand arterier av alle arter av interesse. Bildet analyser er beskrevet for kvantifisering i) press-indusert endringer i interne elastisk lamina forgrening vinkler og adventitial kollagen rett linje ved hjelp av Fiji og ii) kollagen og elastin volum tettheter bestemmes ved hjelp av Ilastik programvare. Fortrinnsvis alle mekaniske og tenkelig mål utføres på live, parfyme arterier, er imidlertid en alternativ tilnærming med standard video-mikroskopi trykk myography i kombinasjon med etter fiksering bildebehandling av nytt trykksatt fartøy diskutert. Denne alternative metoden gir brukerne ulike alternativer for analyse tilnærminger. Inkludering av mekanisk og bildebehandling data i matematiske modeller av arterieveggen mekanikken er diskutert, og fremtidig utvikling og tillegg for protokollen.
Patogene bidrag og virkningene av motstand arterien remodeling er dokumentert i viktige hypertensjon, diabetes og Metabolsk syndrom1,2,3,4,5. Tyde forholdet mellom mekanisk og mikroarkitekturstruktur egenskapene til mikrovaskulær veggen er avgjørende for å utvikle matematiske modeller av denne tilknytningen. Slike modeller vil bedre forstå remodeling prosessen og vil støtte utviklingen av sili modeller nyttig for testing av farmakologiske strategier målretting sykdom relatert ombygging av arterieveggen.
Tidligere studier fokuserte forstå hvordan mikroarkitektur av arterieveggen gjelder arterieveggen mekanikk ved å innlemme mekanisk tiltak og mikroarkitektur med den ekstracellulære matrisen (EFM) utføres nesten utelukkende på store , elastisk kanal arterier fra mus eller svin6,7,8,9,10,11. Avbildning av microstructures av veggen utføres vanligvis med lineære optisk teknikker, utnytter autofluorescence av elastin og andre harmonisk generasjon av kollagen. Dette gjør spatiotemporal avbildning av to hovedkomponentene ekstracellulær matrix, elastin og kollagen, uten behov for flekker. Avbildning av arterieveggen full tykkelse er en utfordring i store kanal arterier på grunn av scatter lyset i tykke tunika media. Men for å avgjøre hvordan mikroarkitektur strukturelle komponentene i arterieveggen relatert til de observerte mekaniske egenskapene, må tre-dimensjonal informasjon hentes under mekanisk testing. For store arteriene som menneskelige aorta krever dette biaxial montering, mekanisk testing og imaging regioner av interesse i 1-2 cm2 stykker av arterieveggen7,9,10, 12. kun en del av veggen kan avbildes og mekanisk testet.
For mindre arterier av alle arter (f.eks human perikard13, lunge14 og underhud15 arteriene, rotte hvem arterier16,17,18, 19 , 20, mus cremaster, hvem, cerebral, femur og carotis arteriene21,22,23,24,25,26, 27) bildebehandling av hele veggtykkelse er mulig og kan kombineres med mekanisk testing. Dette tillater samtidig innspillingen av de mekaniske egenskapene og strukturelle avtaler i veggen. Men er en direkte matematisk modellering av forholdet mellom de observerte endringene i tredimensjonale strukturen av ECM og endrede mekaniske egenskaper av motstand arterieveggen, etter beste overbevisning bare rapportert på nylig i menneskelig motstand arterier13,15.
En ex vivo metode for passiv mekanisk testing og samtidige tredimensjonale imaging av mikroarkitektur av elastin og kollagen i arterieveggen av isolerte menneskelig motstand arterier er beskrevet i dette arbeidet. Tenkelig protokollen kan brukes på motstand arterier av alle arter av interesse. Bildet analyser er beskrevet for å få tiltak av interne elastisk lamina forgrening vinkler og adventitial kollagen rett linje13 med Fiji28. Kollagen og elastin volum tettheter fastsettes ved hjelp av Ilastik programvare29 og endelig inkludering av mekanisk og bildebehandling data i matematiske modeller av arterieveggen mekanikken diskuteres.
