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Bioengineering

Evaluación de colágeno y elastina Microarchitectures dependiente de la presión en las arterias de resistencia viva, humana por microscopía de fluorescencia etiqueta-libre

doi: 10.3791/57451 Published: April 9, 2018

Summary

Describimos prueba mecánica simultánea y proyección de imagen 3D de la pared arterial de aislados, viven las arterias de resistencia humana y Fiji y Ilastik análisis de imagen para la cuantificación de colágeno y elastina densidades organización y volumen espaciales. Discutimos el uso de estos datos en modelos matemáticos de la mecánica de la pared arterial.

Abstract

La contribución patógena de resistencia arteria remodelación está documentada en la hipertensión esencial, diabetes y síndrome metabólico. Investigaciones y desarrollo de modelos matemáticos microestructuralmente motivados para la comprensión de las propiedades mecánicas de las arterias de resistencia humana en salud y enfermedad tienen el potencial para ayudar a entender cómo la enfermedad y tratamientos médicos afectan la microcirculación humana. Para desarrollar estos modelos matemáticos, es fundamental para desentrañar la relación entre las propiedades mecánicas y microarquitectura de la pared microvascular. En este trabajo, describimos un método ex vivo para ensayos mecánicos pasivos y proyección de imagen tridimensional libre de sello simultánea de la microarquitectura de elastina y colágeno en la pared arterial de las arterias de resistencia humana aislada. El protocolo de imagen puede aplicarse a las arterias de resistencia de cualquier especie de interés. Análisis de imagen se describen para cuantificar cambios i) inducidos por la presión en los ángulos de ramificación lámina elástico interna y rectitud de colágeno adventicial con Fiji y densidades de volumen ii) colágeno y elastina determinadas utilizando el software de Ilastik. Preferentemente se realizan todas las mediciones mecánicas y proyección de imagen en vivas y perfusión de las arterias, sin embargo, es un método alternativo utilizando presión estándar de video-microscopía miografía en combinación con las imágenes posteriores a la fijación de los recipientes a presión discuten. Este método alternativo proporciona a los usuarios diferentes opciones de enfoques de análisis. Se discute la inclusión de los datos mecánicos y proyección de imagen de modelos matemáticos de la mecánica de la pared arterial, y se proponen adiciones al Protocolo y desarrollo futuro.

Introduction

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La contribución patógeno y efectos de la resistencia de la arteria remodelación están documentadas en la hipertensión esencial, diabetes y síndrome metabólico1,2,3,4,5. Descifrar la relación entre las propiedades mecánicas y microarquitectura de la pared microvascular es esencial para el desarrollo de modelos matemáticos de esta asociación. Tales modelos mejorarán la comprensión el proceso de remodelación y apoyarán el desarrollo de modelos de silico útil para probar estrategias farmacológicas dirigidos a enfermedades relacionadas con el remodelado de la pared arterial.

Estudios previos centraron en la comprensión de cómo la microarquitectura de la pared arterial se refiere a la mecánica de la pared arterial mediante la incorporación de medios mecánicos y la microarquitectura de la matriz extracelular (ECM) se realizan casi exclusivamente en grandes , arterias del conducto elástico de ratones o porcina6,7,8,9,10,11. Proyección de imagen de las microestructuras de la pared se realiza generalmente mediante técnicas ópticas no lineales, aprovechando el autofluorescence de segunda generación armónica de elastina y de colágeno. Esto permite la proyección de imagen espacio-temporal de los dos principales componentes de la matriz extracelular, la elastina y el colágeno, sin necesidad de tinción. La proyección de imagen de la pared arterial espesor completo es un reto en las arterias grandes del conducto debido a la dispersión de la luz en el espesor de la túnica media. Sin embargo, para determinar cómo la microarquitectura de los componentes estructurales de la pared arterial se relacionan con las propiedades mecánicas observadas, deberá obtenerse información tridimensional durante la prueba mecánica. De las grandes arterias como la aorta humana, esto requiere montaje biaxial, pruebas mecánicas y proyección de imagen de regiones de interés en piezas de2 1-2 cm de la pared arterial7,9,10, 12. sólo una parte de la pared puede ser reflejada y probada mecánicamente.

Por arterias más pequeñas de cualquier especie (p. ej., pericárdico humano13, pulmonar14 y subcutánea15 arterias, rata arterias mesentéricas16,17,18, 19 , 20, ratón cremaster, mesentérica, cerebral, femoral y carótida arterias21,22,23,24,25,26, 27) proyección de imagen del espesor de la pared todo es posible y puede ser combinado con pruebas mecánicas. Esto permite la grabación simultánea de las propiedades mecánicas y los arreglos estructurales dentro de la pared. Sin embargo, una modelación matemática directa de la relación entre las alteraciones observadas en la estructura tridimensional de la ECM y cambiado las propiedades mecánicas de la pared arterial de la resistencia, se a lo mejor de nuestro conocimiento sólo ha divulgado sobre recientemente en las arterias de resistencia humana de13,15.

En este trabajo se describe un método ex vivo para ensayos mecánicos pasivos y simultánea proyección de imagen tridimensional de la microarquitectura de elastina y colágeno en la pared arterial de las arterias de resistencia humana aislada. El protocolo de imagen puede aplicarse a las arterias de resistencia de cualquier especie de interés. Análisis de imagen se describen para la obtención de medidas de los ángulos de ramificación lámina elástico interna y colágeno adventicial rectitud13 con Fiji28. Densidad de volumen de colágeno y elastina se determina usando Ilastik software29 y por último, se discute la inclusión de los datos mecánicos y proyección de imagen de modelos matemáticos de la mecánica de la pared arterial.

El objetivo de describir el análisis de la proyección de imagen y la imagen técnicas en combinación con modelos matemáticos es proporcionar a los investigadores un enfoque sistemático para describir y comprender la presión inducida por cambios observados en el ECM de las arterias de resistencia. El método descrito se centra en la cuantificación de los cambios en el ECM en un buque durante la presurización, mediante la comparación de la estructura de la ECM en 20, 40 y 100 mmHg. Estas presiones fueron elegidas para la determinación de la estructura de la pared arterial en su más obediente (20 mmHg), stiff (100 mmHg) y estado intermedio (40 mmHg), respectivamente. Sin embargo, cualquier proceso en la pared vascular de arterias vivas, incluyendo cambios inducidos por los componentes vasoactivos, histéresis y flujo, se puede cuantificar, dependiendo de la hipótesis de la investigación en cuestión por el investigador.

Se acentúa el uso de microscopía de fluorescencia de excitación de dos fotones (TPEM) en combinación con un miógrafo presión para estudiar la presión (u otro) inducida por cambios en el ECM de arterias vivo. En primer lugar, porque esto permite la adquisición simultánea de la estructura tridimensional global de la pared arterial (diámetro y espesor de pared) junto con la adquisición tridimensional libre de sello de alta calidad, detalladas imágenes del colágeno y elastina microarchitectures descrito13 aprovechando la autofluorescencia de la elastina y el colágeno segunda generación armónica señal (SHG)30. En segundo lugar, TPEM permite se permite el uso de luz infrarroja de baja energía excitación, minimizando el fotoenvejecimiento del tejido y por lo tanto, la proyección de imagen repetida en exactamente la misma posición dentro de la pared vascular, que permite análisis de mediciones repetidas de observar cambios.

Se discute el uso de un enfoque alternativo usando proyección de imagen confocal de presión fijada a las arterias para permitir a los usuarios sin acceso a TPEM la oportunidad de utilizar el método descrito así. Información sobre densidades de estructura y volumen de ECM también puede ser obtenido de análisis bidimensionales de los tejidos seccionados en serie, por ejemplo, como se describe en31,32. Sin embargo, debido a la falta de posibilidad de recuperar información estructural tridimensional mediante las escalas de la longitud de la arteria, así como durante el cambio de condiciones de uso de este método, es no es recomendable utilizar este enfoque para las investigaciones de presión y tratamiento indujo cambios tridimensionales en el ECM.

El requisito mínimo para el investigador aplicar el método aquí descrito es el acceso a una instalación de la canalización y la presurización de las arterias en combinación con un microscopio de fluorescencia confocal o dos fotones excitación. La configuración que se describe en el siguiente protocolo es un miógrafo a la medida de la presión con un transductor de fuerza longitudinal, construido para caber en un microscopio de fluorescencia invertido construido personalizado de la excitación de dos fotones.

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Protocol

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Colección de biopsias del pericardio parietal humana para su uso en este trabajo se realizó después de consentimiento de informado escrita, descrita33. El estudio de tejidos humanos se ajustan a los principios esbozados en el34 de la declaración de Helsinki y fue aprobado por los comités regionales de ética de la investigación de salud para el sur de Dinamarca (S-20100044 y S-20140202) y la Agencia danesa de protección de datos.

1. recoger el tejido y aislante (humanos) resistencia arteria

  1. Recoger muestras de tejido de interés inmediatamente después de la supresión durante una cirugía. Transferencia del tejido a 4 ° C HEPES tampón fisiológica solución salina (HBS) inmediatamente sobre la colección y la guardará en HBS.
    Nota: Los tejidos humanos son sólo recogidos tras la aprobación por comités institucionales y éticos así como el consentimiento informado de pacientes. Composición de HBS en mM: NaCl 144, 4,7 KCl, CaCl2 2.5, MgSO4 1.2, KH2PO4 1.2, HEPES 14.9, glucosa 5.5. Ajustar el pH 7.4 con NaOH y la solución aunque 0.2 μm filtro.
  2. Dejar el tejido recogido en HBS estéril a 4 º C durante la noche para lavar los anestésicos.
    Nota: Cualquier efecto de almacenamiento durante la noche en la integridad del buque y funcionalidad deberá ser revisada por el laboratorio de investigación individual.
  3. Aislar cuidadosamente las arterias de resistencia tamaño (diámetro de lumen de ± 200 μm) usando un par de pinzas de punta aguda y tijeras de disección micro.
  4. Guarde las arterias a 4 ° C en HBS helada mientras la cámara de presión de proyección de imagen de cebado.

2. Monte la arteria aislada en la laringe de presión

  1. Montaje de la cánula de vidrio con diámetros de punta de ~ 80 μm en soportes de cánulas. Coloque las puntas aproximadamente 150 μm por encima del fondo del vidrio de cámara.
    Nota: cánulas de punta doblada 45° pueden permitir un posicionamiento preciso del buque por encima del fondo de vidrio.
  2. Completa la entrada y la tubería de salida con HBS con 1% BSA y conectarse al sistema de presión.
    Nota: BSA está incluida para preservar la función de células endoteliales.
  3. Monte la arteria aislada mediante dos suturas de doble nudo por cánula.
    Nota: Nudos se pueden preparar con antelación y almacenados en cinta adhesiva hasta que se necesite.
  4. Llene la cámara con HBS y coloque dos nudos dobles en cada cánula de vidrio.
    Nota: Al utilizar las arterias con tono miógeno, HBS debe reemplazarse con calcio que libre HBS complementado con EGTA de 3 μm y 3 μm nitroprusiato de sodio.
  5. Sujete suavemente la arteria en un extremo con dos pares de pinzas de punta muy afilada. Abra el lumen de la arteria y deslícelo suavemente en la cánula. Fijar en cánula mediante dos nudos.
  6. Aplique una presión de 5 mmHg para lavar suavemente la luz con HBS / 1% BSA.
  7. Canule el otro extremo de la arteria y fíjela en la cánula con dos nudos dobles.
  8. Transferencia de la laringe a la platina del microscopio y presionar la arteria a 5 mmHg (presión de entrada = presión de salida), luego calentar a 37 ° C durante 30 minutos.
  9. Opcional: Calibrar el transductor de fuerza longitudinal según las instrucciones del fabricante (1 g = 9.81 mN).
    Nota: Es esencial para calibrar el transductor de fuerza después de la calefacción como es sensibles a la temperatura.

3. realizar el experimento: la proyección de imagen de diámetro Arterial, espesor de pared y colágeno y elastina microarquitectura con TPEM

  1. Buscar rápidamente la arteria canulada presurizada a 5 mmHg utilizando un objetivo de 20 X (apertura numérica (NA) ≥ 0,8) y la luz de excitación de baja potencia para evaluar vasos de diámetro y espesor de pared en 5 mmHg.
    Nota: Para microscopios invertidos, utilice un objetivo de inmersión de agua; para microscopios verticales, utilice un objetivo de inmersión de agua. Si el objetivo no tiene un collar de corrección para corregir el espesor del cubreobjetos, asegúrese de que para que coincida con el cubreobjetos usados con el objetivo utilizado. La configuración de software y descripciones pueden variar dependiendo de la interfase de usuario y microscopio y software utilizado.
    1. Configuración de la vía óptica.
      1. Activar el láser de dos fotones de Mai Tai y ponerlo a la luz de excitación de 820 nm.
        PRECAUCIÓN: Evite cualquier exposición a la luz de láser visible como invisible.
      2. Recoger la emisión simultáneamente en dos canales. Dividir la emisión de luz entre los photomultipliers usando un espejo dicroico de paso largo de nm y emisión recoger usando filtros de ancho de banda 30-60 nm centrados en 520 460 nm (elastina) y 410 nm (colágeno), respectivamente.
    2. Activar análisis continuo con 10 μs láser detención tiempo/pixel shaders y 512 × 512 píxeles para 100% campo de visión.
    3. Analizar manualmente a través de la arteria para determinar la profundidad donde se observa el diámetro máximo.
    4. Elegir un trozo rectangular que cubre el mayor diámetro de la arteria y escanear una sola imagen con píxeles tamaño ≤ 300 nm/pixel (figura 2). Utilizan como energía ligera excitación baja y tiempo de permanencia de píxeles como sea posible para evitar photodamaging la arteria vivo.
      Nota: Se recomienda obtener una rectangular, por ejemplo., 100 × 1024 píxeles imagen, en lugar de imagen cuadrática en esta posición para ahorrar tiempo y limitar la exposición del fotón del tejido (figura 2).
    5. Guarda la imagen para posteriores análisis.
  2. Determinar luz de diámetro y espesor de pared en el diámetro máximo de la arteria.
    1. Cargar la imagen en Fiji.
    2. Establezca la escala haciendo clic en menú principal | Analizar | establecer la escala y entrar en relación μm/píxeles y los píxeles (se recomienda para mantener la proporción de píxeles 1:1).
    3. Elija la herramienta de línea de Fiji y trazar una línea entre las dos láminas elásticas internas a cada lado de la luz arterial y haga clic en ctrl + M. Longitud de informes de Fiji como predeterminado en la tabla de resultados.
    4. Asimismo, trazar más líneas para medir el espesor de cada pared y haga clic en ctrl + M para medir el siguiente marcado.
    5. Guardar las mediciones.
  3. Microarquitectura de colágeno y elastina de imagen en 5 mmHg mediante la exploración de todo el espesor de la pared arterial, obtención de pilas de imágenes 3D con buena calidad de 1 a 3 regiones de interés a lo largo de la longitud de la arteria.
    1. Obtener pilas de imagen a través de toda la pared de la arteria con un 60 X objetivo NA ≥ 1, tamaños de pixel optimizado y espaciamiento de los z.
      1. Calcular las condiciones óptimas de la proyección de imagen (tamaño de píxel y espaciado z-paso) con arreglo a la vía óptica, medio de inmersión y muestra índices refractivos usando la calculadora científica Nyquist de proyección de imagen de volumen (https://svi.nl/NyquistCalculator).
        Nota: Preste atención a la diferencia entre el tamaño de pixel óptima y espaciado z versus el Consejo en la sección 3.4. sobre el uso de un tamaño de píxel máximo .
    2. Utilizar la misma configuración de excitación y emisión como arriba (3.1.1.).
    3. Buscar rápidamente la pared del vaso como se describió anteriormente para determinar el espesor de la pila de z.
    4. Definir Inicio z-stack y profundidad final, espacio z paso y densidad de píxeles (calculado en 3.3.1.1.) y realizar la exploración de z. Guardar cada canal por separado.
      Nota: Imágenes deben ser lo suficientemente pequeño como por ejemplo, 30 x 30 μm o 50 × 50 μm según el tamaño del vaso para evitar cualquier influencia de la curvatura en los análisis de la imagen posterior.
  4. Determinar el diámetro arterial, espesor de pared y microarquitectura de elastina y colágeno a presiones restantes del protocolo.
    1. Repetir 3.1-3.2 presiones 10 y 20 mmHg, repetir 3.3 presión de 20 mmHg.
    2. Repita 3.1 y 3.2 en 40 mmHg de presión.
    3. 3.1-3.2 presiones de 60, 80 y 100 mmHg de repetir y repetir 3.3 en 100 mmHg.
      Nota: 3.1-3.3 puede repetirse para todas las presiones y combinaciones de presiones (por ejemplo, una serie/combinación de crecientes presiones así como disminución), dependiendo de la hipótesis a probar. Eosina en la concentración de 0.3 - 1 μm pueden añadirse para mejorar la autofluorescencia de la elastina en el caso de fotoblanqueo. Fotoblanqueo puede evitarse aplicando como excitación de baja potencia más ligera posible.
    4. Reemplazar el buffer de la cámara del miógrafo fresca a 37 ° C HBS después de cada paso de presión. Permitir que la arteria para adaptarse durante 5 minutos antes de la proyección de imagen tras cada cambio de presión.
  5. Guarde las pilas canal por separado para los análisis de imagen.
  6. Prueba de viabilidad de la arteria.
    1. Aplicar 10 μm U46619 en la cámara de laringe seguida de la adición de 10 bradicinina μm cuando se observa una constricción estable.
    2. Registrar el diámetro y espesor de pared como se describe anteriormente en la sección 3.1 después de la aplicación de cada uno de los compuestos.
    3. Añadir nitroprusiato de sodio de 3 μm cuando la arteria no se dilata completamente después de la adición de bradykinin y registro de diámetro y espesor de pared.
      Nota: Dependiendo de las propiedades farmacológicas de la arteria de interés (especies y lecho vascular) otro vasoconstrictor y vasodilatador (dependiente del endotelio) compuestos pueden ser utilizados.
  7. Opcional: Fijar la presión de la arteria o continuar con la proyección de imagen de colágeno y elastina para densidades de volumen (paso 7).
    1. Añadir formaldehído al 4% en el 1 x de solución salina con tampón fosfato (PBS) a 37 ° C durante 1 hora.
    2. Lavar la arteria fija tres veces en PBS 1 x y deslice suavemente la arteria fuera de la cánula, tocar sólo las partes de la arteria fuera de los nudos. No quitar los nudos, utilizar para la celebración de la arteria cuando se transfiere a un tubo de almacenamiento.
    3. Tienda de 1 x PBS / 0.05% de azida de sodio a 4 ° C hasta la proyección de imagen para densidades de volumen de elastina y colágeno u otros propósitos.
      Nota: Las arterias fijas pueden almacenarse durante al menos 3 meses en 1 x PBS / 0.05% de azida de sodio a 4 ° C.

4. cálculo de las relaciones de tensión de tensión y rigidez intrínseca de la pared

  1. Por favor siga las fórmulas y los pasos de cálculo para el cálculo de tensiones, tensiones y rigidez de la pared según lo descrito por Bloksgaard, M. et al. 13 y referencias en este documento.

5. Análisis - ángulos de ramificación de IEL (lámina elástica interna) de la imagen

  1. Pila de abrir imagen en Fiji. Ir a archivo | abre la imagen para elegir la pila de la imagen.
    Nota: Las proyecciones de intensidad máxima de 2-7 z-secciones consecutivas cubriendo la IEL (1-2 μm de grosor) se utilizan para determinar los IEL elastina fibra ramificación ángulos usando la herramienta ángulo en Fiji28,35. Para Ilustración, consulte la Figura 4A .
  2. Ir a imagen | pilas | proyecto z... para elegir las imágenes y "Proyección de máxima intensidad".
  3. Guarde la proyección de máxima intensidad como TIFF.
  4. Seleccione IEL fibra ramificación puntos como sea posible usando la herramienta de"ángulo" y trabajar sistemáticamente a través de las imágenes. Haga clic en ctrl + M para medir cada ángulo.
  5. Guardar la hoja de resultados de Fiji.

6. Análisis - ondulación de colágeno adventicial de la imagen

  1. Pila de abrir imagen en Fiji. Ir a archivo | abrir imagen para elegir la pila de la imagen.
    Nota: Las proyecciones de la intensidad de máximo de 2-7 z-secciones consecutivas que cubre justo de colágeno fuera de la lámina elástica externa (anguila, 1-4 μm de espesor) se utilizan para determinar la ondulación de colágeno mediante el plugin NeuronJ de Fiji del36 según lo descrito por Rezakhaniha, R . et al. 37 (Figura 4B).
  2. Establecer la escala. Ir a la analizar | establecer escala para entrar en dimensiones en píxeles.
  3. Ir a imagen | pilas | proyecto z... elegir imágenes para trabajar con y "Proyección de máxima intensidad".
  4. Cambiar tipo de imagen a TIFF de 8 bitt haciendo clic en imagen | tipo | 8 bitt y guarde la proyección de máxima intensidad como TIFF.
  5. Medir la rectitud de la fibra de colágeno mediante el Plugin de Fiji la neurona J.
    1. Abrir el plugin de NeuronJ haciendo clic en Fiji | Plugins | Neurona J.
    2. Abrir el TIFF de 8 bits en NeuronJ haciendo clic en imagen de carga | Seleccione el archivo.
    3. Haga clic en Agregar trazosy seleccione las fibras a analizar haciendo clic en Inicio y final de cada fibra.
    4. Haga clic en registros de encabezamientos secundarios de medida, elegir Mostrar la localización (Lf) y vértice en el cuadro de diálogo.
  6. Calcular L0/Lf en excel (o similar) y guardar los resultados.
    1. Copiar y pegar Fiji neurona J trazados y vértices salida a excel (o similar) y calcular L0 aplicando el teorema de Pitágoras de las mediciones de vértice. Primer y último punto en la línea indican las posiciones de los extremos de la hipotenusa en un sistema de coordenadas 2D.
      Nota: Un L0/Lf [longitud de end-to-end de paquete de fibra de colágeno a través de una línea recta (L0) completa longitud (Lf)] cercano a 1 indica una fibra de colágeno casi recta.

7. la proyección de imagen de colágeno y elastina volumen densidad

  1. Lave la arteria (fija) 1 x en PBS y mancha por 15 min en 1 eosina μm en PBS 1 x en la oscuridad. Para arterias fijadas, realizar este paso a temperatura ambiente.
    Nota: Según aumenta la fluorescencia de la elastina. Eosina mancharán otras estructuras como el colágeno y el citoplasma de la célula si la muestra queda en la solución de tinción por tiempo prolongado. Si la coloración de otras estructuras es demasiado intensa, reducir la concentración de eosina a 0.3 μm o repita el lavado.
  2. Lave la arteria 3 x en PBS 1 x
    1. Para fijadas arterias: la arteria para la proyección de imagen de montaje.
      PRECAUCIÓN: la proyección de imagen de recipientes no presurizados no permite la recuperación de cualquier información cuantitativa geométrica. Cuando se requieren cantidades absolutas, estos deberán obtenerse siempre en vivas y bajo presión de las arterias. Ratios de volumen pueden obtenerse en las arterias no presurizado con este método.
      1. Coloque dos piezas de doble adhesivo de cinta 1-1.5 cm de separación en un objeto de vidrio. Cinta adhesiva doble es aproximadamente de 100 μm de espesor. Aplicar una o más capas de cinta adhesiva para que coincida con el diámetro de la arteria al ser montado.
      2. Colocar 10-20 μl de PBS en el cristal del centro de la Plaza y la arteria en la gota de PBS.
        Nota: La gota debe ser tan pequeña y plana como sea posible para evitar presionar la arteria fuera de posición cuando el resbalón de la cubierta de montaje.
      3. Colocar el cubreobjetos y presionar sobre la cinta de doble pegamento.
      4. Llenan el depósito entre el cubreobjetos y el objeto de vidrio de 1 x PBS. Rellenar cada hora para evitar el secado de la muestra.
  3. Obtener imagen-pilas para el colágeno y la elastina densidades de volumen utilizando un objetivo de 20 X con NA > 1 para cubrir tanto de la pared arterial como sea posible sin dejar de tener una buena resolución óptica (Figura 2D, 2 G y 2 H).
    Nota: Utilice un objetivo de inmersión de agua para proyección de imagen de las arterias fijadas bajo un cubreobjetos y un objetivo de proyección de imagen de las arterias vitales de inmersión de agua. Si el objetivo no tiene un collar de corrección para corregir el espesor del cubreobjetos, asegúrese de que coincida con el cubreobjetos con el objetivo. Preferiblemente utilizar tamaños de pixel óptima y el espaciado de z. Calcular usando la calculadora de Nyquist (paso 3.3.1.1.). Como alternativa, utilice un tamaño de píxel mínimos de 300 nm y z-espaciado de 1 μm. Se recomienda obtener tres imágenes a lo largo de la longitud de la arteria para permitir al usuario determinar variabilidad intraensayo.
  4. Elastina de imagen utilizando 820 nm de excitación luz y emisión recoger utilizando unas 30-60 nm ancho bandpass filtro centrado a 520 nm.
  5. Colágeno de imagen usando la luz de excitación de 990 nm para evitar cualquier excitación de elastina y otras proteínas autofluorescent y recoger la emisión utilizando filtro de 10-30 nm ancho pasabanda centrado en 495 nm.
  6. Ahorrar pilas de imagen de cada canal por separado como archivos TIFF

8. imagen análisis para la extracción de elastina y colágeno densidades de volumen usando Ilastik

  1. Convertir TIFF imagen las pilas a HDF5 con Fiji28,35 haga clic en seleccionar archivo | Guardar como... HDF5.
  2. Crear dos carpetas de archivos de datos en el disco duro del ordenador, de elastina, uno para las pilas de colágeno imagen, respectivamente. Copia pilas de imagen correspondiente a la carpeta correspondiente.
  3. Crear dos nuevos proyectos de Ilastik en el software de Ilastik, uno de elastina, de colágeno, respectivamente.
    1. Abrir Ilastik | Crear nuevo proyecto | clasificación de píxeles | nuevo proyecto | agregar datos de y seleccione imagen carpeta creada en paso 8.2.
      Nota: Siga al asistente de Ilastik.
  4. Importar un montón de imágenes en 3D para entrenar el software.
    1. Seleccione el applet de datos de entrada | zona principal espacio de trabajo | Ficha de datos RAW | Agregar nuevo... | Añadir imágenes separadas y elija los datos de la imagen deseada
  5. Elija las características en el software.
    1. Applet de selección abierta | Seleccionar la función de que abre un nuevo diálogo. Para detalles véase la figura 5A .
  6. Añadir por lo menos dos etiquetas utilizando el botón de Añadir etiqueta bajo el subprograma de capacitación.
    Nota: Cada etiqueta corresponde a un tipo de objeto que debe ser separado. En este trabajo, se utilizan tres etiquetas para elastina: elastina propia, puntos brillantes (para excluir) y el fondo (para excluir).
  7. Dibujar etiquetas sobre la pila de la imagen raw con el pincel de pintura estilo herramienta de anotación.
    1. Seleccione la etiqueta adecuada: haga clic en la herramienta pincel y comienzo de dibujo.
  8. Sugerirán el Ilastik analizar la pila de la imagen y buscar características similares haciendo clic en Habilitar Live Update.
  9. Revise cuidadosamente el mapa de predicción (figura 5).
    Nota: El proceso de imagen a un mapa de predicción completa se muestra en la figura 5. Ilastik utiliza el mapa de predicción para segmentar la imagen pila según que etiqueta un píxel es más probable ser asociado (figura 5).
  10. Aplicar un umbral.
    1. Seleccione el applet de umbralización, elegir un método apropiado, etiqueta de entrada, suave, umbral tamaño parámetros de filtro y finalmente haga clic en aplicar.
      Nota: Este segrega las partes igualmente marcadas de la imagen en objetos discretos. Tejido altamente conectada, como la elastina y el colágeno no necesita ser segregado, por lo tanto, se aplica un umbral de 0,4 (el valor predeterminado es 0,5). Figura 5E y 5F ilustran el resultado de la aplicación de un umbral.
  11. Repetir la formación de Ilastik hasta que el resultado es satisfactorio (sólo de elastina, colágeno respectivamente es reconocido para los análisis respectivos).
    1. Con frecuencia el interruptor entre la formación y segmentación (y a veces también el umbral) applets durante este proceso. En la figura 6se muestra un ejemplo del efecto de la formación Ilastik.
  12. Lote analizar datos similares de la imagen: seleccionar lote predicción entrada selección y añadir los archivos importantes.
    Nota: El Ilastik es una colección de pilas de imágenes 3D de pseudo - 1 bit (máscaras de imagen) con 0 (cero) que denota la ausencia de elastina (o colágeno) y 1 (uno) que denota la presencia presente de salida (la profundidad de bits actual es de 8 bits).
  13. Verificar los resultados para cada pila imagen comparando visualmente las máscaras de imagen y los archivos de imagen raw.
  14. Optimizar la máscara Ilastik (pasos 8.4-8.9) y volver a analizar cualquier pilas de imagen con resultados insatisfactorios.
  15. Calcular densidades de volumen de elastina y colágeno de Ilastik máscaras de imágenes usando MATLAB
    1. Abrir el MATLAB.
    2. Elija la carpeta con las máscaras de imagen ilastik en MATLAB "carpeta actual" ventana.
    3. Copie la secuencia de comandos MATLAB de complementario 1 archivo en el editor de MATLAB y guarde el código como volumeCalculator.m en la carpeta MATLAB en el disco duro del ordenador.
    4. Entre tamaños de pixel y pixel de altura en las líneas de escritura
      pixelSize = 0.1230000 * 0.1230000; micron % * micras
      pixelHeight = 0,9; micron %
    5. Guardar la secuencia.
    6. Ir a la ventana de comandos MATLAB y entrar en "volumeCalculator (' ruta de acceso a datos ')" para cargar el script.
    7. Haga clic en entrar. Cada máscara de imagen ahora es resumir y multiplicado por el volumen (conocido) píxeles/voxel (dimensiones de un píxel multiplicada por la resolución del eje z). La salida de MATLAB es el volumen total de elastina y colágeno en cada pila de imagen.
  16. Guardar los resultados.

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Representative Results

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La laringe a la medida de presión para la proyección de imagen usada en este trabajo se muestra en la figura 1. Se prestó especial atención para el diseño de la laringe a i) la cámara con un pequeño volumen (2 mL) y ii) la posibilidad de colocación de la cánula cerca a y en paralelo con el fondo de cristal (figura 1B). La parte inferior de la cámara ajusta un 50 × 24 mm #1.5 vidrio cubreobjetos (reemplazable). El regulador de presión fue construido de una botella de vidrio de 1 L estándar y un esfigmomanómetro (brazalete retirado). Para una configuración de la laringe con requerimientos de flujo, se recomienda el uso de un regulador de presión del servo.

La figura 2 ilustra las posiciones recomendadas para la obtención de imágenes y pilas de imagen durante el experimento descrito en el protocolo. Para fines de Ilustración, una imagen de microscopía de transmisión de la arteria montada está incluida en la figura 2A. Longitud de nudo a nudo de la arteria montada es aproximadamente 1,6 mm. Se explora la arteria hasta que el diámetro más ancho se observa (figura 2B), y en este punto, el diámetro y espesor de pared determinado (figura 2). Además, una imagen de luz de transmisión de la arteria es incluida en la Figura 2D, mostrando la posición y recomienda el ancho de las pilas de imagen para la determinación de los microarchitectures de colágeno (Figura 2E) y elastina (figura 2F, pequeño Plaza de Figura 2D) así como las pilas de imagen para determinar densidades de volumen de elastina (figura 2 H) (plaza mayor, Figura 2D) y colágeno (figura 2). Usando este acercamiento, datos para la construcción de curvas de presión diámetro, seguidas por el cálculo de las curvas de tensión-deformación correspondientes pueden obtenerse mediciones de espesor de pared, el diámetro y la presión (figura 2).

Un solo ajuste exponencial de la relación tensión-deformación según Bloksgaard et al. 13 y referencias en este documento, proporciona el valor de β, una medida independiente de la geometría de la rigidez de la pared proporcional al incremental módulo de elasticidad, Einc. Cálculo Einc a las diferentes presiones que imágenes de colágeno y elastina se obtuvieron microarchitectures, permite un análisis directo de la relación entre los cambios de presión inducido en los microarchitectures de colágeno y elastina y el módulo elástico incremental a diferentes presiones (figura 3). La medición de ángulos de ramificación IEL y rectitud de colágeno se ilustra en la figura 4.

Importante para la interpretación de los datos mecánicos que comparan dos o más grupos de interés, por ejemplo hipertensos vs pacientes normotensos, es una determinación del contenido de elastina y colágeno. Para ello, se desarrolló un método de análisis automático en Ilastik, un software de análisis de imagen freeware que puede ser entrenado para reconocer ciertas características de la imagen. El flujo de trabajo en Ilastik se ilustra en la figura 5.

Para la detección automática de elastina y colágeno para las densidades de volumen, es importante que haya una buena relación señal a ruido en las imágenes obtenidas. En muestras humanas, autofluorescencia significativa del colágeno se observa a menudo además de la señal SHG de colágeno. Esto disminuye la relación señal a ruido para la detección de la elastina. La figura 6 ilustra cómo nueva capacitación del programa Ilastik puede resultar en mejor reconocimiento de las fibras de elastina fina en una muestra con colágeno significativo autofluorescencia en el "verde" / canal de elastina. Si el sangrado a través de la señal de la autofluorescencia en el canal SHG de colágeno son un problema, obtención de la señal de SHG usando un más largo longitud de onda de excitación puede ayudar. Si el canal de purga a través se produce después de la tinción con eosina, debe disminuirse la concentración de la solución aplicada de eosina. Eosina es lavar fácilmente, por lo que el lavado repetido de la muestra teñida puede disminuir demasiado la señal.

Figure 1
Figura 1 . Miógrafo de presión para la proyección de imagen de fluorescencia medida. (A) cámara perfusión con capilares de vidrio a los micromanipuladores, que está montado en un transductor de fuerza (fuerza longitudinal). (B) 2 mL de cámara. La flexión de 45° de la cánula facilita la proyección de imagen usando un microscopio invertido. Regulador de presión (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 . Combina presión miografía y fluorescencia estrategia de imagen. (A) transmisión luz la imagen de la arteria con la ilustración de (B) la exploración de todo el ancho de la arteria. El colágeno SHG se muestra en verde y elastina autofluorescencia en magenta. (C). diámetro de la luz Arterial (aquí 238 μm) y espesores de pared (aquí 17 y 18 μm superior e inferior, respectivamente) se determina en la región ecuatorial (mayor diámetro observado) de la arteria. (D) imagen luz transmisión de la arteria con la ilustración de la posición de las z-pilas obtenidas en una escala de 10-50 μm para la determinación de rectitud de colágeno (E), ángulos de ramificación (F) de la lámina elástica interna y (G) z-apilados en un 50-100 μm escala para la obtención de colágeno y elastina (H) las densidades de volumen. Imágenes B/C: altura 300 μm (bar 20 μm), E/F: 50 x 50 μm (barra 10 μm), G/H 130 × 130 × 30 μm (barra = 30 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 . Los cambios microestructurales en colágeno adventicial y la lámina elástica interna (IEL) y su relación con los módulos elástico incrementales circunferenciales en 20, 40 y 100 mmHg. (A) ángulos de ramificación de las fibras de elastina en el IEL. (B) rectitud de las fibras de colágeno adventitial cerca de la lámina elástica externa. p-valores y según los valores de F se determinaron mediante mediciones repetidas ANOVA unidireccional: p/F-values A: 0.0014/24.18, B: 0.0002/37.38. Ángulos de ramificación (C) IEL se correlaciona nonlinearly con Einc. (D) rectitud colágeno se correlaciona linealmente con Einc. Datos se muestran como promedio ± SE. microestructurales cambios (A y B y Axes de C y D) se determinaron en las arterias de resistencia 6 sometidas a imágenes vitales mientras Einc (C y D) fue calculado para 20 otras arterias sometidas a presión miografía en un estándar presión del miógrafo. Cada arteria estudiado fue de un individuo diferente. Esta figura ha sido modificada de Bloksgaard et al. 13. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 . Ilustración de las medidas de los ángulos de ramificación IEL y rectitud de colágeno en Fiji. (A) ángulos de ramificación IEL manualmente están marcados y medición utilizando la herramienta de ángulo de Fiji. (B) rectitud de colágeno se determina mediante el plugin de Fiji neurona J como el cociente de la longitud de extremo a extremo de una fibra de colágeno individual a través de una línea recta (blanco) dividido por la longitud real de extremo a extremo de la fibra (naranja). Tamaño de la barra: 20 μm.

Figure 5
Figura 5 . Flujo de trabajo de Ilastik. (A) ventana de selección de función con la indicación de las características. (B) imagen (C) etiquetas para fibras de elastina, puntos brillantes (no deseados) y fondo ejemplo marcado en rojo, verde y azul, respectivamente. (D) dando por resultado el mapa de predicción para la imagen (B) con las etiquetas indicadas en (C). (E) segmentación basada en el mapa de predicción en (D) antes de (E) y (F) después de la aplicación de un umbral de 0,5. Color amarillo muestra los píxeles conectados correspondientes a la función segregada (elastina). Tamaño de la barra: 25 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 . Imágenes de ejemplo antes y después de la optimización de la predicción de Ilastik mapa que muestra el efecto de volver a la formación Ilastik de reconocimiento de fibras de elastina en una muestra con fluorescencia de fondo alta de colágeno (óptima relación señal a ruido). (A) imagen original y (B) resultado del primer análisis de Ilastik, donde sobre todo las fibras de elastina fina (izquierda de la imagen B) no están incluidas en la segmentación (C) resultado después de la optimización del mapa de predicción. Tamaño de la barra: 25 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Este trabajo representa nuestra sugerencia para un estandarizada combinada presión y proyección de imagen de miografía enfoque, valioso para la evaluación simultánea de las propiedades mecánicas de las arterias de resistencia y cambios en la estructura de la arterial relacionados con la presión pared en un rango de presión de 0 a 100 mmHg. El enfoque presentado fue desarrollado usando equipo construido personalizado, sin embargo, puede utilizarse cualquier miógrafo de presión que cabe en un microscopio de fluorescencia de excitación de dos fotones, cuando el diseño de los equipos permite la proyección de imagen de la pared arterial. Debe prestarse especial atención a la forma, anchura y distancia de trabajo de los objetivos y las condiciones bajo las cuales se realizará la proyección de imagen. Microscopios verticales requieren el uso de agua sumergir objetivos, mientras que el uso de objetivos de inmersión de agua se recomienda para que microscopios invertidos evitar diferencias en los índices de refracción entre la muestra y el objetivo. Además, debe prestarse atención al espesor del cubreobjetos, aplicando una corrección de una falta de coincidencia entre el objetivo y el cubreobjetos con el collar de corrección en el objetivo (si existe) o comparando el espesor del cubreobjetos con el objetivo utilizado.

En el protocolo descrito, se aprovechó de la luz de baja energía, infrarrojo cercano autofluorescence imagen de elastina y colágeno SHG. Esto permite la proyección de imagen durante largos períodos de tiempo. En las arterias de resistencia humana utilizadas en este estudio, la IEL se compone de una red de fibra-como longitudinalmente alineada de elastina interconectados fibras13,33, similar a la estructura de la IEL de resistencia subcutánea humana arterias (hSCA)38,39. Cambios en los ángulos de ramificación de las fibras de elastina en el IEL fueron evaluadas y se utiliza para evaluar los cambios en la microarquitectura de la elastina junto con medidas de desenrollar gradual adventicial de fibras de colágeno con el aumento de las presiones37 y colágeno respectivamente. Imágenes para evaluar la elastina y el colágeno microarchitectures fueron obtenidas en la misma región de interés dentro de la pared arterial a diferentes presiones. Esto permite el análisis de medidas repetidas. Cuando sea posible, el investigador podría apuntar a la obtención de imágenes en por lo menos 3 regiones de interés, con imagen tamaños 10-50 μm en cada dimensión. Sin embargo, dependiendo de la muestra, especialmente el espesor de la pared arterial, un compromiso debe hacerse entre el número de regiones escaneadas de interés y la posible duración del experimento. En el caso de las arterias de resistencia humana pericárdica, las arterias permanecieron vivas durante al menos 8-12 h de experimentación. Varias regiones de interés la exploración permite la evaluación de intra-versus variabilidad entre muestra y así apoya la conclusión de los resultados obtenidos.

Es importante hacer notar para evitar inducir daño fototóxico, proyección de imagen usando alta potencia luz de excitación debe evitarse cuando se trabaja con muestras de tejido vivo. En vista de ello, se recomienda obtener las pilas de ampliación de imagen para el colágeno y la elastina densidades de volumen al final del protocolo experimental, o bien en muestras fijadas. Cuando se requieren cantidades absolutas de los componentes de la ECM, ningún efecto de este fijador en las densidades de volumen debe cuantificar y tener en cuenta. Fijación y permeabilización de las arterias permite además tinción de dianas intracelulares de interés cuando sea necesario. En este protocolo, coloración para elastina se realiza con eosina en el vivo de la arteria. Coloración de la elastina por sondas específicas (por ejemplo, alexa 633 hidrazida40) y colágeno (p. ej., CNA3541), se puede aplicar junto con otras manchas (por ejemplo, phalloidin42) o ADN, para facilitar la evaluación de densidades volumétricas y organización estructural de otras estructuras de interés en la pared arterial. Esta oportunidad puede brindar los laboratorios de investigación con microscopios confocales del solo-fotón una oportunidad para investigar los cambios microestructurales en las arterias de resistencia. Segmentos de la misma arteria pueden tratados bajo diferentes condiciones, fijo bajo presión y reflejados en una etapa posterior para comparar el efecto del tratamiento aplicado. Objetivos de interés deben visualizarse por proyección de imagen los barcos volver a canulado, volver a presión y manchados. La canulación y represurización es necesario cuando se consideran los cambios estructurales, como elastina no puede ser reparada y por lo tanto retroceso y alterar la estructura 3D de la arteria fijo43,44. El inconveniente de determinar cambios estructurales en las arterias fijadas es que varios segmentos deben fijarse para la comparación, y no se puede realizar análisis de medición repetida.

Los datos obtenidos usando proyección de imagen pueden ser utilizados directamente para calcular tensiones y estrés de pared y ayuda a entender la mecánica de la pared vascular, como se describe en Bloksgaard, M. et al13. En este trabajo, se aplicó un modelo matemático para caracterizar la rigidez intrínseca de la elastina y componentes de colágeno de la pared arterial y para estimar el colágeno reclutamiento cepas45,46 del calculado relaciones de tensión de tensión. Proyección de imagen de apoyo los resultados de la modelación matemática, que el colágeno en las arterias de resistencia humana ya fue reclutado en baja tensión circunferencial y el estrés de pared. Las medidas cuantitativas de la microarquitectura de elastina y colágeno se describe en este protocolo pueden ser más extendido, inspirada en el trabajo extenso realizado sobre arterias carótidas6,8,47, 48 , aorta y 49 7,9,10,50,51: análisis adicionales pueden incluir la evaluación de la distribución espacial y la microarquitectura del colágeno y fibras de elastina en las diferentes capas de la pared arterial, así como ángulos de orientación de la fibra (orientación con respecto al eje longitudinal). Bell et al. 15 dirigió la reorganización inducida por la presión de la IEL y colágeno adventicial, incluyendo un modelo de análisis de múltiples capas para calcular la rigidez y la tensión en cada capa de la pared arterial. Estos autores15 utilizar arterias de resistencia subcutánea humana obtenidas de voluntarios sanos y relacionados con la estructura y tensiones de la pared en 3 y 30 mmHg, respectivamente.

El método propuesto en este protocolo que motiva más investigaciones y desarrollo de modelos matemáticos microestructuralmente motivados para la comprensión de las propiedades mecánicas de las arterias de resistencia humana en salud y enfermedad. Con sus modificaciones del método para incluir también el colágeno y la elastina ángulos de orientación a lo largo del eje longitudinal, músculo liso de la célula volumen densidad, distribución espacial y orientación dentro de la distribución arterial de la pared, el colágeno y la elastina y orientación en medios de tunica y elastina organización y distribución en el adventitia de tunica, los datos de proyección de imagen pueden alimentar el avance desarrollo de modelos matemáticos, facilitando la comprensión de los procesos de remodelación en la hipertensión arterial, diabetes y la síndrome metabólico. Asimismo, según lo sugerido por Chen y Kassab de la microcirculación coronaria52,53, modelos basados en la microestructura de las arterias de resistencia humana pueden proporcionar predicciones de arteriales respuestas mecánicas en el macro (toda arteria) y micro-(structure) mecánicos para cada componente. Tales modelos deben basarse en datos cuantitativos de los parámetros estructurales y propiedades mecánicas de las capas individuales y componentes de la pared arterial de arterias procedentes de voluntarios sanos y pacientes que sufren de diferentes enfermedades, recibir diferentes tratamientos farmacológicos. Los datos se recogen de manera estandarizada y en comparación entre personas con diferente factor de riesgo, enfermedad y tratamiento de perfiles. El método tiene el potencial para ayudar a entender cómo la enfermedad y tratamientos médicos afectan la microcirculación humana.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen el danés biomédica Molecular Imaging Center en la Facultad de Ciencias naturales de la Universidad de Dinamarca Meridional, para el uso de laboratorios y microscopios. Kristoffer Rosenstand y Ulla Melchior son reconocidos por la excelente asistencia técnica con la presión miografía y proyección de imagen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine Science Tools 15401-12
Fine Science Tools 11251-23
Nikon SMZ800N
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. 761028 for dissection purpose
Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark 1.63, 2.13, 210mm
Smiths medical Intl, UK
Ethicon Ethilon 11-0
Custom built DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt
Mettler toledo
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. B3259
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. A7030
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. C5670
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. G7021
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. E3889
Merck Millipore, Hellerup, Denmark 1.00496.9010 Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution 
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. H3784
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. P9666
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. P5655
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. M2643
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S2002
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S5886
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S5761
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. 1.06462
Gibco, ThermoFisher Scientific 10010015
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. PHR1423
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. Z370525
 Tocris Bioscience, Bristol, UK 538944
Nikon Custom built
Spectra Physics, Mountain View, CA
Nikon CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27
Nikon CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75
Hamamatsu, Ballerup, Denmark H7422P-40
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). ChromaET 460 nm long pass dichroic
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). Chroma ET402/15X 
Scotch TM
coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip

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Evaluación de colágeno y elastina Microarchitectures dependiente de la presión en las arterias de resistencia viva, humana por microscopía de fluorescencia etiqueta-libre
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Bloksgaard, M., Thorsted, B., Brewer, J. R., De Mey, J. G. R. Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (134), e57451, doi:10.3791/57451 (2018).More

Bloksgaard, M., Thorsted, B., Brewer, J. R., De Mey, J. G. R. Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (134), e57451, doi:10.3791/57451 (2018).

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