Denne protokollen illustrerer en sikker og effektiv fremgangsmåte for å endre CD133+ blodkreft stamceller. Presentert ikke-viral, magnetiske polyplex-basert tilnærming kan gi grunnlag for optimalisering av terapeutiske stamcelleforskningen effekter så vel som for overvåking administrert celle produktet via magnetisk resonans imaging.
Mens CD133+ blodkreft stamceller (SCs) har vist seg for å gi høyt potensial innen regenerativ medisin, deres lav oppbevaring priser etter injeksjon i skadet vev som observerte massiv celle dødelighet føre til svært begrenset terapeutisk effekt. For å overvinne disse begrensningene, forsøkte vi å etablere en ikke-viral basert protokoll egnet cellen engineering før sin administrasjon. Endring av menneskelig CD133+ uttrykke SCs benytter microRNA (miR) lastet magnetiske polyplexes ble behandlet med hensyn til opptak effektivitet og sikkerhet, samt målretting potensialet i cellene. Stole på våre protokoll, kan vi oppnå høy miR opptak priser for 80 – 90%, mens CD133+ stamcelleforskningen egenskaper forbli upåvirket. Videre tilbyr disse endrede cellene muligheten for magnetisk målretting. Vi beskriver her en trygg og svært effektiv fremgangsmåte for endring av CD133+ SCs. Vi forventer denne tilnærmingen å gi en standardteknologi for optimalisering av terapeutiske stamcelleforskningen effekter og overvåking av administrert celle produktet via magnetisk resonans imaging (MRI).
CD133+ SCs representerer en heterogen stammen og stamfar celle befolkning med lovende potensial for regenerativ medisin. Deres blodkreft endothelial og myogenic differensiering potensielle1,2,3 gjør CD133+ celler, f.ekså bidra til neovascularization prosesser gjennom differensiering i nylig dannet fartøy og aktivering av pro-angiogenic signalering av paracrine mekanismer4,5,6,7.
Til tross for sitt høye potensial i mer enn 30 godkjente kliniske studier (ClinicalTrails.gov), er terapeutiske utfallet fremdeles under kontroversiell diskusjon4. Faktisk er en klinisk anvendelse av SCs hindret av lav oppbevaring i organ for interesse og massiv første celle død5,8,9. Ekstra prosjektering av CD133+ SCs før transplantasjon kunne hjelpe overvinne disse utfordringene.
En forutsetning for en effektiv cellen terapi ville være reduksjon av massiv første celledød å forbedre engraftment av terapeutiske relevante celler10. Aktuelle studier vist en enorm celle tap av 90-99% i svært perfused organer som hjernen og hjertet under den første 1-2 h, uavhengig av hvilken transplantert cellen eller programmet ruten11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC merking bruker magnetisk nanopartikler (MNPs) gjør en nyskapende ikke-invasiv strategi til målcellene til området av interesse22,23,24,25,26 og samtidig gir cellen overvåking MRI27 og magnetiske partikler imaging (MPI). Den mest effektive i vivo studier bruk magnetisert celle målretting brukte celle oppbevaring etter lokal administrasjon fremfor celle veiledning etter intravenøs injeksjon23,24,28 . Derfor laget vårt en levering system som består av superparamagnetiske jernoksid nanopartikler29. Med denne teknikken, CD133+ SCs og menneskelige umbilical blodåre endotelceller (HUVECs) kan effektivt rettes, som demonstrert av i vitro forsøk30,31.
En annen hurdle SC terapi er fiendtlig inflammatorisk miljøet av berørte vev etter transplantasjon, som bidrar til den første celle død32. I tillegg til flere pre condition studier var anvendelse av terapeutiske relevante miRs testet33; Det har vært vellykket demonstrert at anti-apoptotisk miRs hemmer apoptose i vitro og forbedre celle engraftment i vivo33. Disse små molekyler, består av 20-25 nukleotider, spiller en avgjørende rolle som posttranscriptional modulatorer av messenger RNAs (mRNAs), og dermed påvirke stamcelleforskningen skjebne og atferd34. Videre eksogene innføring av miRs unngå uønskede stabil integrering i vert genomet34.
Nåværende forsøk for effektiv introduksjon om nukleinsyrer (NAs) i primære SCs er hovedsakelig basert på rekombinant virus8,35. Til tross for høy transfection effektiviteten presenterer rekombinant virus manipulasjon en stor utfordring for en benken til sengen oversettelse, f.eks, ukontrollerbare genuttrykk, virusets, immunogenisitet og insertional mutagenese35 ,36. Derfor er ikke-viral leveringssystemer som polymer-baserte konstruksjoner avgjørende for å utvikle. Blant dem, polyethylenimine (PEI) representerer en gyldig levering kjøretøy tilbyr fordeler for miRs NA kondens å beskytte fra fornedrelse, mobilnettet opptak, og intracellulær utgivelse gjennom endosomal rømme37,38. Videre demonstrert miR-PEI komplekser en høy biocompatibility i kliniske studier39. Derfor levering systemet består av en biotinylated forgrenet 25 kDa PEI bundet til en streptavidin-belagt MNP kjerner30,31,40.
I dette manuskriptet presenterer vi en omfattende protokoll som beskriver (i) manuell isolering av CD133+ SC fra human benmarg (BM) donasjon med en detaljert karakterisering av SC produktet og (ii) en effektiv og skånsom transfection strategi for en magnetisk ikke-viral polymer-baserte leveringssystem for genteknologi av CD133+ SCs benytter miRs. CD133+ SCs er isolert og magnetisk beriket fra menneskelige sternal BM aspirates bruker en overflate antistoff-baserte magnetiske-aktivert celle sortering (Mac) system. Etterpå er celle levedyktigheten samt celle renhet analysert ved hjelp av flowcytometri. Deretter miR/PEI/MNP komplekser er forberedt og CD133+ SCs er transfekterte. 18 h etter hva, opptak effektiviteten og virkningen av transfection på SC markør uttrykk og celle levedyktighet analyseres. Videre utføres evaluering av intracellulær fordelingen av transfection komplekse forbindelser med firefargers merking og strukturert belysning mikroskopi (SIM).
De siste årene, CD133+ SCs har dukket opp som en lovende celle befolkningen for SC-basert behandling som dokumentert av flere fase I, II og III kliniske studier43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , <…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Federal Utdannings og forskning Tyskland (FKZ 0312138A og FKZ 316159), til delstaten Mecklenburg-Vorpommern med EU Structural Funds (ESF/IVWM-B34-0030/10 og ESF/IVBM-B35-0010/12) og DFG (DA1296/2-1), den Tyske Heart Foundation (F/01/12), BMBF (VIP + 00240) og fuktig Foundation. I tillegg støtter F.H. og PM av FORUN programmet i Rostock University Medical Centre (889001).
7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies | 7060 | 3% |
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-853 | |
anti-CD34-FITC (clone: AC136) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-081-001 | |
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1) | BD Biosciences | 560178 | |
rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin | ATTO-TEC GmbH | AD 565-71 | |
BD FACS LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
BD FACSDiva Software 6.1.2 | BD Biosciences | ||
BSA | Sigma-Aldrich GmbH | A7906 | |
CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-049 | |
collagenase B | Roche Diagnostics GmbH | 11088831001 | |
counting chamber | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | ||
Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 | Ambion | AM17120 | |
Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit | Mirus Bio | MIR 9650 | |
DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 10104159001 | (100 U/mL) |
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope | Carl Zeiss Jena GmbH | ||
FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-059-901 | |
bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | O10241 | |
aqueous mounting medium; Fluoroshield | Sigma-Aldrich GmbH | F6182 | |
density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 89048-932 | |
MACS magnet holder; MACS MultiStand | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
MACS pre-separation filter | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | 30 µm |
MACS separation column (MS / LS) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-201 / 130-042-401 | |
MACS permanent magnet; MACS Separator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-302 | |
Millex-HV PVDF Filter | Merck | SLHV013SL | 0.45 μm |
mouse IgG 2b-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-215 | |
amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
human lymphocyte separating medium; Pancoll | Pan Biotech GmbH | P04-60500 | density: 1.077 g/mL |
PBS | Pan Biotech GmbH | P04-53500 | without Ca and Mg |
PEI | Sigma-Aldrich GmbH | 408727 | branched; 25 kDa |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100 μg/mL |
PFA | Merck Schuchardt OHG | 1040051000 | |
unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 | Ambion | AM17110 | |
RBC lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
RNAse decontamination solution; RNaseZap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Pan Biotech GmbH | P04-16500 | |
recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100 | Stemcell Technologies | 2690 | |
serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000 | Stemcell Technologies | 9800 | |
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles | Promega Corporation | Z5481 | |
Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich GmbH | T8154 | 0.4 % |
UltraPure EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | 0.5 M; pH 8.0 |
ZEN2011 software | Carl Zeiss Jena GmbH | ||
NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
Sonorex RK 100 SH sonicating water bath | Bandelin electronic | Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz |