Summary

Protocollo per il trasferimento di MicroRNA in adulto cellule staminali emopoietiche derivate da midollo osseo per abilitare ingegneria cellulare combinata con il Targeting magnetico

Published: June 18, 2018
doi:

Summary

Questo protocollo viene illustrata una procedura sicura ed efficace per modificare CD133+ cellule staminali ematopoietiche. L’approccio non-virale, magnetico presentato basato su polyplex può fornire una base per l’ottimizzazione degli effetti terapeutici delle cellule staminali anche per quanto riguarda il monitoraggio del prodotto somministrato cella tramite risonanza magnetica.

Abstract

CD133, mentre+ cellule staminali ematopoietiche (SCs) hanno dimostrate di fornire alto potenziale nel campo della medicina rigenerativa, loro tariffe bassa ritenzione dopo iniezione nei tessuti danneggiati, così come i tassi di mortalità osservati massiccia delle cellule portano a molto limitato gli effetti terapeutici. Per superare queste limitazioni, abbiamo cercato di stabilire un protocollo di base non-virali per l’ingegneria cellulare adeguata prima della loro somministrazione. La modifica di CD133 umano+ esprimendo SCs utilizzando polyplexes magnetico microRNA (miR) caricato è stato risolto per quanto riguarda l’efficienza di assorbimento e sicurezza, nonché il potenziale targeting delle cellule. Basandosi sul nostro protocollo, possiamo raggiungere velocità di assorbimento di miR alta di 80 – 90% mentre il CD133+ proprietà delle cellule staminali rimangono inalterate. Inoltre, queste cellule modificate offrono l’opzione di targeting magnetico. Descriviamo qui una procedura sicura ed altamente efficace per la modifica di CD133+ SCs. Ci aspettiamo che questo approccio per fornire una tecnologia standard per l’ottimizzazione degli effetti terapeutici delle cellule staminali e per il monitoraggio del prodotto somministrato cella tramite risonanza magnetica (MRI).

Introduction

CD133+ SCs rappresentano una popolazione eterogenea di cellule staminali e progenitrici con promettenti potenzialità per la medicina rigenerativa. Loro potenziale di2,di1,di differenziamento ematopoietico, endoteliale e miogenico3 consente il CD133+ cellule, per esempio, a contribuire ai processi di neovascolarizzazione attraverso la differenziazione nel formare nuovi vasi e l’attivazione di pro-angiogenica segnalazione di paracrine meccanismi4,5,6,7.

Nonostante il loro elevato potenziale dimostrato in più di 30 studi clinici approvati (ClinicalTrails.gov), il loro risultato terapeutico è ancora sotto discussione discutibile4. Infatti, un’applicazione clinica di SCs è ostacolata dalla bassa ritenzione nell’organo di interesse e voluminosa iniziale delle cellule morte5,8,9. Ingegneria del CD133 addizionale+ SCs precedente trapianto potrebbe aiutare a superare queste sfide.

Un prerequisito per una terapia cellulare efficiente sarebbe la riduzione della morte massiccia delle cellule iniziali di attecchimento delle cellule terapeutiche rilevanti10. Studi attuali hanno dimostrato una perdita immensa cella del 90-99% in organi altamente perfusi come il cervello e il cuore durante i primi 1-2 h, indipendentemente dal tipo delle cellule trapiantate o applicazione route11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC di etichettatura usando nanoparticelle magnetiche (MNPs) consente una strategia innovativa non invasiva alle cellule bersaglio al sito di interesse22,23,24,25,26 e contemporaneamente consente il cellulare monitoraggio utilizzando MRI27 e particelle magnetiche (MPI) di imaging. Il più efficiente in vivo studi applicando magnetizzata cella cella utilizzata ritenzione di targeting dopo amministrazione locale anziché orientamento di cella dopo iniezione endovenosa23,24,28 . Di conseguenza, il nostro gruppo progettato un sistema di consegna costituito da nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico29. Con questa tecnica, CD133+ SCs e cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVECs) potrebbero essere efficientemente orientate, come dimostrato da in vitro tentativi30,31.

Un altro ostacolo per terapie SC è l’ostile ambiente infiammatorio del tessuto colpito dopo trapianto, che contribuisce al iniziale delle cellule morte32. Oltre a diversi studi di pre-condizionamento, l’applicazione di terapeutici rilevanti Mir era testata33; è stato dimostrato con successo che anti-apoptotiche miRs inibire l’apoptosi in vitro e che permettono di migliorare il engraftment delle cellule in vivo33. Queste piccole molecole, composti da 20-25 nucleotidi, svolgono un ruolo cruciale come modulatori di posttranscriptional di RNA messaggeri (mRNA) e quindi influenzano il destino e il comportamento di cellule staminali34. Inoltre, l’introduzione esogena di miRs evitare l’integrazione stabile indesiderato nel genoma ospite34.

Tentativi in corso per introduzione efficiente degli acidi nucleici (NAs) nella primaria SCs sono principalmente basati su virus ricombinante8,35. Nonostante l’efficienza di trasfezione alta, manipolazione del virus ricombinante presenta un grosso ostacolo per una traduzione in panchina al capezzale, per esempio, espressione genica incontrollabile, patogenicità, immunogenicità e mutagenesi inserzionale35 ,36. Di conseguenza, sistemi di erogazione non virali come costrutti a base di polimeri sono fondamentali per sviluppare. Tra quelli, polyethylenimine (PEI) rappresenta un veicolo di consegna valido che offre vantaggi per miRs quali condensa NA di proteggere dalla degradazione, l’assorbimento cellulare, e rilascio intracellulare attraverso endosomal fuga37,38. Inoltre, complessi di miR-PEI ha dimostrato un’elevata biocompatibilità in studi clinici39. Di conseguenza, il nostro sistema di consegna è costituito da un biotinilati ramificati 25 kDa PEI associato a un rivestite con streptavidina MNP-core30,31,40.

In questo manoscritto, presentiamo un protocollo completo che descrive (i) l’isolamento manuale di CD133+ SC da umane del midollo osseo (BM) donazione con una dettagliata caratterizzazione del prodotto SC e (ii) una strategia efficace e delicata la transfezione di un sistema di consegna a base di polimeri magneticamente non-virali per l’ingegneria genetica del CD133+ SCs utilizzando miRs. CD133+ SCs sono isolati e magneticamente arricchita da aspira BM umano sternale utilizzando una superficie anticorpo-basato magnetico-attivato delle cellule (MACS) sistema di smistamento. In seguito, l’attuabilità delle cellule come pure la purezza delle cellule è analizzata mediante citometria a flusso. Successivamente, miR/PEI/MNP complessi sono preparati e CD133+ SCs transfected. 18 ore dopo la trasfezione, l’efficienza di assorbimento e l’impatto della transfezione sulla vitalità delle cellule e l’espressione marcatore di SC sono analizzati. Inoltre, la valutazione della distribuzione intracellulare dei composti complessi transfezione viene eseguita utilizzando etichettatura quadricromia e microscopia strutturata di illuminazione (SIM).

Protocol

BM umano sternale per isolamento delle cellule è stata ottenuta da donatori informati, che hanno dato il loro consenso scritto di utilizzare i loro campioni per la ricerca secondo la dichiarazione di Helsinki. Il comitato etico dell’Università di Rostock ha approvato lo studio presentato (reg. n. A 23 2010, prolungato nel 2015). 1. cella preparazione Nota: Utilizzare eparina sodica (BM 250 IU/mL) per impedire la coagulazione per esame di BM. CD13…

Representative Results

Il protocollo presentato descrive un isolamento manuale e arricchimento magnetico del CD133 BM-derivati umani+ SCs con una cellula indipendente virus successivi ingegneria strategia, come una tecnologia non invasiva per in vitro manipolazione cellulare e in vivo strumento di monitoraggio. Questa tecnologia di isolamento di tre fasi consente una separazione delle MNCs da BM sternal pre-digeriti median…

Discussion

Negli ultimi anni, CD133+ SCs sono emersi come una popolazione di cellule promettente per terapie basate su SC come evidenziato da diversi di fase I, II e III studi clinici43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 <su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero federale dell’educazione e ricerca Germania (FKZ 0312138A e FKZ 316159), la Pomerania Mecklenburg-occidentale dello stato con fondi strutturali (FSE/IVWM-B34-0030/10 e FSE/IVBM-B35-0010/12) e il DFG (DA1296/2-1), la Fondazione tedesca del cuore (F/01/12), BMBF (VIP + 00240) e la Fondazione umida. Inoltre, F.H. e P.M. sono supportati dal foro con. rar programma di Rostock University Medical Centre (889001).

Materials

7-AAD BD Biosciences 559925
Acetic Acid with Methylene Blue Stemcell Technologies 7060 3%
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3) Miltenyi Biotec GmbH 130-090-853
anti-CD34-FITC (clone: AC136) Miltenyi Biotec GmbH 130-081-001
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1) BD Biosciences 560178
rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin ATTO-TEC GmbH AD 565-71
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
BSA Sigma-Aldrich GmbH A7906
CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit Miltenyi Biotec GmbH 130-097-049
collagenase B Roche Diagnostics GmbH 11088831001
counting chamber Paul Marienfeld GmbH & Co. KG
Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Ambion AM17120
Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit Mirus Bio MIR 9650
DNAse I Roche Diagnostics GmbH 10104159001 (100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Carl Zeiss Jena GmbH
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec GmbH 130-059-901
bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit Thermo Fisher Scientific O10241
aqueous mounting medium; Fluoroshield Sigma-Aldrich GmbH F6182
density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube Greiner Bio-One 89048-932
MACS magnet holder; MACS MultiStand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS pre-separation filter Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407 30 µm
MACS separation column (MS / LS) Miltenyi Biotec GmbH 130-042-201 / 130-042-401
MACS permanent magnet; MACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-042-302
Millex-HV PVDF Filter Merck SLHV013SL 0.45 μm
mouse IgG 2b-PE Miltenyi Biotec GmbH 130-092-215
amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
human lymphocyte separating medium; Pancoll Pan Biotech GmbH P04-60500 density: 1.077 g/mL
PBS Pan Biotech GmbH P04-53500 without Ca and Mg
PEI Sigma-Aldrich GmbH 408727 branched; 25 kDa
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 100 U/mL, 100 μg/mL
PFA Merck Schuchardt OHG 1040051000
unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Ambion AM17110
RBC lysis buffer eBioscience 00-4333-57
RNAse decontamination solution; RNaseZap Thermo Fisher Scientific AM9780
human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Pan Biotech GmbH P04-16500
recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100 Stemcell Technologies 2690
serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000 Stemcell Technologies 9800
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles Promega Corporation Z5481
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich GmbH T8154 0.4 %
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 0.5 M; pH 8.0
ZEN2011 software Carl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH sonicating water bath Bandelin electronic Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz

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Hausburg, F., Müller, P., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting. J. Vis. Exp. (136), e57474, doi:10.3791/57474 (2018).

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