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Bioengineering

Avaliação de colágeno e elastina Microarchitectures dependente de pressão nas artérias de resistência humana, ao vivo por microscopia de fluorescência etiqueta livre

doi: 10.3791/57451 Published: April 9, 2018

Summary

Descrevemos teste mecânico simultânea e imagens 3D de parede arterial isolada, viver artérias de resistência humana e análises de imagem de Fiji e Ilastik para a quantificação de elastina e colágeno espacial organização e volume densidades. Discutimos a utilização desses dados em modelos matemáticos da mecânica da parede arterial.

Abstract

A contribuição de patogenicidade de resistência artéria remodelação está documentada em hipertensão essencial, diabetes e síndrome metabólica. Investigações e desenvolvimento de modelos matemáticos microstructurally motivados para compreender as propriedades mecânicas das artérias de resistência humana na saúde e na doença têm o potencial para auxiliar a compreensão como doenças e tratamentos médicos afetam a microcirculação humana. Para desenvolver estes modelos matemáticos, é essencial para decifrar a relação entre as propriedades mecânicas e microarquitetura de parede microvascular. Neste trabalho, descrevemos um método ex vivo para testes mecânicos passiva e simultânea de imagem tridimensional livre de rótulo de microarquitetura de elastina e colágeno na parede arterial das artérias de resistência humana isolada. O protocolo de imagem pode ser aplicado para as artérias de resistência de qualquer espécie de interesse. Análises de imagem são descritas para quantificar alterações i) pressão induzida em ângulos ramificação lâmina elástica interna e retidão de colágeno adventícia usando Fiji e densidades de volume ii) colágeno e elastina determinadas utilizando o software Ilastik. De preferência todas as medidas de mecânicas e de imagem são executadas em artérias perfundidas, ao vivo, no entanto, uma abordagem alternativa usando pressão standard de vídeo-microscopia miografia em combinação com pós-fixação imagem de vasos re-pressurizados discutido. Este método alternativo fornece aos usuários com diferentes opções de abordagens de análise. A inclusão dos dados mecânicos e da imagem latente em modelos matemáticos da mecânica da parede arterial é discutida, e propõem-se desenvolvimento futuro e adições ao protocolo.

Introduction

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A contribuição patogénica e efeitos de resistência artéria remodelação estão documentados na hipertensão essencial, diabetes e síndrome metabólica1,2,3,4,5. Decifrar a relação entre as propriedades mecânicas e microarquitetura de parede microvascular é essencial para o desenvolvimento de modelos matemáticos desta associação. Tais modelos irão melhorar a compreensão do processo de remodelação e apoiarão o desenvolvimento de modelos de silico útil para testar estratégias farmacológicas direcionamento doença relacionada a remodelação da parede arterial.

Estudos prévios focada na compreensão de como a microarquitetura da parede arterial refere-se à mecânica da parede arterial, incorporando medidas mecânicas e a microarquitetura da matriz extracelular (ECM) são executadas quase que exclusivamente em grandes , artérias elásticas conduíte de ratos ou suína6,7,8,9,10,11. Imagens das microestruturas de parede geralmente é executada usando técnicas de ópticas não-lineares, aproveitando a autofluorescência de elastina e segunda geração harmônica por colágeno. Isso permite que a imagem spatiotemporal dos dois principais componentes da matriz extracelular, elastina e colágeno, sem a necessidade de coloração. Imagem latente da parede arterial em toda a sua espessura é um desafio em artérias grandes conduit devido à dispersão da luz na mídia grossa túnica. No entanto, para determinar como a microarquitetura dos componentes estruturais da parede arterial se relacionam com as propriedades mecânicas observadas, a informação tridimensional deve ser obtida durante o teste mecânico. Para as grandes artérias como a aorta humana, isso requer montagem biaxial, testes mecânicos e imagem de regiões de interesse em pedaços de2 1-2 cm da parede arterial7,9,10, 12. apenas uma parte da parede pode ser fotografada e testada mecanicamente.

Para artérias menores de qualquer espécie (por exemplo, subcutâneo15 artérias, rato artérias mesentéricas16,17,18, , pulmonar14 e pericárdica humano13 19 , 20, rato cremaster, mesentérica, cerebral, femoral e artérias carótidas21,22,23,24,25,26, imagem de 27) da espessura da parede inteira é possível e pode ser combinada com o teste mecânico. Isto permite a gravação simultânea de propriedades mecânicas e os arranjos estruturais dentro da parede. No entanto, uma modelagem matemática direta da relação entre as alterações observadas na estrutura tridimensional da ECM e alterado as propriedades mecânicas da parede arterial de resistência, o melhor de nosso conhecimento apenas relatou em cima recentemente, na resistência humana artérias13,15.

Neste trabalho, é descrito um método ex vivo para testes mecânicos passiva e simultânea de imagem tridimensional de microarquitetura de elastina e colágeno na parede arterial das artérias de resistência humana isolada. O protocolo de imagem pode ser aplicado para as artérias de resistência de qualquer espécie de interesse. Análises de imagem são descritas para a obtenção de medidas de ângulos de ramificação de lâmina elástica interna e de retidão de colágeno adventícia13 usando Fiji28. Densidades de volume de colágeno e elastina são determinadas usando o software de Ilastik29 , e finalmente, a inclusão dos dados mecânicos e da imagem latente em modelos matemáticos da mecânica da parede arterial é discutida.

O objetivo de descrever as imagem e imagem análises técnicas em combinação com a modelagem matemática é proporcionar a investigadores uma abordagem sistemática para descrever e compreender observadas mudanças de pressão induzida em ECM das artérias de resistência. O método descrito é focado em quantificar as alterações em ECM em um navio durante a pressurização, comparando a estrutura de ECM em 20, 40 e 100 mmHg. Essas pressões foram escolhidas para determinar a estrutura da parede arterial em sua mais compatível (20 mmHg), stiff (100 mmHg) e estado intermediário (40 mmHg), respectivamente. No entanto, qualquer processo na parede vascular das artérias ao vivo, incluindo alterações induzidas por componentes vasoativas, histerese e fluxo, pode ser quantificado, dependendo a hipótese de investigação em questão pelo investigador.

O uso da microscopia de fluorescência de excitação de dois fotões (TPEM) em combinação com um myograph de pressão para mudanças de pressão (ou outro) induziu a estudar em ECM das artérias ao vivo é enfatizado. Primeiro, porque isso permite a aquisição simultânea da estrutura global tridimensional da parede arterial (espessura de diâmetro e parede), juntamente com a aquisição de etiqueta livre tridimensional de alta qualidade, detalhadas imagens de colágeno e elastina microarchitectures como descrito13 , aproveitando a autofluorescência de elastina e colágeno segunda geração harmônica sinal (SHG)30. Em segundo lugar, TPEM permite uso de luz de baixa energia infravermelha excitação, minimizando Fotodano do tecido e assim, imagens repetidas em exatamente na mesma posição dentro da parede vascular é permitido, permitindo análises de medições repetidas do observado alterações.

O uso de uma abordagem alternativa, usando a imagem latente confocal de pressão fixada artérias é discutido para permitir que usuários sem acesso ao TPEM a oportunidade de usar o método descrito também. Informações sobre densidades de ECM estrutura e volume também podem ser obtidas de análises bidimensionais de tecidos seccionados em série, por exemplo, como descrito por31,32. No entanto, devido à falta de possibilidade para recuperar informações estruturais tridimensionais sobre as escalas de comprimento da artéria, bem como durante a mudança de condições usando este método, é que não recomendo usar essa abordagem para investigações de pressão e tratamento induzido por alterações tridimensionais em ECM.

O requisito mínimo para o investigador aplicar o método descrito neste documento é o acesso a uma instalação para canulação e pressurização das artérias em combinação com um microscópio de fluorescência confocal ou dois fotões de excitação. A configuração descrita no seguinte protocolo é um myograph de pressão Custom-Built com um transdutor de força longitudinal, construído para caber em um microscópio de fluorescência personalizado construído invertido dois fotões da excitação.

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Protocol

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Coleção de biópsias do pericárdio parietal humano para uso neste trabalho foi realizada após consentimento informado por escrito, como descrito anteriormente,33. O estudo de tecidos humanos em conformidade com os princípios constantes da declaração de Helsinque34 e foi aprovado pelas comissões regionais The sobre ética em pesquisa saúde para sul da Dinamarca (S-20100044 e S-20140202) e a Agência Dinamarquesa de proteção de dados.

1. recolher tecido e artéria de resistência isolada (humanos)

  1. Colete amostras de tecido de interesse imediatamente após a excisão durante uma cirurgia. Transferência do tecido a 4 ° C HEPES buffer sal solução fisiológica (HBS) imediatamente após a coleta e armazená-lo em HBS.
    Nota: Tecidos humanos são apenas recolhidos após a aprovação pelos comités éticos e institucionais, bem como consentimento informado por escrito dos pacientes. Composição de HBS em mM: 144 de NaCl, KCl 4.7, CaCl2 2.5, MgSO4 1.2, KH2PO4 1.2, 14,9 HEPES, glicose 5.5. Ajustar o pH 7,4 com NaOH e filtrar o filtro embora 0,2 µm de solução.
  2. Deixe o tecido coletado no estéril HBS a 4 ° C durante a noite a desbotar anestésicos.
    Nota: Qualquer efeito de armazenamento durante a noite no navio integridade e funcionalidade deve ser verificado pelo laboratório de pesquisa individual.
  3. Isole cuidadosamente artérias de resistência de tamanho (± 200 µm de diâmetro lúmen) usando um par de pinças de ponta afiada e tesoura micro-dissecção.
  4. Armazene as artérias a 4 ° C em HBS gelada enquanto escorva da câmara de pressão/imagem.

2. Monte a artéria isolada no Myograph de pressão

  1. Monte as cânulas de vidro com diâmetros de ponta de ~ 80 µm em suportes de cânulas. Posicione as pontas aproximadamente 150 µm acima do fundo do vidro de câmara.
    Nota: cânulas de ponta dobrada de 45° podem permitir um posicionamento preciso do navio acima do fundo do vidro.
  2. Encha a entrada e a tubulação de saída com HBS com 1% de BSA e se conectar ao sistema de pressão.
    Nota: BSA é incluído para preservar a função da célula endotelial.
  3. Monte a artéria isolada usando duas suturas de nó duplo por cânula.
    Nota: Nós podem ser preparados antecipadamente e armazenados na dupla fita adesiva até que seja necessário.
  4. Encha a câmara com HBS e coloque dois nó duplo em cada cânula de vidro.
    Nota: Quando utilizar artérias exibindo Tom miogênico, HBS deve ser substituído por cálcio que livre HBS suplementado com 3 µM EGTA e nitroprussiato de sódio 3 µM.
  5. Mantenha a artéria suavemente em uma extremidade usando dois pares de pinças de ponta afiada. Abra o lúmen da artéria e delicadamente, deslize-o para a cânula. Corrigi na cânula usando dois nós.
  6. Aplique uma pressão de 5 mmHg para lavar delicadamente o lúmen com HBS / 1% BSA.
  7. Canule a outra extremidade da artéria e fixá-lo na cânula de usando dois nó duplo.
  8. Transferir o myograph para a fase de microscópio e pressurizar a artéria a 5 mmHg (pressão de entrada = pressão de saída), em seguida aqueça a 37 ° C por 30 min.
  9. Opcional: Calibre o transdutor de força longitudinal, de acordo com as instruções do fabricante (g = 9,81 1 mN).
    Nota: É essencial para calibrar o transdutor de força depois de aquecimento como é sensível à temperatura.

3. realizar o experimento: Imagem latente de diâmetro Arterial, espessura de parede e colágeno e elastina microarquitetura usando TPEM

  1. Digitalizar rapidamente a artéria canulada pressurizada a 5 mmHg, usando um objectivo de X 20 (abertura numérica (NA) ≥ 0,8) e luz de excitação de baixa potência para avaliar a espessura de diâmetro e parede de navio em 5 mmHg.
    Nota: Para microscópios invertidos, use um objectivo de imersão de água; para microscópios na posição vertical, use uma água mergulhando o objectivo. Se o objetivo não tem um colar de correção para corrigir para a espessura da lamínula, certifique-se de combinar as lamínulas usadas com o objetivo de usado. As configurações de software e descrições podem variar dependendo do usuário-interfase e microscópio e do software utilizado.
    1. Configure o caminho óptico.
      1. Ativar Mai Tai dois fotões laser e defini-la como luz de excitação 820 nm.
        PRECAUÇÃO: Evite qualquer exposição a luz laser visível, bem como invisível.
      2. Colete de emissão simultaneamente em dois canais. Dividir a emissão de luz entre a photomultipliers usando um 460 nm passe longo espelho dicroico e cobrar emissão usando 30-60 nm ampla selectores centrados em 520 nm (elastina) e 410 nm (colágeno), respectivamente.
    2. Habilite a verificação contínua com 10 µs laser Habitai tempo/pixel e 512 × 512 pixels para o campo de visão de 100%.
    3. Manualmente digitalizar através da artéria para determinar a profundidade onde o diâmetro máximo é observado.
    4. Escolher um pedaço retangular cobrindo o maior diâmetro da artéria e digitalizar um único quadro com pixel tamanho ≤ 300 nm/pixel (Figura 2). Usar como potência de luz de baixa excitação e tempo de interrupção pixel possível evitar photodamaging a artéria ao vivo.
      Nota: É aconselhável obter um Retangular, por exemplo., imagem de pixel 100 × 1024, ao invés de imagem quadrática nessa posição para economizar tempo e limitar a exposição de fóton de tecido (Figura 2).
    5. Salve a imagem para análise posterior.
  2. Determine a espessura de diâmetro e parede de lúmen no diâmetro máximo da artéria.
    1. Carrega a imagem em Fiji.
    2. Definir a escala clicando Main menu | Analisar | definir escala e digite µm/pixel e pixel ratio (é altamente recomendável para manter a proporção de pixel 1:1).
    3. Escolha a ferramenta de linha de Fiji e traçar uma linha entre as duas lâminas elásticas internas de cada lado do lúmen arterial e clique em ctrl + M. Comprimento de relatórios de Fiji como padrão na tabela de resultados.
    4. Da mesma forma, desenhar mais linhas para medir a espessura de cada parede e clique em ctrl + M para medir a marcação a seguir.
    5. Salve as medições.
  3. Imagem microarquitetura de colágeno e elastina em 5 mmHg pela verificação de toda espessura da parede arterial, obtenção de pilhas de imagem 3D com boa qualidade para 1-3 regiões de interesse ao longo do comprimento da artéria.
    1. Obter pilhas de imagem através de toda a parede da artéria usando um 60 X objetivo, at ≥ 1, tamanho do pixel otimizado e z-espaçamento.
      1. Calcular as condições óptimas de imagem (tamanho do pixel e espaçamento de z-passo) em conformidade com o caminho óptico, meio de imersão e índices de refração usando a calculadora científica Volume imagem Nyquist (https://svi.nl/NyquistCalculator) da amostra.
        Nota: Por favor, prestem atenção à diferença entre o tamanho do pixel ideal e z-espaçamento contra o Conselho na seção 3.4. acima sobre o uso de um tamanho de pixel máximo .
    2. Use as mesmas configurações da excitação e emissão de acima (3.1.1.).
    3. Digitalizar rapidamente a parede do vaso, conforme descrito acima para determinar a espessura da pilha-z.
    4. Definir o início de z-pilha e profundidade final, espaçamento de z-passo e densidade de pixel (calculado em 3.3.1.1.) e executar o z-scan. Salve cada canal separadamente.
      Nota: Imagens devem ser suficientemente pequeno , por exemplo, 30 x 30 µm ou 50 × 50 µm dependendo do tamanho do navio para evitar qualquer influência de curvatura nas análises subsequentes de imagem.
  4. Determine o diâmetro arterial, espessura de parede e microarquitetura de elastina e colágeno em pressões restantes do protocolo.
    1. Repito 3.1-3.2 em pressões de 10 e 20 mmHg, repita 3.3 na pressão 20 mmHg.
    2. Repita 3.1 e 3.2 em 40 mmHg de pressão.
    3. 3.1-3.2 às pressões, 60, 80 e 100 mmHg de repetir e repetir 3.3 em 100 mmHg.
      Nota: 3.1-3.3 pode ser repetido para todas as pressões e combinações de pressões (por exemplo, uma série/combinação de pressões crescentes, bem como decrescentes), dependendo da hipótese a ser testada. Eosina em concentração 0,3 - 1 µM podem ser adicionados para aumentar a elastina autofluorescência em caso de fotobranqueamento. Fotobranqueamento pode ser evitado através da aplicação como excitação baixa potência leve quanto possível.
    4. Substitua o tampão na câmara myograph 37 ° C HBS após cada etapa de pressão. Permitir que a artéria se adaptar por 5 min antes da imagem latente após cada alteração na pressão.
  5. Armazenar pilhas de canais separadamente para análises de imagem.
  6. Testar a viabilidade da artéria.
    1. Aplicar 10 µM U46619 na câmara de myograph seguido pela adição de 10 bradicinina µM quando observa-se uma constrição estável.
    2. Gravar o diâmetro e a parede de espessura conforme descrito acima na seção 3.1, mediante a aplicação de cada um dos compostos.
    3. Adicione 3 µM nitroprussiato de sódio, quando a artéria não está totalmente dilatada após a adição da bradicinina e registro de diâmetro e parede de espessura.
      Nota: Dependendo das propriedades farmacológicas da artéria de interesse (cama vascular e espécie) outro vasoconstritor e vasodilatador (endotélio-dependente) compostos podem ser usados.
  7. Opcional: Consertar a artéria pressurizada ou continuar com a imagem de colágeno e elastina para densidades de volume (passo 7).
    1. Adicione 4% de formaldeído em 1 x fosfato salino (PBS) a 37 ° C por 1h.
    2. Lavar a artéria fixa três vezes em PBS 1x e deslize suavemente a artéria fora as cânulas, tocar apenas as partes da artéria fora os maçaricos. Não remover os maçaricos, usá-los para a realização da artéria, ao transferir para um tubo de armazenamento.
    3. Loja em 1 x PBS / 0.05% de azida de sódio a 4 ° C até imagens para outros fins ou densidades de volume de elastina e colágeno.
      Nota: As artérias fixas podem ser armazenadas pelo menos 3 meses no 1 x PBS / 0.05% de azida de sódio a 4 ° C.

4. cálculo de Stress relações de tensão e rigidez intrínseca da parede

  1. Por favor, siga as fórmulas e as etapas de cálculo para o cálculo de tensões, tensões e rigidez de parede conforme descrito por Bloksgaard, M. et al . 13 e referências neste documento.

5. imagem análise - ângulos de ramificação IEL (lâmina elástica interna)

  1. Pilha de abrir imagem em Fiji. Vá para arquivo | abrir imagem para escolher a pilha de imagem.
    Nota: Projeções de intensidade Max de 2-7 consecutivas z-seções cobrindo o IEL (1-2 µm de espessura) são utilizadas para determinar os IEL elastina fibra ramificação ângulos utilizando a ferramenta ângulo em Fiji28,35. Consulte a Figura 4A para ilustração.
  2. Vá para imagem | pilhas | projeto z... para escolher as imagens e "Max projeção de intensidade".
  3. Salve a projeção de máxima intensidade como TIFF.
  4. Escolher como muitos pontos de ramificação fibra IEL possível usando a ferramenta"ângulo" e trabalhar sistematicamente através das imagens. Clique em ctrl + M para medir cada ângulo.
  5. Salve a planilha de resultados de Fiji.

6. imagem análise - colágeno adventícia ondulação

  1. Pilha de abrir imagem em Fiji. Vá para arquivo | abrir imagem para escolher a pilha de imagem.
    Nota: Max projeções de intensidade de 2-7 consecutivas z-seções cobrindo o lado de colágeno fora a lâmina elástica externa (enguia, 1-4 µm de espessura) são utilizados para a determinação de ondulação de colágeno usando o plugin de Fiji NeuronJ36 , conforme descrito por Rezakhaniha, R . et al. 37 (Figura 4B).
  2. Defina a escala. Vá para analisar | definir escala para inserir as dimensões de pixel.
  3. Vá para imagem | pilhas | projeto z... para escolher imagens para trabalhar com e "Max projeção de intensidade".
  4. Alterar o tipo de imagem para 8 bitt TIFF clicando imagem | tipo | 8 bitt e a projeção de intensidade máxima de salvar como TIFF.
  5. Medir a retidão de fibra de colágeno usando o Plugin de J do neurônio de Fiji.
    1. Abra o plugin NeuronJ clicando Fiji | Plugins | Neurônio J.
    2. Abra o TIFF de 8 bits em NeuronJ, clicando em imagem de carga | Selecione o arquivo.
    3. Clique em Adicionar traçadose selecione fibras para analisar clicando no começo e a extremidade de cada fibra.
    4. Clique em traçados de medida, escolha Exibir rastreamento (Lf) e medições de vértice na caixa de diálogo.
  6. Calcular L0/Lf no excel (ou similar) e salvar os resultados.
    1. Copie e cole a saída de traçados e vértices de Fiji neurônio J para excel (ou similar) e calcular L0 usando o teorema de Pitágoras das medições de vértice. Primeiro e o último ponto na linha indicam as posições das extremidades da hipotenusa em um sistema de coordenadas 2D.
      Nota: Um L0/Lf [comprimento de-to-end de pacote de fibra de colágeno através de uma linha reta (L0) / cheio comprimento (Lf)] próximo de 1 indica uma fibra de colágeno quase em linha reta.

7. imagem latente de colágeno e elastina Volume densidades

  1. Lave a artéria (fixa) 1 x em PBS e manchá-la por 15 min em 1 eosina µM em 1X PBS no escuro. Para fixas artérias, execute esta etapa à temperatura ambiente.
    Nota: Eosina realça a fluorescência de elastina. Eosina manchará outras estruturas como o colágeno e o citoplasma da célula, se a amostra for deixada na solução de coloração por tempo prolongado. Se a coloração de outras estruturas é muito intensa, diminuir a concentração de eosina a 0,3 µM ou repetir a lavagem.
  2. Lave a artéria 3 x em 1X PBS
    1. Para artérias fixas: montar a artéria para a imagem latente.
      Atenção: Imagem latente dos navios não pressurizado não permite recuperação de qualquer informação quantitativa geométrica. Quando quantidades absolutas são necessárias, estes devem ser obtidas nas artérias ao vivo, pressurizadas. Rácios de volume podem ser obtidos nas artérias não pressurizado com este método.
      1. Coloque dois pedaços de adesivo duplo fita 1-1,5 cm de distância em um objeto de vidro. Fita adesiva dupla é aproximadamente de 100 µm de espessura. Aplica uma ou mais camadas de fita para coincidir com o diâmetro da artéria a ser montado.
      2. Coloque 10-20 µ l de PBS em vidro no meio da Praça e a artéria no drop-PBS.
        Nota: A entrega deve ser tão pequeno e esguio como possível, para evitar empurrando a artéria fora de posição quando o deslizamento da tampa de montagem.
      3. Colocar a lamela e prima na dupla fita adesiva.
      4. Encha o reservatório entre a lamela e objeto de vidro com 1X PBS. Recarregá-lo a cada hora para evitar a secagem da amostra.
  3. Obter imagem-pilhas de colágeno e elastina densidades de volume usando um objectivo X 20 com nd > 1 para cobrir o máximo de parede arterial quanto possível enquanto continua a ter uma boa resolução óptica (Figura 2D, 2G e 2h).
    Nota: Use um objectivo de imersão de água para geração de imagens das artérias fixas sob uma lamela e use uma água mergulhando o objectivo para a imagem latente das artérias vitais. Se o objetivo não tem um colar de correção para corrigir para a espessura da lamínula, certifique-se de corresponder a lamela ao objectivo. De preferência use o z-espaçamento e tamanho do pixel ideal. Calcule estas usando a calculadora de Nyquist (etapa 3.3.1.1.). Como alternativa, use um tamanho de pixel mínimo de 300 nm e z-espaçamento de 1 µm. Recomenda-se obter três imagens ao longo do comprimento da artéria para permitir ao usuário determinar a variabilidade intraensaio.
  4. Elastina imagem usando 820 nm excitação luz e coletar de emissão usando uma bandpass de largura 30-60 nm filtro centrado em 520 nm.
  5. Colágeno de imagem usando luz de excitação 990 nm para evitar qualquer excitação de elastina e outras proteínas autofluorescent e recolher emissão usando filtrar bandpass largura de 10-30 nm centrado em 495 nm.
  6. Salvar imagem pilhas de cada canal separadamente como arquivos TIFF

8. imagem análise para a extração de elastina e colágeno densidades de Volume usando Ilastik

  1. Converter pilhas de imagem TIFF para HDF5 usando Fiji28,35 clicando em escolher arquivo | Salvar como... HDF5.
  2. Crie duas pastas de arquivo de dados no disco rígido do computador para elastina, para pilhas de imagem de colágeno, respectivamente. Copie pilhas imagem relevantes para a pasta relevante.
  3. Crie dois novos projetos de Ilastik no software Ilastik, uma de elastina, um para colágeno, respectivamente.
    1. Abrir Ilastik | Criar novo projeto | classificação de pixel | novo projeto | Adicionar dados e selecione imagem pasta criada no passo 8.2.
      Nota: Siga o assistente de Ilastik.
  4. Importe uma pilha de imagem 3D para treinar o software.
    1. Selecione o applet entrada dados | área principal de trabalho | Guia de dados cru | Adicionar novo... | Adicionar imagem (ns) separado e escolher os dados de imagem desejada
  5. Escolha as características relevantes no software.
    1. Miniaplicativo de seleção de recursos aberto | Selecione o recurso que abre uma nova caixa de diálogo. Ver Figura 5A para obter detalhes.
  6. Adicione pelo menos dois rótulos usando o botão Adicionar etiqueta sob o applet de treinamento.
    Nota: Cada rótulo irá corresponder a um tipo de objeto que precisa ser separado. Neste trabalho, três rótulos são usados para elastina: elastina em si, pontos brilhantes (a ser excluído) e plano de fundo (a ser excluído).
  7. Desenhe etiquetas no topo da pilha de imagem raw usando o pincel estilizado ferramenta de anotação.
    1. Selecione o rótulo adequado: clique a ferramenta pincel e começar a desenhar.
  8. Solicitar Ilastik para analisar a pilha de imagem e procure características semelhantes clicando em Habilitar o Live Update.
  9. Verifique cuidadosamente o mapa de previsão (Figura 5).
    Nota: O processo de imagem raw para um mapa de previsão completa é mostrado na Figura 5. Ilastik usa o mapa de previsão para a imagem do segmento de pilha de acordo com qual rótulo um pixel é mais provável que seja associada (Figura 5).
  10. Aplica um limite.
    1. Selecione miniaplicativo limiarização, escolher um método apropriado, entrada de rótulo, liso, limiar e tamanho parâmetros de filtro e finalmente, clique em aplicar.
      Nota: Este separa as peças com designação semelhante da imagem em objetos discretos. Tecido altamente conectado, como a elastina e colágeno não precisa ser segregadas, portanto, um limite de 0,4 é aplicado (o padrão é 0,5). Figura 5E e 5F ilustram o resultado da aplicação de um limite.
  11. Repita a formação de Ilastik até que o resultado é satisfatório (apenas elastina, respectivamente de colágeno é reconhecida para as respectivas análises).
    1. Frequentemente alterne entre a formação e segmentação (e às vezes também o Thresholding) miniaplicativos durante este processo. Um exemplo do efeito da re-formação Ilastik é mostrado na Figura 6.
  12. Lote de analisar dados de imagem semelhantes: selecione seleção de entrada de previsão em lotes e adicionar arquivos relevantes.
    Nota: O Ilastik de saída é uma coleção de pilhas de imagem 3D de pseudo - 1 bit (máscaras de imagem) com 0 (zero) que indicam a ausência de elastina (ou colágeno) e 1 (um) que indicam a presença deste contrato (a profundidade de bits real é 8-bit).
  13. Verificar os resultados para cada pilha de imagem comparando visualmente as máscaras de imagem e os arquivos de imagem raw.
  14. Otimizar a máscara Ilastik (etapas 8.4-8,9) e re-analisar quaisquer pilhas de imagem com resultados insatisfatórios.
  15. Calcular as densidades de volume de elastina e colágeno da Ilastik máscaras de imagem usando MATLAB
    1. Abrir o MATLAB.
    2. Seleccione a pasta com máscaras de imagem ilastik em MATLAB "pasta atual" janela.
    3. Copie o script MATLAB complementar 1 arquivo para o editor do MATLAB e salve o código como volumeCalculator.m na pasta MATLAB no disco rígido do computador.
    4. Digite o tamanho do pixel e altura pixel nas linhas de script
      pixelSize = 0.1230000 * 0.1230000; micron % * mícron
      pixelHeight = 0,9; micron %
    5. Salve o script.
    6. Vá para a janela de comando do MATLAB e digitar "volumeCalculator (' caminho-de-dados ')" para carregar o script.
    7. Clique em entrar. Cada máscara de imagem agora é resumida e multiplicada pelo volume (conhecido) pixel/voxel (dimensões físicas de um pixel multiplicado pela resolução do eixo z). A saída do MATLAB é o volume total de elastina e colágeno em cada pilha de imagem.
  16. Salve os resultados.

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Representative Results

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O myograph de pressão custom-built para a imagem latente usado neste trabalho é mostrado na Figura 1. Especial atenção para a concepção do myograph foi pago para i) a câmara com um pequeno volume (2ml) e ii) a possibilidade de posicionamento as cânulas perto de e em paralelo com o fundo de vidro (figura 1B). O fundo da câmara se encaixa um 50 × 24 mm #1.5 vidro lamela (substituíveis). O controlador de pressão foi construído a partir de uma garrafa de vidro 1L padrão e um esfigmomanômetro (braçadeira removido). Para uma instalação de myograph com os requisitos de fluxo, é recomendado o uso de um controlador de pressão de servo.

A Figura 2 ilustra as posições recomendadas para a obtenção de imagens simples e pilhas de imagem durante o experimento descrito no protocolo. Para fins de ilustração, uma imagem de microscopia de luz de transmissão da artéria montada está incluída na Figura 2A. Comprimento de nó-a-nó da artéria montado é aproximadamente 1,6 mm. A artéria é digitalizada até o diâmetro maior é observado (Figura 2B), e neste ponto, são o diâmetro e a parede de espessura determinada (Figura 2). Da mesma forma, uma imagem de luz de transmissão da artéria é incluída na Figura 2D, mostrando a posição e recomendada a largura de pilhas de imagem para determinar a microarchitectures de colágeno (Figura 2E) e elastina (Figura 2F, pequeno Praça na Figura 2D) assim como as pilhas de imagem para determinar o colágeno (Figura 2) e densidades de elastina (Figura 2 H) volume (praça maior, Figura 2D). Usando essa abordagem, os dados para a construção de curvas de diâmetro de pressão, seguidas pelo cálculo das curvas tensão-deformação correspondente podem ser obtidos de pressão, diâmetro e parede medições de espessura (Figura 2).

Um único ajuste exponencial da relação tensão-deformação de acordo com Bloksgaard et al. 13 e referências neste documento, fornece o valor de β, uma medida independente da geometria de rigidez de parede proporcional a elasticidade incremental, Einc. Cálculo Einc em pressões diferentes em que as imagens de colágeno e elastina microarchitectures foram obtidos, permite uma análise direta da relação entre as mudanças de pressão induzida nos microarchitectures de colágeno e elastina e o módulo de elasticidade incremental em pressões diferentes (Figura 3). A medição de ângulos ramificação IEL e retidão de colágeno é ilustrada na Figura 4.

É importante para a interpretação da mecânicas dados comparando dois ou mais grupos de interesse, por exemplo, hipertensos vs pacientes normotensos, uma determinação do conteúdo de elastina e colágeno. Por isso, foi desenvolvido um método de análise automática de Ilastik, um software de análise de imagem freeware que pode ser treinado para reconhecer certas características da imagem. O fluxo de trabalho em Ilastik é ilustrado na Figura 5.

Para a detecção automática de elastina e colágeno para as densidades de volume, é importante que haja uma boa relação sinal-ruído em imagens obtidas. Em amostras humanas, autofluorescência significativa de colágeno é frequentemente observada além do sinal SHG de colágeno. Isto diminui a relação sinal-ruído para a detecção de elastina. A Figura 6 ilustra como re-treinamento do programa Ilastik pode resultar em um melhor reconhecimento das fibras de elastina fina em uma amostra com autofluorescência significativa de colágeno no "verde" / canal de elastina. Se a infiltração do sinal para o canal de SHG colágeno autofluorescência é um problema, obter o sinal SHG usando um longo comprimento de onda de excitação pode ajudar. Se o canal sangra através de ocorre após coloração com eosina, a concentração da solução de eosina aplicada deve ser diminuída. Eosina é facilmente lavada, então a lavagem repetida da amostra manchada pode diminuir o sinal também.

Figure 1
Figura 1 . Personalizado construído myograph de pressão para a imagem latente de fluorescência. (A) câmara de perfusão com capilares de vidro anexado para os Micromanipuladores, que é montada em um transdutor de força (força longitudinal). (B) 2 mL de imagens de câmara. O 45° de flexão das cânulas facilita a imagem usando um microscópio invertido. Controlador de pressão (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 . Combinados de pressão miografia e fluorescência estratégia de imagem. (A) transmissão luz imagem da artéria com ilustração de (B) a verificação da largura total da artéria. O colágeno SHG é mostrado em verde e elastina autofluorescência em magenta. C. diâmetro do lúmen Arterial (aqui 238 µm) e espessuras de parede (aqui 17 e 18 µm superior e inferior, respectivamente) é determinada na região equatorial (diâmetro maior observada) da artéria. (D) imagem de luz transmissão da artéria com a ilustração da posição do z-pilhas obtidas em uma escala de 10-50 µm para determinar a linearidade de colágeno (E), ângulos de ramificação (F) das lâminas elásticas internas e (G) z-pilhas obtidas em um 50-100 µm escala para a obtenção de colágeno e elastina (H) densidades de volume. Imagens de B/c: altura 300 µm (bar 20 µm), E/f: 50 x 50 µm (bar 10 µm), G/H 130 × 130 × 30 µm (bar = 30 µm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 . Microstructural mudanças no colágeno adventícia e a lâmina elástica interna (IEL) e sua relação com o módulo elástico incremental circunferencial em 20, 40 e 100 mmHg. (A) ângulos de ramificação das fibras de elastina no IEL. (B) linearidade das fibras de colágeno adventícia perto a lâmina elástica externa. p-valores e segundo F-valores foram determinados utilizando medidas repetidas ANOVA One-Way: p/F-values r: 0.0014/24.18, b: 0.0002/37.38. Ângulos de ramificação (C) IEL correlaciona nonlinearly com Einc. (D) linearidade colágeno correlaciona linearmente com Einc. Dados são apresentados como média ± SE. Microstructural alterações (A e B e x-axes de C e D) foram determinadas por 6 artérias de resistência submetidas a imagem vital enquanto Einc (C e D) foi calculado para 20 outras artérias pressao miografia em um padrão myograph de pressão. Cada artéria estudada foi de um indivíduo diferente. Esta figura foi modificada de Bloksgaard et al. 13. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 . Ilustração de medições de ângulos ramificação IEL e retidão de colágeno em Fiji. (A) IEL ramificação ângulos marcados manualmente e medido usando a ferramenta de ângulo de Fiji. (B) linearidade de colágeno é determinada usando o plugin de Fiji neurônio J como a relação do comprimento to-end de uma fibra de colágeno único através de uma linha reta (branco) dividido pelo comprimento real da fibra (laranja)-to-end. Bar tamanho: 20 µm.

Figure 5
Figura 5 . Fluxo de trabalho Ilastik. (A) janela de seleção de recurso com a indicação dos recursos selecionados. (B) exemplo de imagem crua com rótulos (C) para as fibras de elastina, pontos brilhantes (indesejados) e fundo destacado em vermelho, verde e azul, respectivamente. (D) resultando o mapa de previsão de imagem (B) com rótulos indicados em (C). (E) segmentação com base no mapa da previsão em (D) antes de (E) e (F) depois de aplicar um limite de 0,5. Cor amarela mostra os pixels conectados correspondente à característica segregada (elastina). Bar tamanho: 25 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 . Imagens de exemplo antes e depois da otimização da previsão Ilastik mapeiam mostrando o efeito de re-formação Ilastik para o reconhecimento das fibras de elastina em uma amostra com fluorescência de fundo elevado de colágeno (sub-ótimo relação sinal-ruído). (A) imagem do original, (B) o resultado da primeira análise de Ilastik, especialmente as fibras de elastina fina (lado esquerdo da imagem B) onde não constam a segmentação e (C) resultado após a otimização do mapa previsão. Bar tamanho: 25 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Este trabalho representa a nossa sugestão para uma padronizada combinada imaging e pressão miografia abordagem, valiosa para a avaliação simultânea das propriedades mecânicas de resistência das artérias e alterações relacionadas à pressão na estrutura da arterial parede ao longo de uma faixa de pressão de 0 a 100 mmHg. A abordagem apresentada foi desenvolvida utilizando equipamento construído personalizado, no entanto, pode ser usado qualquer myograph de pressão que caiba em um microscópio de fluorescência de excitação de dois fotões, quando o design de ambos os equipamentos permite que a imagem da parede arterial. Deve ser-se especial atenção para a forma, a largura e a distância de trabalho do objectivo e as condições sob as quais a imagem será executada. Vertical microscópios requerem o uso de água mergulhando objectivos, Considerando que o uso dos objectivos de imersão de água é recomendado para microscópios invertidos evitar diferenças de índices de refração entre a amostra e o objetivo. Além disso, deve ser dada atenção à espessura da lamela, aplicando uma correção para uma incompatibilidade entre o objetivo e a lamela usando o colar de correção no objectivo (se presente) ou por correspondência a espessura da lamela com o objetivo usado.

O protocolo descrito, é tirar partido da luz de baixa energia, infravermelho próximo para imagiologia autofluorescência de elastina e colágeno SHG. Isso permite que a imagem latente durante longos períodos de tempo. Nas artérias de resistência humana utilizado neste estudo, o IEL é composto por uma rede de fibra-like alinhada longitudinalmente de elastina interconectadas fibras13,33, semelhante à estrutura do IEL de resistência humana subcutânea artérias (hSCA)38,39. Mudanças na ramificação ângulos das fibras de elastina no IEL foram avaliadas e utilizadas juntamente com medidas do desenrolar gradual das fibras de colágeno adventícia com crescentes pressões37 para avaliar alterações na microarquitetura de elastina e colagénio respectivamente. Imagens de avaliação microarchitectures de elastina e colágeno foram obtidas na mesma região de interesse dentro da parede arterial em diferentes pressões. Isto permite análises de medições repetidas. Quando possível, o investigador poderia visam a obtenção de imagens em pelo menos 3 regiões de interesse, com imagem tamanhos 10-50 µm em cada dimensão. No entanto, dependendo do exemplo, especialmente a espessura da parede arterial, um compromisso tem que ser feita entre o número de regiões digitalizados de interesse e a possível duração do experimento. No caso das artérias de resistência humana pericárdica, as artérias se manteve vivas durante pelo menos 8-12 h de experimentação. Digitalização de várias regiões de interesse permite avaliação de intracontra variabilidade inter amostra e, portanto, suporta a conclusão sobre as conclusões obtidas.

É importante notar que para evitar a indução de danos fototóxico, imagem utilizando alta potência de luz de excitação deve ser evitada quando trabalhando em amostras de tecido vivo. Neste contexto, recomenda-se obter as pilhas de imagem grande, por colágeno e elastina densidades de volume no final do protocolo experimental, alternativamente em amostras fixas. Quando quantidades absolutas dos componentes ECM são necessárias, qualquer efeito do fixador sobre as densidades de volume deve ser quantificado e tidos em conta. Fixação e permeabilização das artérias permite além disso coloração de alvos intracelulares de interesse quando necessário. Neste protocolo, a mancha para elastina é executada usando eosina na artéria ao vivo. Coloração de elastina por sondas específicas (por exemplo, alexa 633 maleica40) e colágeno (por exemplo, CNA3541), podem ser aplicadas em conjunto com outras manchas (por exemplo, faloidina42) ou ADN, para facilitar a avaliação organização estrutural das outras estruturas de interesse na parede arterial e densidades volumétricas. Esta oportunidade pode fornecer laboratórios de pesquisa com microscópios confocal de fóton único uma oportunidade para investigar as alterações microestrutural em artérias de resistência. Segmentos da artéria mesmo e podem ser tratados em diferentes condições, sob pressão fotografados numa fase posterior para comparar o efeito do tratamento aplicado. Alvos de interesse devem ser visualizados por imagem dos navios re-canulados, re-pressurizados e manchados. Re-canulação e re-pressurização é necessário quando as alterações estruturais são consideradas, como a elastina não podem ser corrigida e, portanto, recolhimento e alteram a estrutura 3D da artéria fixa43,44. A desvantagem de determinar alterações estruturais nas artérias fixas é que vários segmentos têm fixado para comparação e análises repetidas-medição não podem ser executadas.

Os dados obtidos utilizando imagens podem ser usados diretamente para calcular as tensões e estresses da parede e suporta a compreender a mecânica da parede vascular, conforme descrito em Bloksgaard, M. et al.13. Neste trabalho, aplicou-se um modelo matemático para caracterizar a rigidez intrínseca da elastina e componentes do colágeno da parede arterial e para estimar o recrutamento de colágeno cepas45,46 sobre a base de cálculo relações de tensão do estresse. Imagem de suporte as conclusões da modelagem matemática, esse colágeno nas artérias de resistência humana já foi recrutado em baixa tensão circunferencial e estresse de parede. As medidas quantitativas de microarquitetura de elastina e colágeno descritos no presente protocolo podem ser mais alargado, inspirado o extenso trabalho realizado sobre as artérias carótidas6,8,47, 48 , 49 e aorta7,9,10,50,51: análises adicionais podem incluir a avaliação da distribuição espacial e a microarquitetura de colágeno e fibras de elastina dentro das diferentes camadas da parede arterial, bem como ângulos de orientação de fibra (orientação em relação ao eixo longitudinal). Bell et al. 15 endereçado a reorganização de pressão induzida do IEL e colágeno adventícia, incluindo um modelo analítico multi-camada para calcular a rigidez e a tensão em cada camada da parede arterial. Estes autores15 usado artérias de resistência humana subcutânea obtidas de voluntários sadios e estrutura relacionada e tensões de parede às 3 e 30 mmHg, respectivamente.

O método proposto neste protocolo espero que motiva mais investigações e desenvolvimento de modelos matemáticos microstructurally motivados para compreender as propriedades mecânicas das artérias de resistência humana na saúde e na doença. Com suas alterações posteriores do método para incluir também o colágeno e elastina ângulos de orientação ao longo do eixo longitudinal, o músculo liso celular volume densidade, distribuição espacial e orientação dentro da distribuição arterial da parede, colágeno e elastina e orientação na túnica média e organização de elastina e distribuição na adventícia túnica, os dados de imagem podem alimentar direta desenvolvimento de modelos matemáticos, facilitando a compreensão do processo de remodelação em hipertensão, diabetes e o síndrome metabólica. Da mesma forma, como sugerido por Chen e Kassab para a microcirculação coronariana52,53, modelos baseados na microestrutura das artérias de resistência humana podem fornecer previsões de respostas mecânicas arteriais no macro-(toda artéria) micro-(structure) mecânica níveis e para cada constituinte. Tais modelos devem ser baseados em dados quantitativos de parâmetros estruturais e propriedades mecânicas das camadas individuais e componentes na parede arterial das artérias provenientes tanto voluntários saudáveis e pacientes que sofrem de doenças diferentes, receber tratamentos farmacológicos diferentes. Dados são coletados de forma padronizada e comparados entre os indivíduos com fator de risco diferente, doença e tratamento perfis. O método tem o potencial para ajudar a entender como a doença e tratamentos médicos afetam a microcirculação humana.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores agradecer o dinamarquês Molecular Biomedical Imaging Center da faculdade de ciências naturais, Universidade do Sul da Dinamarca, o uso de laboratórios e microscópios. Kristoffer Rosenstand e Ulla Melchior são reconhecidos pela excelente assistência técnica, com a pressão miografia e da imagem latente.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine Science Tools 15401-12
Fine Science Tools 11251-23
Nikon SMZ800N
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. 761028 for dissection purpose
Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark 1.63, 2.13, 210mm
Smiths medical Intl, UK
Ethicon Ethilon 11-0
Custom built DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt
Mettler toledo
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. B3259
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. A7030
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. C5670
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. G7021
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. E3889
Merck Millipore, Hellerup, Denmark 1.00496.9010 Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution 
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. H3784
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. P9666
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. P5655
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. M2643
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S2002
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S5886
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S5761
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. 1.06462
Gibco, ThermoFisher Scientific 10010015
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. PHR1423
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. Z370525
 Tocris Bioscience, Bristol, UK 538944
Nikon Custom built
Spectra Physics, Mountain View, CA
Nikon CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27
Nikon CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75
Hamamatsu, Ballerup, Denmark H7422P-40
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). ChromaET 460 nm long pass dichroic
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). Chroma ET402/15X 
Scotch TM
coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip

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Avaliação de colágeno e elastina Microarchitectures dependente de pressão nas artérias de resistência humana, ao vivo por microscopia de fluorescência etiqueta livre
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Bloksgaard, M., Thorsted, B., Brewer, J. R., De Mey, J. G. R. Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (134), e57451, doi:10.3791/57451 (2018).More

Bloksgaard, M., Thorsted, B., Brewer, J. R., De Mey, J. G. R. Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (134), e57451, doi:10.3791/57451 (2018).

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