Målet med beskriver bildebehandling og bilde analysene teknikker i kombinasjon med matematisk modellering er å gi etterforskere en systematical tilnærming for å beskrive og forstå observert press induserte endringer i ECM av motstand arterier. Metoden beskrevet er fokusert i kvantifisere endringene i ECM i et fartøy i pressurization, ved å sammenligne strukturen av ECM på 20, 40 og 100 mmHg. Disse belastningene ble valgt for å bestemme strukturen i arterieveggen i mer kompatibel (20 mmHg), stive (100 mmHg) og mellomstatus (40 mmHg), henholdsvis. Imidlertid kan prosesser i vaskulære veggen av live arteriene, inkludert forandringer indusert av vasoactive komponenter, hysteresis og flyt, kvantifiseres, avhengig av forskning hypotesen aktuelle av utprøver.
Bruk av to-fotonet eksitasjon fluorescens mikroskopi (TPEM) i kombinasjon med et trykk myograph studerer press (eller andre) induserte endringer i ECM live arterier er vektlagt. Først, fordi dette gjør samtidige oppkjøpet av samlet tredimensjonale strukturen i arterieveggen (diameter og veggen tykkelse) sammen med tredimensjonale etikett-fri oppkjøpet av høy kvalitet, detaljerte bilder av kollagen og elastin microarchitectures som beskrevet13 ved å utnytte autofluorescence elastin og kollagen andre harmonisk generasjon signal (SHG)30. Andre tillater TPEM bruk av lavenergi nær infrarød eksitasjon lys, minimere photodamage vev og dermed gjentatte bildebehandling i nøyaktig samme posisjon innenfor vaskulære veggen er tillatt, tillater gjentatte målinger analyser av observert endringer.
Bruk av en alternativ tilnærming med AC confocal imaging press fast arterier er diskutert for å tillate brukere uten tilgang til TPEM en mulighet til å bruke beskrevet metoden også. Informasjon om ECM struktur og volum tettheter kan også hentes fra todimensjonal analyser av vev delt i føljetong, f.eks som beskrevet av31,32. Men på grunn av manglende mulighet til å hente tredimensjonale strukturinformasjon over lengden skalaer av arterien og endre ved hjelp av denne metoden, er det ikke anbefale å bruke denne tilnærmingen for undersøkelser av trykk og behandling indusert tredimensjonale endringer i ECM.
Minimumskravet etterforskeren bruke metoden her beskrevet er tilgang til et oppsett for cannulation og pressurization av arterier i kombinasjon med AC confocal eller to-fotonet eksitasjon fluorescens mikroskop. Beskrevet i følgende protokollen er en spesialbygd press myograph med en langsgående force svinger, bygd for å passe på en tilpasset bygget invertert to-fotonet eksitasjon fluorescens mikroskop.
Dette arbeidet representerer vårt forslag for en standardisert, kombinert bildebehandling og trykk myography tilnærming, verdifulle samtidige vurdering av de mekaniske egenskapene av motstand arterier og press-relaterte endringer i oppbygning av hovedvei veggen over en trykket varierer fra 0 til 100 mmHg. Presentert tilnærmingen ble utviklet Bruk egendefinerte bygget, men noen press myograph som passer på en to-fotonet eksitasjon fluorescens mikroskop kan brukes når utformingen av både utstyr tillater avbilding av …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker dansk molekylær biomedisinsk bildebehandling sentrum på fakultetet of Natural Sciences, University of Southern Denmark, for bruk av laboratorier og mikroskop. Kristoffer Rosenstand og Ulla Melchior er anerkjent for utmerket kundestøtte med presset myography og bildebehandling.
Fine Science Tools | 15401-12 | |
Fine Science Tools | 11251-23 | |
Nikon | SMZ800N | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 761028 | for dissection purpose |
Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark | 1.63, 2.13, 210mm | |
Smiths medical Intl, UK | ||
Ethicon | Ethilon 11-0 | |
Custom built | DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt | |
Mettler toledo | ||
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | B3259 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | A7030 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | C5670 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | G7021 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | E3889 | |
Merck Millipore, Hellerup, Denmark | 1.00496.9010 | Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | H3784 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P9666 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P5655 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | M2643 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S2002 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5886 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5761 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 1.06462 | |
Gibco, ThermoFisher Scientific | 10010015 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | PHR1423 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | Z370525 | |
Tocris Bioscience, Bristol, UK | 538944 | |
Nikon | Custom built | |
Spectra Physics, Mountain View, CA | ||
Nikon | CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27 | |
Nikon | CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75 | |
Hamamatsu, Ballerup, Denmark | H7422P-40 | |
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | ChromaET 460 nm long pass dichroic | |
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter | |
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Chroma ET402/15X | |
Scotch TM | ||
coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip |