Summary
Descriviamo la rilevazione di NLRP3 inflammasome attivazione su base cellulare utilizzando la microscopia a fluorescenza e la macchiatura per active caspasi-1 e l'adattatore, ASC. Un test di rilascio di lattato deidrogenasi è presentato per rilevare pyroptotic lisi su base di popolazione. Queste tecniche possono essere adattate per studiare molti aspetti della biologia inflammasome.
Abstract
Inflammasomes sono innate piattaforme di segnalazione immuni che sono necessari per il controllo di successo di molti organismi patogeni, ma anche promuovono infiammatori e malattie autoinfiammatorie. Inflammasomes sono attivati da recettori di riconoscimento modello citosolico, compresi i membri della famiglia del recettore (NLR) NOD-come. Questi recettori oligomerizzazione al rilevamento di stimoli microbici o danni associati. Successiva assunzione della proteina adattatore ASC forma un inflammasome microscopicamente visibili complessi, che attiva la caspasi-1 attraverso l'auto-attivazione indotta da vicinanza. Dopo l'attivazione, caspasi-1 fende il pro-IL-1 β e pro-IL-18, che porta alla attivazione e secrezione di queste citochine pro-infiammatorie. Caspasi-1 media anche la forma infiammatoria della morte delle cellule, chiamata pyroptosis, che presenta la perdita di lisi delle cellule e l'integrità della membrana. Caspasi-1 fende gasdermin D, rilasciando il frammento N-terminale che forma i pori della membrana plasmatica, che porta alla lisi osmotica.
In vitro, l'attivazione di caspasi-1 può essere determinato dall'etichettatura derivate da midollo osseo macrofagi con la sonda di attività caspase-1 FAM-YVAD-FMK e identificando le cellule con anticorpi contro la proteina dell'adattatore ASC. Questa tecnica permette l'identificazione di inflammasome formazione e attivazione di caspasi-1 nelle singole celle utilizzando la microscopia a fluorescenza. Pyroptotic la morte delle cellule può essere rilevata misurando il rilascio di lattato deidrogenasi citosolica nel mezzo. Questa procedura è semplice, conveniente ed eseguita in un formato di piastra a 96 pozzetti, consentendo l'adattamento per lo screening. In questo manoscritto, indichiamo che l'attivazione del inflammasome NLRP3 di Nigericina conduce alla co-localizzazione della proteina dell'adattatore ASC e attiva caspase-1, che conduce a pyroptosis.
Introduction
Inflammasome-ha mediato l'infiammazione è una componente critica della difesa contro organismi patogeni1, ma anche sottende l'eziologia di molte malattie2. La risposta infiammatoria ad una vasta gamma di infezioni viene attivata dal rilevamento citosolico di agente patogeno connesso pattern molecolari (PAMPs) o danni associati pattern molecolari (Damp). Recettori di riconoscimento di pattern (PRR), compresi i membri della famiglia del recettore NOD-like (NLR), oligomerizzazione dopo il rilevamento di questi PAMP e DAMPs. Questo innesca la formazione di un complesso multiproteico chiamato il inflammasome, che contiene il PRR, la proteina dell'adattatore apoptosi-collegata speck-come proteina contenente un dominio di caspase-reclutamento del C-terminale (scheda) (ASC) e il pro-forma di caspasi-13,4. Questo complesso permette di prossimità-indotto auto-attivazione di caspasi-1. Attiva la caspasi-1 quindi conduce ad un insieme di eventi che caratterizzano la cellula infiammatoria morte via pyroptosis. Tali eventi includono: la scissione e il rilascio di citochine infiammatorie IL-1 β e IL-18, esocitosi lisosoma con rilascio di lysosomal contenuto nello spazio extracellulare, condensazione nucleare e gasdermin D clivaggio. Il dominio N-terminale rilasciato di gasdermin D inserisce nella membrana plasmatica, formando pori che causano la rottura della membrana del plasma ed il rilascio del contenuto infiammatorio, oltre a togliere una nicchia protettiva per agente patogeno replica5, 6 , 7.
Qui, ci concentriamo sul inflammasome NLRP3 ben studiato. L'attivazione del inflammasome NLRP3 avviene attraverso un processo di due passaggi8. Il primo passo di "adescamento" avviene attraverso il riconoscimento di recettori Toll-like (TLR) di un prodotto microbico. Questo è replicato nell'impostazione del laboratorio usando LPS per stimolare TLR4. Questa stimolazione sopraregola NLRP3 e pro-IL-1 β attraverso segnalazione di NF-kB. Adescamento inoltre licenze NLRP3 attraverso meccanismi non-trascrizionale inducendo la sua deubiquitinazione9,10 e fosforilazione o defosforilazione di specifici residui11,12.
Il secondo segnale per l'attivazione NLRP3 è pensato per coinvolgere fattori mitocondriali, specie reattive dell'ossigeno, efflusso di potassio e calcio segnalazione, anche se un meccanismo unificante per l'attivazione NLRP3 rimane inafferrabile8. NLRP3 attivato oligomerizes attraverso le interazioni tra i suoi domini NACHT e reclute ASC tramite associazione dei domini pirina (PYD)13. In ogni cella, questi complessi macromolecolari formano un singolo fuoco microscopicamente visibile. ASC è stata originariamente identificata come una proteina di KDa 22 che si forma un "granello" durante l'apoptosi di cellule umane di leucemia e denominata apoptosi-collegata speck-come proteina che contiene una carta14. In seguito fu stabilito che ASC reclute pro-caspase-1 attraverso l'interazione della scheda di ASC con la carta del pro-caspase-1, formando il inflammasome15.
Non tutte le NLRs richiedono la presenza di ASC per indurre l'attivazione di caspasi-1. A differenza di NLRP3, NLRC4 e NLRP1b hanno carta domini e può reclutare direttamente pro-caspase-1 tramite interazioni di CARD-CARD per indurre l'attivazione di caspasi-1. In assenza di ASC, attiva la caspasi-1 rimane diffusa in tutto il citosol e non forma un singolo fuoco. Questa diffusa attiva caspasi-1 è sufficiente per indurre la morte delle cellule di pyroptotic, ma è in grado di elaborare pro-IL-1 β13,16.
In questo manoscritto, discuteremo due modi per valutare l'attivazione inflammasome. Il primo utilizza l'attività fluorescente della sonda, FAM-YVAD-FMK, che lega la famiglia delle proteasi caspasi-1. Questa famiglia comprende caspasi-1, ma anche del mouse caspase-11 e umano caspase-4 e caspase-5. Utilizzando i macrofagi dai topi caspase-1/11 in tutti gli esperimenti, si affronterà la specificità di questa sonda. Questo metodo può essere combinato con l'anticorpo etichettatura dei componenti inflammasome, che descriveremo anche. Visualizzazione al microscopio permette l'identificazione delle singole celle contenenti active caspasi-1 e oligomerico ASC. Utilizzando questo metodo, i ricercatori saranno in grado di determinare dove nella cascata di formazione inflammasome loro manipolazioni della cellula ospite o l'organismo patogeno sotto studio hanno un effetto. Ad esempio, si può distinguere se un determinato intervento previene l'assunzione di ASC per la NLRP3 complesse o le destinazioni il successivo reclutamento e attivazione di caspasi-117. Esaminando i risultati dell'attivazione di caspasi-1 come la secrezione di IL-1 β non sarebbe in grado di distinguere tra queste due possibilità. Inoltre, la secrezione di IL-1 β potrebbe essere alterata senza alterare la capacità delle cellule di attivare le caspasi-1 e subire pyroptotic delle cellule morte16.
Il secondo metodo misura il rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) nella cella surnatante, che si verifica durante la lisi del macrofago pyroptotic seguendo l'attivazione di caspasi-1, come descritto in precedenza. Questo secondo metodo è un approccio basato sulla popolazione come bene è misurato il rilascio di LDH in tutto l'edificio. Questo semplice approccio permette l'analisi rapida (30 min di incubazione) di campioni per determinare se c'è morte caspase-1-mediata delle cellule e può essere eseguito in un formato di piastra a 96 pozzetti.
Questi metodi sono complementari, ciascuno con vantaggi diversi ed entrambi sono facilmente suscettibili di modifiche. Ad esempio, trattamento del macrofago con composti di peso molecolare mirata prima inflammasome stimolazione può essere utilizzato per studiare il ruolo di alcune proteine possono avere su come controllare le risposte infiammatorie.
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Protocol
Tutte le procedure di animali sono state approvate e condotti sotto Università di Washington istituzionale Animal Care e Comitato uso linee guida.
1. raccolta del midollo osseo
- Asetticamente rimuovere il femore e la tibia da un mouse e pulire le ossa utilizzando strumenti sterili. Mettere le ossa pulite in 5 mM HEPES, Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) + 10% siero bovino fetale (FBS, DMEM-10 completa) + 0,2 mg/mL L-Glutammina + 0,05 mM 2-mercaptoetanolo + 50 mg/mL Gentamicina solfato + 10.000 U/mL di penicillina/streptomicina e incubare la tubo sul ghiaccio per 15 min.
- Rimuovere i giunti a sfera prossimale e distale usando le forbici. Inserire un ago 25 G collegato ad una siringa da 10 mL riempita con il mezzo nella cavità delle ossa. Scovare il midollo osseo utilizzando DMEM-10 completo. Risospendere eventuali grumi pipettando il mezzo su e giù delicatamente.
- Centrifugare le cellule per 10 min a 300 x g e contare il numero di celle utilizzando un emocitometro. A questo punto, o congelare le cellule usando 90% FBS + 10% di dimetilsolfossido (DMSO) o piastra le cellule in un 15cm di Petri per differenziare i macrofagi utilizzando L929 condizionata medio (punto 2.1).
2. differenziazione dei macrofagi derivate da midollo osseo
- Utilizzando il mezzo di differenziazione pre-riscaldato (21 mL di DMEM-10 completo e 9 mL di medium di cellulare condizionata L929 come descritto da Swanson et al. 18), mettere le cellule del midollo osseo in un 15cm non-tessuto cultura trattati di Petri (1.2-1.5 x 107 cellule). Incubare la piastra a 37 ° C e 5% CO2 per 7 giorni. Aggiungere un ulteriore 30 mL di mezzo di differenziazione alla piastra al giorno 3 o 4.
Nota: È importante non utilizzare piastre di coltura di tessuti trattato, come macrofagi sarà difficili da staccare e raccogliere. - Per raccogliere i macrofagi, lavare la piastra con tampone fosfato salino (PBS) e aggiungere 20 mL di PBS freddo + 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Incubare la piastra a 4 ° C per 10 min. raccolto le cellule pipettando il PBS + EDTA sopra le cellule e lavare la piastra con 10 mL di PBS. Combinare due lavaggi in due provette coniche da 15 mL.
- Centrifugare le cellule a 300 x g per 10 min e risospendere le cellule in 10 mL di rosso fenolo libero DMEM + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL L-Glutammina + 0,05 mM 2-mercaptoetanolo + 5% FBS (DMEM-5) e contare le celle utilizzando un emocitometro o un contatore Coulter. Mantenere le cellule su ghiaccio durante il conteggio.
- I macrofagi in piastre di coltura del tessuto rivestito a 2 x 105 cellule/mL del seme. Per esperimenti di microscopia, seme 1 mL di cellule sulle lamelle in 24 piatti ben. Per i test di rilascio LDH, seme 100 µ l di cellule in un piatto ben 96. Per il dosaggio LDH, seme 9 pozzi (3 pozzi non trattati, 3 pozzi con controlli 100% Lisi e 3 pozzi per lo stimolo sperimentale).
- Centrifugare la piastra ben 96 per 5 min a 300 x g per assicurarti che le cellule sono equamente distribuite tra il pozzo.
- Incubare la piastra durante la notte a 37 ° C + 5% CO2 prima di iniziare il processo di innesco.
3. priming
- Sostituire il supporto con mezzo fresco (DMEM-5) contenente 100 ng/mL LPS (500 μL del 24 ben piatto o 50 µ l per il 96 ben piatto).
Nota: Ci sono una varietà di variazioni strutturali in LPS, che influenzano la capacità di stimolare TLR4-mediata adescamento19. LPS da Salmonella minnesota R595 (Re) è disponibile da più fornitori ed è consigliato. - Incubare la piastra per 3 h a 37 ° C e 5% CO2.
4. attivazione del Inflammasome NLRP3 con Nigericina ed etichettatura con FAM-YVAD-FMK
- Rimuovere il mezzo e sostituirlo con 290 μL di DMEM-5 contenente 5 μM Nigericina e glicina di 5 mM. La glicina è aggiunto per ridurre la quantità di lisi cellulare che si verifica durante l'attivazione di caspasi-15. Incubare per 60 min a 37 ° C e 5% CO2. Utilizzare wild type e caspase-1 macrofagi carenti per garantire che l'etichettatura osservata è specifico per la caspasi-1.
- Durante gli ultimi 45 minuti, aggiungere 10 μL di 30 x FAM-YVAD-FMK, preparati secondo le istruzioni del produttore.
- Dopo 60 min, rimuovere il supporto e lavare le cellule tre volte per 5 minuti ciascuno con 1 mL di PBS freddo.
- Aggiungere 250 μL di paraformaldeide 2% ad ogni pozzetto e incubare in ghiaccio coperto con carta stagnola per 30 min.
- Durante gli ultimi 5 minuti, aggiungere 4 μL di macchia fluorescente dell'acido nucleico 0,2 mM per etichettare i nuclei. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) o altri coloranti utilizzabile anche all'etichetta del DNA.
- Lavare le cellule tre volte con 1 mL di PBS freddo e montare i coprioggetti sui vetrini microscopio usando 7 μL montaggio antislittamento mezzo. Indurisca il mezzo di montaggio tutta la notte prima di sigillare il coprioggetto per il vetrino da microscopio usando smalto.
- Immagine i macrofagi mediante microscopia confocale. Ex / Em per FAM-YVAD-FMK è 492/520nm e 642/661 per macchia fluorescente dell'acido nucleico. Assicurarsi di impostare il microscopio, tale che le cellule non trattate non mostrano alcun background macchiatura nel canale 488. In caso contrario, una colorazione di fondo FAM-YVAD-FMK sarà rilevato e non effettivo attiva caspase-1.
Nota: Il set-up microscopio è descritto nella sezione 6.
5. anticorpi
Nota: Per identificare le celle con gli anticorpi per rilevare ASC, seme, prime ed esporre le cellule a Nigericina identico alla sezione precedente. L'elaborazione in seguito è come segue:
- Lavare le cellule tre volte per 5 minuti ciascuno con 1 mL di PBS freddo. Aggiungere 250 μL di soluzione di permeabilizzazione e fissaggio. Incubare le cellule sul ghiaccio e coperto per 30 min.
- Lavare i macrofagi tre volte per 5 minuti ciascuno con 1 mL di tampone di lavaggio.
- Aggiungere 250 µ l di anticorpo primario contro ASC diluito 1: 500 nel tampone di lavaggio e incubare per 1h sul ghiaccio. Includere un vetrino coprioggetto che non riceve alcun anticorpo primario, ma riceverà solo secondario. Questo vetrino coprioggetti utilizzerà per impostare l'offset corretto durante l'installazione di microscopio.
- Lavare le cellule tre volte per 5 minuti ciascuno con 1 mL di tampone di lavaggio.
- Aggiungere 250 µ l di anticorpo secondario (colorante fluorescente coniugati-anti-topo di capra) diluito 1: 500 nel tampone di lavaggio e incubare per 1h sul ghiaccio. Aggiungere 4 μL di macchia fluorescente dell'acido nucleico 0,2 mM per gli ultimi 5 minuti di questa incubazione ai nuclei di etichetta.
- Lavare le cellule 3 x con 1 mL di tampone di lavaggio freddo e montare i vetrini coprioggetto sul microscopio diapositive utilizzando il mezzo di montaggio a antislittamento 7 μL. Indurisca il mezzo di montaggio tutta la notte prima di sigillare il coprioggetto per il vetrino da microscopio usando smalto trasparente.
- Macrofagi di immagine mediante microscopia confocale. Ex / Em per l'anticorpo secondario è 555/580 nm e 642/661 per acido nucleico fluorescente da' macchia (come descritto di seguito).
Nota: Etichettatura con FAM-YVAD-FMK e anticorpo etichettatura possa essere combinato per mostrare co-localizzazione di caspase-1 attivo e ASC. Per questo, seguire le condizioni per l'etichettatura di FAM-YVAD-FMK e quindi passare per il protocollo per l'ulteriore elaborazione di contrassegno dell'anticorpo.
6. imaging dei macrofagi con etichettati mediante microscopia confocale
Nota: Le cellule marcate possono essere visualizzate dopo i coprioggetti sono stato permesso di curare tutta la notte e sono stati sigillati per il vetrino da microscopio con lo smalto. Qui, imaging utilizzando un microscopio confocale è descritto. Le cellule possono essere visualizzate anche da microscopia di fluorescenza standard.
- Porre il vetrino con le cellule di controllo non trattato sul tavolino del microscopio e concentrare il microscopio sulle cellule.
- Utilizzando il microscopio Look Up Table (LUT) impostazioni, regolare l'offset tale che non c'è nessun FAM-YVAD-FMK la macchiatura positiva nelle cellule non trattate. Questo processo può essere eseguito anche utilizzando la caspasi-1 carenti macrofagi.
Nota: L'offset deve essere regolato per ogni canale utilizzato nell'esperimento, ma impostare l'offset corretto è più critica per il canale di FAM-YVAD-FMK e canali dell'anticorpo fluorescente. L'offset per il canale di DNA è meno critica. Una volta che l'offset è stato impostato, non modificare questa impostazione per il resto dell'esperimento. - Passare alla diapositiva al campione Nigericina trattato. Trovare un campo che contiene entrambe le celle che sono positivi e negativi per la macchiatura FAM-YVAD-FMK. Regolare il piano di formazione immagine del canale FAM-YVAD-FMK per l'aereo che ha la massima intensità di macchiatura positiva. Normalmente questo sarà il piano dove è ripreso il centro della messa a fuoco inflammasome.
- Regolare il guadagno in modo che i fuochi sono visibili nelle cellule che hanno nuclei condensati. Dopo l'impostazione offset e guadagno, lasciare queste impostazioni per il resto della sessione di imaging.
Nota: Un modo semplice per determinare se una cella è pyroptotic è osservando la morfologia nucleare. Cellule con attiva la caspasi-1 hanno arrotondato e nuclei condensati, mentre i nucleoli sono visibili nelle cellule senza l'attivazione di caspasi-1 e la morfologia nucleare è simile a quelle delle cellule non trattate. - Raccogliere immagini di 5 campi selezionati in modo casuale a 100x ingrandimento totale. Normalmente questo si tradurrà in circa 40 celle per ogni immagine. Ripetere questo processo per ogni campione.
- Contare il numero di cellule in ogni immagine utilizzando software di analisi di immagine. Poi contare il numero di cellule che hanno la macchiatura positiva di FAM-YVAD-FMK. Rappresentano il livello di attivazione di caspasi-1 come la percentuale di cellule positive FAM-YVAD-FMK.
7. analisi del rilascio LDH
Nota: Per il test di rilascio LDH, seme e prime di che le cellule come descritto nella sezione precedente, ad eccezione utilizzare una piastra ben 96. Non rimuovere il supporto dopo l'innesco.
- Aggiungere 50 μL di DMEM-5 contenente 10 μM Nigericina ai pozzi sperimentali e 50 μL DMEM-5 per i pozzetti di controllo Lisi spontanei e 100%. Non aggiungere glicina in questo esperimento, poiché l'obiettivo è quello di misurare la lisi cellulare. Incubare per 60 min a 37 ° C e 5% CO2.
- Dopo 30 min, aggiungere 10 μL di tampone di lisi 10 x 100% Lisi controllo pozzetti e aggiungere 10 μL di DMEM-5 altri pozzetti. Durante questa incubazione, rimuovere 1 flaconcino di mix di substrato (1,5 mL di substrato liofilizzato) e 1 aliquota di tampone del saggio (~ 12 mL) dal freezer e lasciarli scongelare protetta dalla luce a temperatura ambiente.
Nota: Il mix di substrato contiene un sale di tetrazolio (iodonitro-tetrazolium viola), che viene convertito in un prodotto di formazano rosso. - Dopo l'incubazione totale 60 min, centrifugare la piastra per 5 min a 500 x g a 10 ° C. Trasferire 50 μL del surnatante in un piatto fondo piatto chiaro. Durante questo tempo, aggiungere 12 mL di tampone nella fiala di mix di substrato e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti prima dell'uso.
- Aggiungere 50 µ l di substrato in ogni pozzetto e incubare per 30 min al buio. Sono medie pozzi soli per valori vuoti. Controllare la targhetta dopo 15 min per assicurarsi che il segnale non supererà il limite di rilevamento del lettore della piastra.
- Dopo 30 min, aggiungere 50 μL di soluzione di arresto (1 M di acido acetico) e misurare OD490 utilizzando un lettore di piastra.
- Calcolare la percentuale di lisi cellulare utilizzando la seguente formula:
Citotossicita % = ((Experimental-Spontaneous) / (massimo-spontanea)) × 100
Sperimentale: le cellule Nigericina trattato; spontaneo: non trattata di cellule; massima: cellule esposte al buffer di lisi
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Representative Results
Per rilevare l'attivazione di caspasi-1 dopo l'esposizione a Nigericina, le cellule sono state elaborate come descritto nella sezione protocollo. Abbiamo combinato sia FAM-YVAD-FMK e ASC anticorpo etichettatura al fine di dimostrare che ASC e attiva caspase-1 co-localizzano dopo l'attivazione inflammasome NLRP3-mediata. Figura 1A Mostra che i macrofagi di tipo selvaggio esposti a 5 μM Nigericina formazione di un focus ASC nella regione perinucleare. Questi fuochi contengono anche attiva caspase-1 visto dalla co-localizzazione di ASC con FAM-YVAD-FMK. Le cellule che sono positive per attiva caspase-1 avranno condensazione nucleare mostrando che queste cellule sono in fase di pyroptosis. Figura 1B Mostra che mentre i macrofagi di topi deficienti di caspase-1/11 hanno la formazione di un fuoco ASC, non hanno alcun attivo caspasi-1 associato questo focus, come mostrato dall'assenza di macchiatura FAM-YVAD-FMK. I nuclei di queste cellule non sono condensati, che indica che non c'è nessun pyroptotic delle cellule morte che si verificano. Immagini sono state scattate utilizzando un microscopio confocale a scansione con un 63 X obiettivo a immersione in olio. Immagini sono state salvate come file TIFF senza qualsiasi ulteriore elaborazione.
Al fine di determinare il livello di morte delle cellule che è associato con l'esposizione a Nigericina, abbiamo effettuato un'analisi del rilascio LDH il surnatante della cultura. La figura 2 Mostra che i macrofagi di tipo selvaggio subiscano morte delle cellule dopo l'esposizione al Nigericina. Al contrario, macrofagi carenti in caspase-1 non rilasciano LDH nel surnatante delle cellule, che indica che le cellule siano intatte.
Figura 1: FAM-YVAD-FMK e anti-ASC etichettatura. (A) Wild type (WT) e macrofagi carenti di caspase-1/11 (c1/11- / -) (B) sono stati esposti a 5 μM Nigericina per 1h e analizzati per attiva caspase-1 mediante microscopia confocale utilizzando FAM-YVAD-FMK per rilevare attivo caspasi-1 e anti-ASC gli anticorpi secondari primari e capra-anti-mouse per rilevare ASC focus formazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: risultati del dosaggio LDH release. Wild type e macrofagi carenti caspase-1/11 sono stati esposti a 5 μM Nigericina per 1h e surnatante delle cellule è stata analizzata per la presenza di LDH. Dati sono mezzi ± SD di tre replicati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo manoscritto, abbiamo presentato due tecniche per esaminare inflammasome attivazione e la conseguenza dell'attivazione di caspase-1 che segue NLRP3 stimolazione in macrofagi murini derivanti dal midollo osseo. La prima tecnica consente al ricercatore di determinare il livello di attivazione di caspasi-1 su una base cellulare utilizzando il reporter fluorescente FAM-YVAD-FMK. Questo giornalista è altamente specifico per l'associazione della famiglia di caspase-1 degli enzimi, come si vede dall'assenza di colorazione nei macrofagi carenti caspase-1/11. Specificità è stato anche dimostrato da LaRock et al. nel loro manoscritto che descrive il ruolo della proteina Yersinia YopM sull'attivazione di caspasi-1. In loro manoscritto, mostrano che i fuochi FAM-YVAD-FMK si sovrappone con i fuochi che sono stati etichettati con anticorpi diretti contro caspase-117.
Come è il caso con qualsiasi esperimento, ci sono alcuni passaggi critici che devono essere seguite al fine di eliminare i falsi positivi. Prima di tutto, è imperativo utilizzare wild type e caspase-1/11 macrofagi carenti. Utilizzando questi tipi di due cellule, condizioni che portano alla colorazione aspecifica possono essere escluso da ulteriori analisi. In secondo luogo, come con qualsiasi sonda anticorpo o attività, analisi di etichettatura, è importante lavare accuratamente le cellule dopo colorazione con FAM-YVAD-FMK. Utilizzando tre lavaggi di 5 min, il livello del segnale di fondo è notevolmente ridotto. Un terzo passo critico si verifica durante l'installazione del microscopio confocale. Qui, è importante che le cellule non trattate etichettate con FAM-YVAD-FMK sono utilizzate per impostare l'offset del microscopio confocale in modo tale che nessuna macchiatura citoplasmica positiva è osservata nelle cellule non trattate. Quando questi passaggi sono seguiti, questa tecnica è uno strumento utile per valutare l'attivazione di caspasi-1 su una base cellulare.
Questo protocollo può essere modificato per soddisfare le esigenze dei ricercatori. Ad esempio, le cellule possono essere trattate con composti di piccolo peso molecolare a parecchi punti durante l'intero processo. Ciò consentirebbe per l'identificazione delle vie che modulano l'oligomerizzazione di NLR, il reclutamento di ASC o pro-caspase-1, o l'attivazione di caspasi-1 stesso. Le modifiche al presente protocollo devono essere tale che non attivano la caspasi-1 da sè. In questo caso, una curva dose-risposta del farmaco in questione è necessaria. Anche se ci siamo concentrati sull'attivazione del inflammasome NLRP3, questo protocollo utilizzabile anche per esaminare inflammasomes innescato da altri PRRs. Un'altra modifica che abbiamo incluso in questo manoscritto è la combinazione di FAM-YVAD-FMK macchiatura con anticorpo etichettatura dei componenti inflammasome. Indichiamo che c'è co-localizzazione dell'adattatore inflammasome ASC con attiva la caspasi-1. Una limitazione di questo metodo come descritto, è che richiede l'accesso a un microscopio confocale. Tuttavia, una strategia correlata per rilevare formazione fuoco ASC da citometria a flusso è stato segnalato20,21.
La seconda tecnica che abbiamo discusso consente il rilevamento rapido di lisi delle cellule usando un'analisi di rilascio LDH. È importante notare che il rilascio di LDH indica perdita di lisi delle cellule e l'integrità della membrana plasmatica, che inoltre si presenta durante molte altre forme di morte cellulare e non sono specifico per pyroptosis. Tuttavia, l'uso di cellule carenti caspase-1 può identificare lisi cellulare caspasi-1-dipendente, una caratteristica di definizione di pyroptosis.
Un passaggio fondamentale in questo protocollo (soprattutto quando si utilizza un agente infettivo) è quello di centrifugare la piastra dopo la semina le cellule in un piatto ben 96. Centrifugazione della piastra permette uguale distribuzione dei macrofagi attraverso l'intera superficie del pozzo. Con equa distribuzione, ogni macrofago sarà esposti allo stesso numero di batteri. Senza centrifugazione, l'effetto del menisco del liquido nel pozzo porterà a più macrofagi accumulando al bordo del pozzo. Questo porterebbe a inferiore al previsto molteplicità di infezione MOI (MOI) vicino alla parete del pozzo e più in alto rispetto a quello previsto nel centro del pozzo.
Un potenziale svantaggio di test di rilascio LDH è che esso misura Lisi a livello di popolazione e presso un unico punto di tempo per test. Un approccio alternativo è quello di quantificare l'assorbimento di coloranti impermeant cella da microscopia, che identifica la perdita di integrità della membrana su base singola cella. Combinato con live cell imaging piattaforme, questo approccio è in grado di fornire anche una valutazione temporale di pyroptosis22. Coloranti ad esempio ioduro di propidio piccolo DNA-legantesi fluorescenti o bromuro di etidio può passare attraverso il poro gasdermin D, associare acidi nucleici cellulari e reagiscono in5,22,23. Formazione del poro e l'assorbimento di questi coloranti piccoli precede temporalmente lisi cellulare terminale. Lisi permette l'assorbimento di coloranti più grande e la perdita di proteine cellulari grandi come LDH. L'uso di glicina sperimentalmente può disgiungere poro formazione da lisi, come glicina non blocca gasdermin D-mediata poro formazione, piccola tintura l'assorbimento o la secrezione di IL-1 β, ma glicina prevenire rapida lisi e LDH release5,22 , 23 , 24. suggeriamo compreso glicina in esperimenti di colorazione FAM-YAVD-FMK per prevenire la completa perdita di integrità della membrana, ma glicina deve essere omesso quando si misura pyroptotic rilascio di LDH.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse di divulgare
Acknowledgments
Tutta la microscopia è stato fatto presso il centro di microscopia di W. M. Keck con supporto di Nathaniel Peters e con il supporto del premio NIH S10OD016240. S.l.f. è supportato da NIH K08AI119142 e R21AI130281. Si ringraziano il Dr. Richard Flavell e Dr. Brad Cookson per topi caspase-1/11 e Dr. Brad Cookson per la condivisione di attrezzature e strutture di laboratorio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E-MEM | ATCC | 30-2003 | For growing L929 cells |
| NCRC clone 929 (L929) | ATCC | CCL-1 | |
| Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde |
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay | Fisher Scientific | PR-G1780 | Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid |
| FAM-YVAD-FMK | Immunocytochemistry Technologies | 98 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Invitrogen | 11960044 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium | Invitrogen | 14190144 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin | Invitrogen | 26140079 | Heat inactivated at 55°C for 50 min |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| ProLong Gold Mounting Medium | Invitrogen | p36934 | Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46 |
| goat anti-mouse ALEXA555 | Invitrogen | A-21422 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Invitrogen | 11344041 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| TO-PRO-3 Iodide | Invitrogen | T3605 | far-red fluorescent nucleic acid stain |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratoy | 000664 | |
| caspase-1/11-/- mouse | Jackson Laboratory | 016621 | |
| Leica SP8X Confocal Microscope | Leica | ||
| Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) | List Biologicals | 434 | |
| anti-ASC clone 2EI-7 | Millipore-Sigma | 04-417 | |
| beta-mercapto-ethanol | Millipore-Sigma | M6250-10ML | |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650-5X10ML | |
| EDTA | Millipore-Sigma | E5391 | |
| Spectramax M3 plate reader | Molecular Devices | 5000414 |
References
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