Detta protokoll illustrerar ett säkert och effektivt förfarande för att ändra CD133+ hematopoetiska stamceller. Den presenterade icke-virala, magnetiska polyplex synsätt kan utgöra grund för optimering av terapeutiska stamceller effekter samt för övervakning av administrerade cell produkten via magnetisk resonanstomografi.
Medan CD133+ hematopoetiska stamceller (SCs) har visat sig ge hög potential inom regenerativ medicin, deras låga retentionsfrekvenserna efter injektion i skadade vävnader samt de observerade massiva cell dödstalen leda till mycket begränsade terapeutiska effekter. För att övervinna dessa begränsningar, försökte vi upprätta en icke-virala baserat protokoll för lämplig cell engineering före deras administration. Modifiering av mänskliga CD133+ uttrycker SCs använder mikroRNA (miR) laddade magnetiska polyplexes togs upp avseende upptag effektivitet och säkerhet samt inriktning potentialen i cellerna. Förlitar sig på våra protokoll, kan vi uppnå hög miR upptag priser på 80 – 90% medan CD133+ stamceller egenskaper påverkas. Dessutom erbjuder dessa modifierade celler alternativet av magnetiska inriktning. Vi beskriver här en säker och mycket effektiv förfarandet för ändring av CD133+ SCs. Vi förväntar oss detta tillvägagångssätt ger en standardteknik för optimering av terapeutiska stamceller effekter och för övervakning av administrerade cell produkten via magnetisk resonanstomografi (MRT).
CD133+ SCs utgör en heterogen stammen och progenitor cell befolkning med lovande potential för regenerativ medicin. Deras hematopoetiska, endotel och myogenic differentiering potentiella1,2,3 gör CD133+ celler, t.ex., att bidra till kärlnybildning processer genom differentiering till nyligen bildar fartyg och aktivering av proangiogena signalering av parakrin mekanismer4,5,6,7.
Trots deras hög potential som visats i mer än 30 godkända kliniska studier (ClinicalTrails.gov), pågår deras terapeutiska resultat fortfarande kontroversiell diskussion4. Faktiskt hämmas en klinisk tillämpning av SCs av låg retention i organ av intresse och massiva första cell death5,8,9. Ytterligare konstruktion av CD133+ SCs tidigare transplantation kunde hjälpa övervinna dessa utmaningar.
En förutsättning för en effektiv cellterapi skulle vara en minskning av den massiva första celldöd att förbättra engraftment av terapeutiska relevanta celler10. Aktuella studier har visat en enorm cellförlust 90 – 99% i högt perfunderade organ som hjärnan och hjärtat under de första 1 – 2 h, oberoende av vilken transplanterade celler eller programmet route11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC märkning använder magnetiska nanopartiklar (MNPs) möjliggör en innovativ icke-invasiv strategi till målcellerna till platsen av intresse22,23,24,25,26 och samtidigt tillåter cell övervakning med hjälp av MRI27 och magnetiska partikel imaging (MPI). Den mest effektiva i vivo studier tillämpa magnetiserade cell inriktning använda cellen retention efter lokal administrering stället cellen vägledning efter intravenös injektion23,24,28 . Därför utformat vår grupp ett system bestående av superparamagnetiska järnoxid nanopartiklar29. Med denna teknik, CD133+ SCs och mänskliga navel ven endotelceller (HUVECs) kunde effektivt riktas, vilket framgår av in vitro- försök30,31.
Ett annat hinder för SC terapier är den ogästvänliga inflammatoriska miljön i den drabbade vävnaden efter transplantation, vilket bidrar till den första cell död32. Förutom flera förkonditioneringen studier var tillämpningen av terapeutiskt relevant miRs testade33; Det har varit framgångsrikt visat att anti-apoptotiska miRs hämmar apoptos i vitro och förbättra cell engraftment i vivo33. Dessa små molekyler, som består av 20 – 25 nukleotider, spela en avgörande roll som postttransskriptionell modulatorer av messenger RNA (mRNA), och därmed påverka stamceller öde och beteende34. Dessutom exogena införandet av miRs undvika oönskad stabil integrering i den mottagande genom34.
Nuvarande försök för effektiv införandet av nukleinsyror (NAs) i primära SCs är mestadels baserade på rekombinanta virus8,35. Trots den höga transfection effektiviteten presenterar rekombinanta virus manipulation ett stort hinder för en bänk-till-sängbord översättning, t.ex., okontrollerbara genuttryck, patogenicitet, immunogenicitet och insertionsmutationer35 ,36. Icke-virala leverans system såsom polymerbaserade konstruktioner är därför viktiga att utveckla. Bland dem, polyethylenimine (PEI) representerar en giltig leveransfordon som erbjuder fördelar för miRs såsom NA kondens att skydda från nedbrytning, cellernas upptag, och intracellulära utsläpp via endosomal fly37,38. Dessutom visat miR-PEI komplex en hög biokompatibilitet i kliniska prövningar39. Vårt leveranssystem består därför av en biotinylerade Grenade 25 kDa PEI bunden till en streptividin-belagda MNP-core30,31,40.
I detta manuskript, presenterar vi ett omfattande protokoll som beskriver de manuella isoleringen av CD133+ SC från human benmärg (BM) donation med en detaljerad karakterisering av SC produkten och (ii) en effektiv och skonsam transfection strategi för en magnetiskt icke-virala polymerbaserade leveranssystem för genteknik av CD133+ SCs använder miRs. CD133+ SCs har isolerats och magnetiskt berikad från mänskliga sternala BM enkelarmade använder en surface antikroppsbaserade magnetiska-aktiverad cell sortering (Mac) system. Efteråt, cellviabiliteten samt cell renhet analyseras med flödescytometri. Därefter miR/PEI/MNP komplex är beredda och CD133+ SCs är transfekterade. 18 h efter transfection, upptag effektivitet och inverkan av transfection på SC markör uttryck och cell lönsamhet analyseras. Vidare utförs utvärdering av intracellulära fördelningen av de transfection komplexa föreningarna med fyrfärg märkning och strukturerade belysningen mikroskopi (SIM).
Under de senaste åren, CD133+ SCs har dykt upp som en lovande cell befolkningen för SC-baserade terapier vilket framgår av flera fas I, II och III kliniska prövningar43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av det federala ministeriet för utbildning och forskning Tyskland (FKZ 0312138A och FKZ 316159), den statliga Mecklenburg-Västra Pomerania med EU: S strukturfonder (ESF/IVWM-B34-0030/10 och ESF/IVBM-B35-0010/12) och DFGEN (DA1296/2-1), den Tyska hjärtat Foundation (F/01/12), BMBF (VIP + 00240) och fuktig Foundation. Dessutom stöds F.H. och P.M. av FORUN Program av Rostock University Medical Centre (889001).
7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies | 7060 | 3% |
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-853 | |
anti-CD34-FITC (clone: AC136) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-081-001 | |
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1) | BD Biosciences | 560178 | |
rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin | ATTO-TEC GmbH | AD 565-71 | |
BD FACS LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
BD FACSDiva Software 6.1.2 | BD Biosciences | ||
BSA | Sigma-Aldrich GmbH | A7906 | |
CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-049 | |
collagenase B | Roche Diagnostics GmbH | 11088831001 | |
counting chamber | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | ||
Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 | Ambion | AM17120 | |
Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit | Mirus Bio | MIR 9650 | |
DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 10104159001 | (100 U/mL) |
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope | Carl Zeiss Jena GmbH | ||
FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-059-901 | |
bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | O10241 | |
aqueous mounting medium; Fluoroshield | Sigma-Aldrich GmbH | F6182 | |
density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 89048-932 | |
MACS magnet holder; MACS MultiStand | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
MACS pre-separation filter | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | 30 µm |
MACS separation column (MS / LS) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-201 / 130-042-401 | |
MACS permanent magnet; MACS Separator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-302 | |
Millex-HV PVDF Filter | Merck | SLHV013SL | 0.45 μm |
mouse IgG 2b-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-215 | |
amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
human lymphocyte separating medium; Pancoll | Pan Biotech GmbH | P04-60500 | density: 1.077 g/mL |
PBS | Pan Biotech GmbH | P04-53500 | without Ca and Mg |
PEI | Sigma-Aldrich GmbH | 408727 | branched; 25 kDa |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100 μg/mL |
PFA | Merck Schuchardt OHG | 1040051000 | |
unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 | Ambion | AM17110 | |
RBC lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
RNAse decontamination solution; RNaseZap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Pan Biotech GmbH | P04-16500 | |
recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100 | Stemcell Technologies | 2690 | |
serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000 | Stemcell Technologies | 9800 | |
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles | Promega Corporation | Z5481 | |
Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich GmbH | T8154 | 0.4 % |
UltraPure EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | 0.5 M; pH 8.0 |
ZEN2011 software | Carl Zeiss Jena GmbH | ||
NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
Sonorex RK 100 SH sonicating water bath | Bandelin electronic | Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz |