이 프로토콜에서는 안전 하 고 효율적인 절차 CD133 수정+ 조 혈 줄기 세포. 제시 비 바이러스 성, 자기 polyplex 기반 접근 자기 공명 화상 진 찰을 통해 관리 셀 제품 모니터링에 관해서는 뿐만 아니라 치료 줄기 세포 효과의 최적화를 위한 기반을 제공할 수 있습니다.
동안 CD133+ 조 혈 줄기 세포 (SCs) 재생 의학 분야에서 높은 잠재력을 제공 하기 위해 입증 되었습니다, 그들의 낮은 유지 비율 관찰된 대규모 세포 사망률 부상된 조직에 주입 후 매우 제한 된 치료 효과입니다. 이러한 한계를 극복 하기 위해 우리가 그들의 관리에 앞서 적당 한 셀 엔지니어링에 대 한 비 바이러스 성 기반된 프로토콜을 확립 하고자 했다. 인간의 CD133 수정+ 셀의 대상 잠재력 뿐만 아니라 통풍 관 효율 및 안전에 관하여 해결 SCs 예측에 관한 (미르) 로드 자석 polyplexes를 사용 하 여 표현. 우리의 프로토콜에 의존, 우리는 CD133 동안 80-90%의 높은 미르 통풍 관 비율을 달성할 수 있는+ 줄기 세포 속성을 받지 않습니다. 또한,이 수정 된 세포는 자기 대상의 옵션을 제공합니다. 우리 여기 CD133의 수정에 대 한 안전 하 고 매우 효율적인 절차 설명+ SCs. 우리는 줄기 세포 치료 효과의 최적화에 대 한 자기 공명 영상 (MRI)을 통해 관리 셀 제품의 모니터링을 위한 표준 기술 제공이 접근을 기대 합니다.
CD133+ 이종 줄기 재생 의학에 대 한 잠재력 약속 된 조상 세포 인구를 대표 하는 SCs. 그들의 조 혈, 내 피, 및 조직적 분화 잠재적인1,2,3 수는 CD133+ 세포, 예를 들어, 차별화를 통해 neovascularization 프로세스에 기여 하 으로 새로 형성 선박 및 프로-신생 paracrine 메커니즘4,5,,67에 의해 신호의 활성화.
30 개 이상의 승인 된 임상 시험 (ClinicalTrails.gov)에서 그들의 높은 잠재력에도 불구 하 고 그들의 치료 결과 중인 여전히 논쟁 적인 토론4. 실제로, SCs의 임상 응용 프로그램 낮은 보존 관심과 대규모 초기 세포 죽음5,,89의 기관에 의해 방해 된다. 추가 CD133의 엔지니어링+ SCs 사전 이식 이러한 난제를 극복 도움이 될.
효율적인 세포 치료에 대 한 전제 조건 치료 관련 셀10engraftment를 향상 시키기 위해 대규모 초기 세포 죽음의 감소 될 것 이다. 현재 연구 시연 첫 1-2 h, 이식된 세포 유형의 독립적인 동안 매우 끼얹는다 뇌와 심장 등 장기에 90-99%의 엄청난 셀 손실 또는 응용 프로그램 경로11,12,13 14,15,16,17,18,19,,2021. 관심22,23,,2425,26의 사이트에 대상 셀에 혁신적인 비-침략 적 전략을 가능 하 게 SC 마그네틱 나노 (MNPs)를 사용 하 여 라벨 고 동시에 셀 MRI27 (MPI) 이미징 자성 입자를 사용 하 여 모니터링 하는 것을 허용 한다. 가장 효율적인 vivo에서 정 맥 주입23,,2428 후 셀 지도 보다 로컬 관리 후 사용한 셀 보존 대상 적용 자성된 셀 연구 . 따라서, 우리의 그룹 superparamagnetic 산화 철 나노 입자29의 구성 된 배달 시스템을 설계. 이 기술로, CD133+ SCs와 인간 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs)는 대상 효율적으로 수, 여 체 외에 시도30,31.
사우스 캐롤라이나 요법에 대 한 또 다른 장애물 초기 세포 죽음32에 기여 하는 이식 후 영향을 받는 조직의 적대적인 염증 성 환경입니다. 여러 사전 컨디셔닝 연구 뿐만 아니라 치료 관련 미르의 응용 프로그램은 테스트33; 그것은 성공적으로 입증 되었습니다 안티 apoptotic 미르 생체 외에서 apoptosis를 억제 고 vivo에서세포 engraftment33을 강화. 이 작은 분자, 20-25의 뉴클레오티드로 구성 메신저 RNAs (mRNAs)의 posttranscriptional 변조기로 서 중요 한 역할을 하 고 따라서 줄기 세포 운명과 행동34를 영향을. 또한, 미르 세 도입 호스트 게놈34에 원치 않는 안정적인 통합을 하지 마십시오.
기본 SCs에 핵 산 (NAs)의 효율적인 도입에 대 한 현재 시도 주로 재조합 바이러스8,35기반으로 합니다. 높은 transfection 효율에도 불구 하 고 재조합 바이러스 조작은 벤치를 머리 맡 번역, 예를 들면, 통제 유전자 발현, pathogenicity, immunogenicity, 및 insertional mutagenesis35에 대 한 주요 장애물이 선물 ,36. 따라서, 폴리머 기반 구조 등 비 바이러스 성 전달 시스템 개발에 중요 하다. 그 중에서 polyethylenimine (페이) 저하, 세포질 통풍 관에서에서 보호 하기 위해 나 결로 등 미르에 대 한 혜택을 제공 하는 유효한 배달 차량 나타내고 endosomal 통해 세포내 릴리스 탈출37,38. 또한, 미르-페이 단지 임상 시험39높은 생체 적합성을 설명 했다. 따라서, 우리의 배달 시스템은 biotinylated의 구성 분기 25 kDa 페이는 streptavidin 입히는 MNP 코어30,,3140에 바인딩된.
이 원고에서는 CD133의 (i)는 수동 격리를 설명 하는 포괄적인 프로토콜 소개+ 사우스 캐롤라이나 사우스 캐롤라이나 제품과의 효율적이 고 부드러운 transfection 전략 (ii)의 상세한 묘사와 인간의 골 수 (BM) 기부에서 한 자석으로 비 바이러스 성 고분자 기반 배달 시스템 CD133의 유전 공학에 대 한+ SCs 미르를 사용 하 여. CD133+ SCs 격리 되며 표면 항 체 기반 자기 활성화 셀 정렬 (맥) 시스템을 사용 하 여 인간의 sternal BM aspirates에서 자석으로 농축. 이후에, 세포 생존 능력 뿐만 아니라 셀 순도 cytometry 사용 하 여 분석 된다. 그 후, 미르/PEI/MNP 단지 준비가 CD133+ SCs는 페. transfection 후 18 h, 통풍 관 효율성과 transfection SC 마커 표현과 세포 생존 능력에의 영향 분석 된다. 또한, transfection 복잡 한 화합물의 세포내 분포의 평가 4 색 레이블 및 구조화 조명 현미경 (SIM)를 사용 하 여 수행 됩니다.
최근 몇 년 동안, CD133+ SCs 등장 유망한 세포 인구로 SC 기반 요법으로 입증 단계 I, II, 및 III에 대 한 임상 시험43,44,,4546, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , …
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 연방 교육부 및 연구 (FKZ 0312138A 및 FKZ 316159), EU 구조 기금 (ESF/IVWM-B34-0030/10와 ESF/IVBM-B35-0010/12), 주 Mecklenburg 서쪽 Pomerania 독일과 DFG (DA1296/2-1)에 의해 지원 되었다는 독일 심장 재단 (F/01/12), BMBF (VIP + 00240) 고 젖은 기초. 또한, F.H. 및 오후는 FORUN 프로그램의로 스톡 대학 의료 센터 (889001)에 의해 지원 됩니다.
7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies | 7060 | 3% |
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-853 | |
anti-CD34-FITC (clone: AC136) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-081-001 | |
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1) | BD Biosciences | 560178 | |
rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin | ATTO-TEC GmbH | AD 565-71 | |
BD FACS LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
BD FACSDiva Software 6.1.2 | BD Biosciences | ||
BSA | Sigma-Aldrich GmbH | A7906 | |
CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-049 | |
collagenase B | Roche Diagnostics GmbH | 11088831001 | |
counting chamber | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | ||
Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 | Ambion | AM17120 | |
Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit | Mirus Bio | MIR 9650 | |
DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 10104159001 | (100 U/mL) |
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope | Carl Zeiss Jena GmbH | ||
FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-059-901 | |
bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | O10241 | |
aqueous mounting medium; Fluoroshield | Sigma-Aldrich GmbH | F6182 | |
density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 89048-932 | |
MACS magnet holder; MACS MultiStand | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
MACS pre-separation filter | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | 30 µm |
MACS separation column (MS / LS) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-201 / 130-042-401 | |
MACS permanent magnet; MACS Separator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-302 | |
Millex-HV PVDF Filter | Merck | SLHV013SL | 0.45 μm |
mouse IgG 2b-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-215 | |
amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
human lymphocyte separating medium; Pancoll | Pan Biotech GmbH | P04-60500 | density: 1.077 g/mL |
PBS | Pan Biotech GmbH | P04-53500 | without Ca and Mg |
PEI | Sigma-Aldrich GmbH | 408727 | branched; 25 kDa |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100 μg/mL |
PFA | Merck Schuchardt OHG | 1040051000 | |
unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 | Ambion | AM17110 | |
RBC lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
RNAse decontamination solution; RNaseZap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Pan Biotech GmbH | P04-16500 | |
recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100 | Stemcell Technologies | 2690 | |
serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000 | Stemcell Technologies | 9800 | |
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles | Promega Corporation | Z5481 | |
Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich GmbH | T8154 | 0.4 % |
UltraPure EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | 0.5 M; pH 8.0 |
ZEN2011 software | Carl Zeiss Jena GmbH | ||
NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
Sonorex RK 100 SH sonicating water bath | Bandelin electronic | Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz |