इस प्रोटोकॉल CD133+ टेम स्टेम कोशिकाओं को संशोधित करने के लिए एक सुरक्षित और कुशल प्रक्रिया दिखाता है । प्रस्तुत गैर वायरल, चुंबकीय polyplex आधारित दृष्टिकोण चिकित्सीय स्टेम सेल प्रभाव के अनुकूलन के लिए एक आधार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग के माध्यम से प्रशासित सेल उत्पाद की निगरानी के लिए प्रदान कर सकते हैं ।
जबकि CD133+ टेम स्टेम सेल (SCs) को अपक्षयी दवा के क्षेत्र में उच्च क्षमता प्रदान करने के लिए सिद्ध किया गया है, घायल ऊतकों में इंजेक्शन के बाद उनके कम प्रतिधारण दर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मनाया बड़े पैमाने पर सेल मौत की दर का नेतृत्व बहुत प्रतिबंधित उपचारात्मक प्रभाव । इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हम अपने प्रशासन से पहले उपयुक्त सेल इंजीनियरिंग के लिए एक गैर वायरल आधारित प्रोटोकॉल स्थापित करने की मांग की । microRNA (मीर) भरी हुई चुंबकीय polyplexes का उपयोग करते हुए मानव CD133+ व्यक्त SCs के संशोधन कुशलता और सुरक्षा के साथ ही कोशिकाओं की लक्ष्यीकरण क्षमता के संबंध में संबोधित किया गया था । हमारे प्रोटोकॉल पर निर्भर है, हम उच्च मीर हासिल कर सकते है 80 की दर-90% जबकि CD133+ स्टेम सेल गुण अप्रभावित रहते हैं । इसके अलावा, इन संशोधित कोशिकाओं चुंबकीय लक्ष्यीकरण का विकल्प प्रदान करते हैं । हम यहां CD133+ SCs के संशोधन के लिए एक सुरक्षित और अत्यधिक कुशल प्रक्रिया का वर्णन । हम इस दृष्टिकोण चिकित्सकीय स्टेम सेल प्रभाव के अनुकूलन के लिए और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) के माध्यम से प्रशासित सेल उत्पाद की निगरानी के लिए एक मानक प्रौद्योगिकी प्रदान करने के लिए उम्मीद है ।
CD133+ SCs एक विषम स्टेम और जनक सेल जनसंख्या का प्रतिनिधित्व करने के लिए आशाजनक चिकित्सा की क्षमता के साथ । उनके टेम, endothelial, और myogenic विभेद संभावित1,2,3 CD133+ कोशिकाओं को सक्षम बनाता है, उदाहरणके लिए, भेदभाव के माध्यम से neovascularization प्रक्रियाओं में योगदान करने के लिए नए जहाजों और समर्थक angiogenic के सक्रियकरण में paracrine तंत्र4,5,6,7द्वारा संकेतन के गठन ।
उनके उच्च क्षमता 30 से अधिक अनुमोदित नैदानिक परीक्षणों (ClinicalTrails.gov) में प्रदर्शन के बावजूद, उनके चिकित्सीय परिणाम विवादास्पद चर्चा4के तहत अभी भी है । दरअसल, SCs के एक नैदानिक आवेदन ब्याज और बड़े पैमाने पर प्रारंभिक सेल मौत5,8,9के अंग में कम प्रतिधारण द्वारा बाधा है । CD133 के अतिरिक्त इंजीनियरिंग+ SCs पूर्व प्रत्यारोपण इन चुनौतियों से उबरने में मदद कर सकता है ।
एक कुशल कोशिका चिकित्सा के लिए एक शर्त बड़े पैमाने पर प्रारंभिक कोशिका मृत्यु की कमी के लिए चिकित्सीय संबंधित10कोशिकाओं की engraftment बढ़ाने होगा । वर्तमान अध्ययन के एक विशाल सेल नुकसान का प्रदर्शन किया 90-99% अत्यधिक perfused अंगों में ऐसे मस्तिष्क और पहले 1 के दौरान दिल के रूप में-2 ज, प्रत्यारोपित सेल प्रकार या आवेदन मार्ग11,12,13 से स्वतंत्र ,14,15,16,17,18,19,20,21। SC लेबलिंग चुंबकीय नैनोकणों (MNPs) का उपयोग कर एक अभिनव गैर इनवेसिव रणनीति के लिए ब्याज की साइट के लिए कोशिकाओं को लक्षित करने में सक्षम बनाता है22,23,24,25,26 और साथ ही सेल की निगरानी एमआरआई27 और चुंबकीय कण इमेजिंग (MPI) का उपयोग करने की अनुमति देता है । vivo अध्ययन में सबसे कुशल चुंबकीय सेल लक्ष्यीकरण के बाद सेल मार्गदर्शन करने के लिए वरीयता में स्थानीय प्रशासन के बाद सेल प्रतिधारण इस्तेमाल किया नसों में इंजेक्शन23,24,28 . इसलिए, हमारे समूह superparamagnetic आयरन ऑक्साइड नैनोकणों29से मिलकर एक वितरण प्रणाली तैयार की । इस तकनीक के साथ, CD133+ SCs और मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVECs) कुशलतापूर्वक लक्षित किया जा सकता है, के रूप में द्वारा प्रदर्शन इन विट्रो 30,31प्रयास करता है ।
अनुसूचित जाति के उपचारों के लिए एक और बाधा प्रत्यारोपण के बाद प्रभावित ऊतक के शत्रुतापूर्ण भड़काऊ वातावरण है, जो प्रारंभिक कोशिका मृत्यु३२के लिए योगदान देता है । कई पूर्व कंडीशनिंग अध्ययन के अलावा, चिकित्सीय प्रासंगिक miRs के आवेदन३३का परीक्षण किया गया; यह सफलतापूर्वक प्रदर्शित किया गया है कि विरोधी अपोप्तोटिक miRs इन विट्रो में apoptosis को बाधित और vivo३३में सेल engraftment को बढ़ाने. इन छोटे अणुओं, 20 से बना-25 न्यूक्लियोटाइड, दूत RNAs (mRNAs) के posttranscriptional मॉडुलन के रूप में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और इस तरह स्टेम सेल भाग्य और व्यवहार३४को प्रभावित करते हैं । इसके अलावा, miRs की exogenous परिचय मेजबान जीनोम३४में अवांछित स्थिर एकीकरण से बचें ।
प्राथमिक SCs में न्यूक्लिक एसिड (NAs) के कुशल परिचय के लिए वर्तमान प्रयास ज्यादातर रिकॉमबिनेंट वायरस8,३५पर आधारित हैं । उच्च अभिकर्मक दक्षता के बावजूद, रिकॉमबिनेंट वायरस हेरफेर एक बेंच के लिए एक बड़ी बाधा-बेडसाइड अनुवाद प्रस्तुत करता है, जैसे, बेकाबू जीन अभिव्यक्ति, pathogenicity, immunogenicity, और प्रविष्टि mutagenesis३५ ,३६. इसलिए, गैर-वायरल वितरण प्रणालियों जैसे बहुलक आधारित निर्माण विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । उन में से, polyethylenimine (पी) miRs के लिए एक वैध वितरण वाहन की पेशकश के लिए लाभ का प्रतिनिधित्व करता है इस तरह के रूप में न करने के लिए क्षरण से बचाने के लिए, सेलुलर ऊपर उठाना, और endosomal एस्केप के माध्यम से intracellular रिलीज३७,३८। इसके अलावा, मीर-पी परिसरों नैदानिक परीक्षणों३९में एक उच्च असंगति का प्रदर्शन किया । इसलिए, हमारे वितरण प्रणाली एक biotinylated branched 25 केडीए पी एक streptavidin लेपित िं-कोर30,31,४०के लिए बाध्य कर रहे हैं ।
इस पांडुलिपि में, हम का वर्णन एक व्यापक प्रोटोकॉल वर्तमान (मैं) CD133 के मैनुअल अलगाव+ अनुसूचित जाति उत्पाद की एक विस्तृत लक्षण वर्णन के साथ मानव अस्थि मज्जा (बीएम) दान से और (द्वितीय) एक कुशल और सौंय अभिकर्मक रणनीति चुंबकीय गैर वायरल बहुलक-CD133 के आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए वितरण प्रणाली आधारित+ SCs miRs का उपयोग कर । CD133+ SCs एक सतह एंटीबॉडी आधारित चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई (एमएसीएस) प्रणाली का उपयोग कर मानव स्टर्नल बीएम aspirates से पृथक और चुंबकीय रूप से समृद्ध कर रहे हैं । बाद में, कोशिका व्यवहार्यता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल शुद्धता प्रवाह cytometry का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं । इसके बाद, मीर/पी/देि परिसर तैयार कर रहे है और CD133+ SCs transfected हैं । 18 ज अभिकर्मक के बाद, अधिक कुशलता और अनुसूचित जाति मार्कर अभिव्यक्ति और कोशिका व्यवहार्यता पर अभिकर्मक के प्रभाव का विश्लेषण कर रहे हैं । इसके अलावा, अभिकर्मक परिसर यौगिकों के intracellular वितरण का मूल्यांकन चार रंग लेबलिंग और दीप्ति माइक्रोस्कोपी (सिम) संरचित का उपयोग किया जाता है ।
हाल के वर्षों में, CD133+ SCs अनुसूचित जाति आधारित चिकित्सा के लिए एक होनहार सेल जनसंख्या के रूप में कई चरण मैं, द्वितीय द्वारा सबूत के रूप में उभरा है, और III नैदानिक परीक्षण४३,४४,<s…
The authors have nothing to disclose.
यह काम शिक्षा और अनुसंधान जर्मनी के संघीय मंत्रालय (FKZ 0312138A और FKZ ३१६१५९) द्वारा समर्थित किया गया था, राज्य Mecklenburg-वेस्टर्न Pomerania के साथ यूरोपीय संघ संरचनात्मक कोष (ESF/IVWM-B34-0030/10 और ESF/IVBM-B35-0010/12), और DFG (DA1296/2-1), जर्मन हार्ट फाउंडेशन (F/01/12), BMBF (वीआईपी + ००२४०) और नम फाउंडेशन । इसके अलावा, F.H. और P.M. रॉस्टॉक यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर (८८९००१) के FORUN प्रोग्राम द्वारा समर्थित हैं ।
7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies | 7060 | 3% |
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-853 | |
anti-CD34-FITC (clone: AC136) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-081-001 | |
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1) | BD Biosciences | 560178 | |
rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin | ATTO-TEC GmbH | AD 565-71 | |
BD FACS LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
BD FACSDiva Software 6.1.2 | BD Biosciences | ||
BSA | Sigma-Aldrich GmbH | A7906 | |
CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-049 | |
collagenase B | Roche Diagnostics GmbH | 11088831001 | |
counting chamber | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | ||
Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 | Ambion | AM17120 | |
Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit | Mirus Bio | MIR 9650 | |
DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 10104159001 | (100 U/mL) |
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope | Carl Zeiss Jena GmbH | ||
FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-059-901 | |
bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | O10241 | |
aqueous mounting medium; Fluoroshield | Sigma-Aldrich GmbH | F6182 | |
density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 89048-932 | |
MACS magnet holder; MACS MultiStand | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
MACS pre-separation filter | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | 30 µm |
MACS separation column (MS / LS) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-201 / 130-042-401 | |
MACS permanent magnet; MACS Separator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-302 | |
Millex-HV PVDF Filter | Merck | SLHV013SL | 0.45 μm |
mouse IgG 2b-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-215 | |
amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
human lymphocyte separating medium; Pancoll | Pan Biotech GmbH | P04-60500 | density: 1.077 g/mL |
PBS | Pan Biotech GmbH | P04-53500 | without Ca and Mg |
PEI | Sigma-Aldrich GmbH | 408727 | branched; 25 kDa |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100 μg/mL |
PFA | Merck Schuchardt OHG | 1040051000 | |
unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 | Ambion | AM17110 | |
RBC lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
RNAse decontamination solution; RNaseZap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Pan Biotech GmbH | P04-16500 | |
recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100 | Stemcell Technologies | 2690 | |
serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000 | Stemcell Technologies | 9800 | |
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles | Promega Corporation | Z5481 | |
Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich GmbH | T8154 | 0.4 % |
UltraPure EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | 0.5 M; pH 8.0 |
ZEN2011 software | Carl Zeiss Jena GmbH | ||
NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
Sonorex RK 100 SH sonicating water bath | Bandelin electronic | Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz |