Summary
عبر مجموعة واسعة من مؤشرات المرض، يجري النماذج ذات الصلة أكثر فسيولوجيا المخدرات المتقدمة وتنفذ في اكتشاف البرامج. النظام النموذجي الجديد الموصوفة هنا يوضح الورم ثلاثي الأبعاد كيف يمكن مثقف الماغنيسيوم وفرزهم في نظام القائم على لوحة الفائق 1536-جيدا للبحث عن أدوية جديدة لعلاج الأورام.
Abstract
وقد تم مثقف الخلايا السرطانية بشكل روتيني في بعدين (2D) على سطح بلاستيك. هذا الأسلوب، ومع ذلك، تفتقر إلى البيئة الحقيقية ورم يتعرض فيفو فيكتلة. الأورام الصلبة تنمو ليس كورقة تعلق على البلاستيك، ولكن بدلاً من ذلك كمجموعة من الخلايا الاستنساخ في ثلاثية الأبعاد (3D) مساحة التفاعل مع جيرانهم، ومع الخصائص المكانية متميزة مثل اضطراب الاستقطاب الخلوي العادي. هذه التفاعلات تسبب الخلايا المستزرعة 3D اكتساب الخصائص المورفولوجية والخلوية التي أكثر صلة بأورام في فيفو . بالإضافة إلى ذلك، وجود ورم الشامل في الاتصال المباشر مع سائر أنواع الخلايا مثل الخلايا اللحمية ومحصنة، فضلا عن المصفوفة خارج الخلية من جميع أنواع الخلايا الأخرى. مصفوفة أودعت تتألف من الجزيئات الكبيرة مثل الكولاجين وفيبرونيكتين.
في محاولة لزيادة ترجمة نتائج البحوث في علم الأورام من مقاعد البدلاء إلى جانب السرير، بدأت العديد من المجموعات للتحقيق في استخدام نظم النموذج الثلاثي الأبعاد في استراتيجياتها الإنمائية الخاصة بالمخدرات. ويعتقد أن أكثر فسيولوجيا ذات الصلة نظراً لأنها محاولة لتلخيص البيئة المعقدة وغير متجانسة من ورم في هذه النظم. هذه الأنظمة، ومع ذلك، يمكن أن تكون معقدة جداً، وعلى الرغم من أن قابلة للنمو في تنسيقات 96-جيدا، وبعضها الآن حتى في 384، أنها توفر خيارات قليلة للنمو على نطاق واسع والفرز. ولاحظ هذه الفجوة قد أدى إلى تطوير الأساليب الموصوفة هنا بالتفصيل للثقافة الورم الماغنيسيوم في قدرة الإنتاجية العالية في لوحات 1536-جيدا. هذه الطرق تمثل حلاً وسطا للأنظمة المستندة إلى مصفوفة معقدة للغاية، من الصعب على الشاشة، وفحوصات 2D التقليدية. مجموعة متنوعة من خطوط خلايا السرطان إيواء الطفرات الوراثية مختلفة يتم فحصهم بنجاح، دراسة فعالية مركب باستخدام مكتبة المنسق من مركبات استهداف ميتوجيناكتيفاتيد البروتين كيناز أو MAPK المسار. ثم تتم مقارنة الردود ثقافة كروي لاستجابة الخلايا التي نمت في 2D، ويتم الإبلاغ عن الأنشطة التفاضلية. هذه الأساليب تقديم بروتوكول فريدة لاختبار نشاط المجمع في إعداد 3D الفائق.
Introduction
في العقد الماضي، نفذت دراسات أكثر وأكثر استخدام نماذج الثقافة خلية ثلاثية الأبعاد لفهم المفاهيم التي لا يرد موجز لها تماما بزراعة الخلايا في 2D على البلاستيك. وتشمل أمثلة لهذه المفاهيم المصطنعة في الخلايا الظهارية العادية قطبية1 حيث يتم فقدان التوجه المكاني لطبقات قمي والقاعدية للخلايا، فضلا عن دور المصفوفة خارج الخلية في تنظيم بقاء ومصير الخلية. أبحاث علم الأورام، على وجه الخصوص، قد تستخدم نماذج ثلاثية الأبعاد لفهم البيولوجيا الأساسية للخلايا السرطانية والفروق في 2D و 3D خلية ثقافة النظم3،4. وقد مكن تطوير تقنيات استزراع خلية أكثر تطورا وعلى تكييف إضافية إلى صيغ متعددة جيدا البحث عن عقاقير جديدة في إعدادات ثلاثية الأبعاد. وعلى النقيض من الخلايا التي نمت في ظروف 2D، 3D نماذج من مجموعة الأورام في التعقيد من الطبقات الخلوية نظم5 مجالات نوع واحد من الخلايا ذات أحجام مختلفة، إلى مجالات متعددة سيل من نوع معقد6،7، 8-اكتشاف مركبات جديدة أو البيولوجي التي أظهرت تسبب موت الخلايا في هذه النظم نموذج ثلاثي الأبعاد، بالتالي، ارتفاع الفوائد في حملات التنمية المخدرات. نقاط النهاية لهذه الاختبارات غالباً ما تكون مطابقة لما تم تنفيذه في 2D الثقافات لتقييم التغييرات في تكاثر الخلايا، ولكن عندما تجري في أجواء أكثر فسيولوجيا ذات صلة، أنها قد تكشف عن المستوى الحقيقي لتبعية الجينات المستهدفة أو يجري المسار استجوب.
كما عرضت أعلاه، مجموعة متنوعة من نظم نموذجية قد وضعت لدراسة الردود المخدرات في نظم الاستزراع 3D، ولكن الأغلبية تستخدم أما لوحات microtiter 96 أو 384-جيدا وليست قابلة للتكيف بسهولة إلى صيغ الفرز (HTS) الفائق غالباً ما تستخدم في حملات الفحص اكتشاف المخدرات. تشمل هذه النظم استخدام معلقة التكنولوجيات الحبرية، الثقافات كروي، النبض الخلايا مع جزيئات مغناطيسية للحث على الارتفاع، والثقافات التي تتضمن المواد الهلامية الطبيعية أو الاصطناعية مثل الكولاجين أو ماتريجيل أو البولي إثيلين غليكول (شماعة)2 . نقدم هنا، مفصلاً أساليب تقنية المتقدمة سابقا لإنتاج الثقافات كروي ثلاثي الأبعاد من خطوط خلايا السرطان المنشأة في شكل لوحة 1536-جيدا. في هذا البروتوكول، تستخدم وسيلة محددة بدرجة عالية مما يمنع إلحاق خلية عادة ملتصقة خطوط9. هذا النظام قد القيود (أيأنها لا يمكن أن الخص تماما نظام طراز معقدة للسرطان)، ولكن على الرغم من ذلك، تمكن هذه الاختبارات فرز الفائق لمجموعات كبيرة من الجزيئات الصغيرة وإجراء مقارنات عبر فتحه لاستجابة المخدرات بين الثقافات 2D و 3D ضد مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا والمركبات.
خطوط الخلايا المحددة لإظهار الأساليب الموجودة في هذه المقالة كل ميناء الطفرات في الجينات المتصلة ب MAPK إشارات الطريق، طريق الذي هو الغاية dysregulated في السرطان، وتتوفر فيه العديد من العلاجات. العديد من الخطوط بتفعيل النمطان الطفرات في فيروس "ساركومه الفئران كيرستن" يشار إليه أيضا كراس ورأس نيوروبلاستوما أو تجاوزها والسرطاني الفيروس "هارفي الفئران ساركومه" أو HRAS ومؤنزم المرتبطة "فيبروساركوماس التعجيل بسرعة"، المعروف أيضا رافس. الأدب الأخيرة تشير إلى أن مثبطات الفروع المختلفة لهذا المسار فريد أكثر نجاعة في مجموعة فرعية من خطوط الخلايا عندما نمت تحت ظروف 3D9،10. وجدت إحدى الدراسات أن عندما كانت استزراع الخلايا السرطانية مع RAS نشطة في 3D، أنها برهنت على الوعي المتزايد بمثبطات MAPK، وعلاوة على ذلك، أن هذا النهج يمكن أن تحدد مسارات واستهدفت الموانع التي قد تكون أخطأت في 2D التقليدية الإعداد. والهدف من هذه الدراسة تقديم الأساليب المستخدمة لثقافة هذه خطوط الخلايا، وعلاوة على ذلك، تثبت التفاضلية الردود على هذه الموانع التي يمكن ملاحظتها فقط عند استخدام 3D الخلية نظم الثقافة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-استزراع من الماغنيسيوم الورم 3D 1536-جيدا
- إعداد ورم 3D طازجة كروي جذعية متوسطة (المتوسطة خلية + خروج المغلوب المصل استبدال الأنسولين-ترانسفيرين-السيلينيوم) عن طريق إضافة الكواشف التالية إلى 500 مل من "تعديل النسور المتوسطة" دولبيكو (DMEM/F12): 1 x البنسلين/ستربتوميسين، 10 نانوغرام/مل من الإنسان أساسية تنتجها الخلايا الليفية عامل النمو (بفجف)، 20 نانوغرام/مليلتر من البشرية البشرة عامل النمو (لو)، 0.4% ألبومين المصل البقري (BSA) (جزء الخامس)، 1 x الأنسولين-ترانسفيرين-السيلنيوم، واستبدال المصل 1% خروج المغلوب (كو) (عدم تجميد أذاب).
- عامل التصفية-تعقيم المتوسطة كامل مع الملاحق من خلال نظام تصفية أعلى زجاجة 0.4 ميكرومتر.
- فصل خطوط خلايا السرطان، التي ظلت تنمو وفقا لشروط الثقافة الروتينية الموصى به، من قوارير زراعة الخلايا التقليدية بغسلها 3 x مع 1 x فوسفات مخزنة المالحة (PBS) وإضافة مبلغ مناسب من 0.25% التربسين (1 مل كل 5 سم2) لمدة 5 دقائق لإنشاء طبقة رقيقة فوق الخلايا. تحييد التربسين مع 5 × المبلغ للوسائط التي تحتوي على المصل والمضي قدما لعد الخلايا. على سبيل المثال، استخدام 25 مل متوسطة 5 مل التربسين.
- ضبط تركيز حل خلية 62.5 × 104 خلايا/مل من أجل البذور مجموعة خلايا 500 كل بئر في 8 ميليلتر من المتوسطة كروي في لوحات الأنسجة-الثقافة-تعامل 1536-جيدا.
- في مجلس الوزراء سلامة بيولوجية، بذور الخلايا باستخدام كاسيت معقم، صغيرة مقلوب من الفولاذ المقاوم للصدأ مع نظام يقوم على مضخة تمعجية. بين خطوط الخلايا المختلفة، تدفق أنابيب الكاسيت مع 1 x برنامج تلفزيوني و 70% إيثانول 10 s.
- وبدلاً من ذلك، بذور الخلايا باستخدام معالج سائل الموجود داخل غرفة هيبا تصفيتها باستخدام أما كاسيت مقلوب من الفولاذ المقاوم للصدأ معقمة، صغيرة ومضخة تمعجية أو مضخة الحقن مرفقة، اعتماداً على عدد اللوحات كل خط الخلية المطلوبة.
- ختم لوحات استخدام ختم لوحة لاصقة تنفس أما يدوياً أو باستخدام السدادة لوحة.
- وضع اللوحات في حاضنة لغزل في الدقيقة 10 37 درجة مئوية مع رطوبة نسبية 95% و 5% ثاني أكسيد الكربون (CO2). تسمح الماغنيسيوم إلى نموذج لمد 3.
2-استزراع خطوط السرطان 2D 1536-جيدا
ملاحظة: خطوط السرطان 2D 1536-كذلك ينبغي مثقف 24 ساعة قبل إضافة المجمع إلى لوحات ثلاثية الأبعاد.
- تعد وسيلة خلية سرطان 2D عن طريق إضافة الكواشف التالية إلى 500 مل وسيط النمو المناسب للبنود المحددة: 1 × البنسلين/ستربتوميسين و 10% الجنين المصل البقري (FBS).
- عامل التصفية-تعقيم المتوسطة كامل مع الملاحق من خلال نظام تصفية أعلى زجاجة 0.4 ميكرومتر.
- فصل خطوط خلايا السرطان، التي ظلت تنمو وفقا لشروط الثقافة الروتينية الموصى به، من قوارير زراعة الخلايا التقليدية بغسلها 3 x 1 x برنامج تلفزيوني وإضافة مبلغ مناسب من 0.25% التربسين (1 مل كل 5 سم2) لمدة 5 دقائق إلى قم بإنشاء طبقة رقيقة فوق الخلايا. تحييد التربسين مع 5 × المبلغ للوسائط التي تحتوي على المصل والمضي قدما لعد الخلايا. على سبيل المثال، استخدام 25 مل متوسطة 5 مل التربسين.
- ضبط تركيز حل خلية 62.5 × 104 خلايا/مل من أجل البذور مجموعة خلايا 500 كل بئر في 8 ميليلتر الكامل المتوسطة إلى لوحات الأنسجة-الثقافة-تعامل 1536-جيدا.
- في مجلس الوزراء سلامة بيولوجية، بذور الخلايا باستخدام كاسيت معقم، صغيرة مقلوب من الفولاذ المقاوم للصدأ مع نظام يقوم على مضخة تمعجية. بين خطوط خلية مختلفة، تدفق أنابيب الكاسيت مع 1 x العقيمة PBS و 70% إيثانول 10 s.
- وبدلاً من ذلك، بذور الخلايا باستخدام معالج سائل الموجود داخل غرفة الروبوتات هيبا تصفيتها باستخدام أما كاسيت مقلوب من الفولاذ المقاوم للصدأ معقمة، صغيرة ومضخة تمعجية أو مضخة الحقن المرفقة، تبعاً لحجم لوحات كل خلية خط اللازمة.
- ختم لوحات استخدام ختم لوحة لاصقة تنفس أما يدوياً أو باستخدام السدادة لوحة.
- وضع اللوحات في حاضنة لغزل في الدقيقة 10 37 درجة مئوية عن 24 ساعة قبل إضافة مركب، مع أول أكسيد الكربون 5%2 و 95% رطوبة نسبية.
3-مجمع بالإضافة
- يعد تخفيف 8 نقطة، 3-fold المسلسل من مثبطات MAPK في 100% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) على روبوت مناولة السائل بتركيز أعلى 10 ملم. مثبط بروتوزوم بورتيزوميب كعنصر إيجابي لخلية كاملة قتل لتحديد النطاق الديناميكي للفحص.
- الاعتداء السريع-تدور جميع لوحات ولوحات المركب في 100 غ س لجمع أي التكثيف. إزالة الختم لاصقة من كل لوحة ووضع لوحة على إنشاء موزع صوتية إضافة ما مجموعة 8 nL لكل مجمع/تمييع يمثلون بتركيز نهائي [دمس] 0.1% من كل بئر وجرعة مركب أعلى من 10 ميكرون.
- بعد الانتهاء من إضافة المجمع، ضع غطاء ثقافة خلية مصنوعة خصيصا، والفولاذ المقاوم للصدأ الذي يمنع التبخر على اللوحة، ووضع اللوحة في حاضنة غزل في 37 درجة مئوية لمد 5، مع أول أكسيد الكربون 5%2 و 95% رطوبة نسبية.
4-كشف كاشف الإضافة والحصول البيانات الخام
- قبل الحارة حجم مناسب من الكاشف تحلل الخلية التي تحتوي على لوسيفرين للكشف عن التغييرات في الأدنين ثلاثي الفوسفات (ATP)، ومن ثم التغيرات في انتشار الخلية في درجة حرارة الغرفة أو في حمام مائي 37 درجة مئوية. إضافة إجمالي 3 ميليلتر من الكشف عن الكاشف لكل بئر باستخدام مضخة تمعجية واحتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على الأقل.
- التقاط التﻷلؤ في لومينوميتير لوحة.
5-معالجة البيانات
- استخراج البيانات الخام من الصك وتطبيع جميع الحقول التي تحتوي على مركبات اختبار المتوسط لجميع الآبار التي تحتوي على [دمس] وحدها كعنصر محايد. من هذه القيمة، حساب تثبيط نمو النسبة المئوية لكل مجمع. هذا هو إنجاز باستخدام الصيغة الدالة في Microsoft Excel حيث f (x) = {(نموذج القيمة النسبية وحدات خفيفة (رلوس)/(متوسط القيمة [دمس] رلوس) * 100)}.
- إنشاء منحنيات الاستجابة للجرعة والمثبطة IC50s بقيم البيانات الموحدة من الخطوة 5.1 ضد تركيز مركب باستخدام برنامج الرسوم البيانية برسوم بيانية.
ملاحظة: قمنا بتحليل البيانات باستخدام هيليوس، أداة برمجيات نيبر داخلية. لإكمال هذه المهمة، اخترنا أداة تحليل منحنى nonparametric.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مجموعة متنوعة من الخلايا السرطانية ثابتة تم اختبار خطوط معروفة لتنمو جيدا في ظل ظروف الثقافة 2D باستخدام الأساليب المذكورة هنا. صور الممثل من مجموعة متنوعة من السرطان متحولة MAPK الخلية خطوط (كالو-6:KRAS، NCI-H1299:NRAS، كورونا-ميل-30:NRAS، وكيلونيوتن-62:HRAS) ينظر في الشكل 1. هذه الصور تبين أنه على الرغم من أن خطوط الخلايا مورفولوجيس المختلفة، كل تشكيل هياكل ثلاثية الأبعاد في لوحات المقايسة 1536-جيدا. ويبين الشكل 2 أن، عند استخدامها للفرز على نطاق واسع، حساسية مجمع التفاضلية بين الثقافات التي نمت في 2D مقابل تلك في 3D يمكن ملاحظتها. كل نقطة في الرسم البياني يمثل تركيز المثبطة مجمع واحد حيث يوجد المجمع IC50 استجابة في كلا الإعدادات أو قتل خلايا 50%. وللتدليل على أن الأثر وساطة هو ليس فقط عن طريق وسائل الإعلام المختلفة، كان مثقف كالو-6 خلايا في نفس الوسائط باستخدام لوحات استزراع الأنسجة في 2D أو 3D لوحات بيوفيلم سسيفاكس الذي منع المرفقات. ويعتبر زيادة الحساسية أو IC50 السفلي لحالة النمو 3D في تكميلية الرقم 1 مجمعين في نفس الوسائط. إظهار خطوط مثل كالو-6 زيادة حساسية للمركبات عندما نما تحت ظروف 3D، بينما أقل حساسية في 3D 2D بالمقارنة مع خطوط مثل كورونا-ميل-30. ويتضمن الجدول 1 معلومات أساسية إضافية عن جميع خطوط الخلية التي استخدمت في هذه الشاشة.
هي تصور أمثلة من منحنيات الاستجابة للجرعة الممثل في الشكل 3. يوضح هذا الرقم فعالية التفاضلية مجمعين، RAF265 (الشكل 3A) و RAF709 (الشكل 3B)، التي تعوق نشاط مؤنزم RAF. كل من المركبات أقوى في 3D الشروط في كالو-6، الذي سرطان الرئة خلية غير الصغيرة خط إيواء Q61K، تفعيل طفرة في البروتين كراس. في الوقت نفسه، كل من المركبات القوية وبالمثل في 3D الماغنيسيوم والثقافات 2D من السطر سرطان القولون HCT116، الذي يحتوي على G13D-تفعيل الطفرة في كراس. كانت تزرع حالة نمو 3D مقابل 2D، وليس مجرد شروط مختلف وسائط الإعلام، كالو-6 خلايا لإثبات أن تأثير زيادة الحساسية التي توسطت فيها استخدام FBS تحت كل الظروف. كما رأينا في تكميلية الشكل 1، عند استخدام الشروط في 2D و 3D FBS، يوضح ثقافة 3D لا يزال زيادة حساسية للمركبات المنتجة IC50 السفلي.
وأخيراً، مقايسة 3D يسمح أيضا بملاحظة هذه الظاهرة لتنشيط نمو المفارقة، التي من المعروف أن تحدث عندما يكون هناك تثبيط غير مكتملة لسلاح الجو الملكي البريطاني dimers في خطوط متحولة RAS نشطة جداً، وليس في مسار مستقل عن ديمر التنشيط في V600E براف الطفرات11،12. ويعتبر هذا التنشيط في الشكل 4، على المعاملة مع مثبطات براف دابرافينيب تحت ظروف 3D في 62 كيلونيوتن، صغيرة تحور HRAS الخلية خط سرطان الرئة، وأيضا في خلية البنكرياس متحولة شاذة براف خط بكسبك-3. يتم تنشيط النمو تركيزات منخفضة من المخدرات، وتقمع النمو فقط بتركيزات عالية من المخدرات (الشكل 4 باء). كان من المدهش أن لا ينظر في السطر متحولة كراس كالو-6 هذا التنشيط وليس من المتوقع في السطر متحولة V600E براف A375. وقد لاحظنا تنشيط مفارقة كالو-6 استخدام نماذج النمو 3D أخرى (البيانات لا تظهر).
رقم 1: صور الممثل من الخلايا السرطانية التي تنمو في 3D 1536-جيدا لوحات. كانت مطلية بالخلايا لما مجموعة 3 د في لوحات 1536-جيدا باستخدام موزع كاشف وكاسيت صغير. إظهار الصور الميدانية برايت، المكتسبة في مجهر مقلوب استخدام عدسة X 4، مورفولوجيس ثلاثية الأبعاد المختلفة في خطوط الخلايا متحولة MAPK كالو-6:KRAS، NCI-H1299:NRAS، كورونا-ميل-30:NRAS، وكيلونيوتن-62:HRAS. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: مؤامرة مبعثر مقارنة 2D- مقابل مجمع 3D-الفعالية عبر خطوط الخلايا. الماغنيسيوم، التي تم إنشاؤها مسبقاً لمد 3، ثم تعامل مع المركبات دال 5 إضافية قبل أن تقرر فعالية المركب. كل دائرة تمثل استجابة مجمع فريد من نوعه. تم الكشف عن التغييرات في انتشار الخلية استخدام كاشف انتشار خلايا الحال، وحسبت IC50s استخدام تحليل انحدار اللوجستي أربعة المعلمة مع البرامج الداخلية تسمى هيليوس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: منحنيات الاستجابة للجرعة مقارنة 2D- مقابل مجمع 3D كفاءة. منحنيات الاستجابة للجرعة إثبات فعالية المركب بالمقارنة مع عناصر التحكم [دمس]. منحنيات المسخ كراس كالو-6 والخلايا HCT116 تعامل مع اثنين من مثبطات RAF، RAF265 و RAF709، يتم عرضها هنا كنسبة مئوية في التغيير في نمو الخلايا (إعاقة النمو في المائة) بالمقارنة مع [دمس] التحكم في الآبار. عدد الخلايا التي كانت تزرع في ظروف 2D يظهر باللون الأحمر، وتلك التي نمت الماغنيسيوم 3D باللون الأزرق. الخطوط الصلبة حول البيانات تشير فواصل الثقة 95% لكل مجموعة بيانات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: التقاط بعض الثقافات 3D ظواهر تنشيط نمو المفارقة. منحنيات الاستجابة للجرعة إثبات فعالية مركب (إعاقة النمو %) بالمقارنة مع عناصر التحكم [دمس]. منحنيات المسخ كراس كالو-6، V600E براف المسخ A375، HRAS المسخ كيلونيوتن-62 وشاذة متحولة براف بكسبك-3 الخلايا تعامل مع منشط مفارقة دابرافينيب يتم عرضها هنا. عدد الخلايا التي كانت تزرع في ظروف 2D يظهر باللون الأحمر، وتلك التي نمت الماغنيسيوم 3D باللون الأزرق. الخطوط الصلبة حول البيانات تشير فواصل الثقة 95% لكل مجموعة بيانات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تكميلية الشكل 1: منحنيات الاستجابة للجرعة مقارنة 2D- مقابل 3D-المجمع نجاعة في FBS التي تحتوي على وسائط الإعلام- منحنيات الاستجابة للجرعة إثبات فعالية المركب بالمقارنة مع عناصر التحكم [دمس]. منحنيات كراس متحولة كالو-6 الخلايا تعامل مع اثنين من مثبطات RAF، RAF265 و RAF709، يتم عرضها هنا كنسبة مئوية في التغيير في نمو الخلايا (إعاقة النمو في المائة) بالمقارنة مع [دمس] التحكم في الآبار. عدد الخلايا التي كانت تزرع في ظروف 2D يظهر باللون الأحمر، وتلك التي نمت الماغنيسيوم 3D باللون الأزرق. كلا الشرطين استخدام الوسائط التي تحتوي على FBS. أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية من 2 مجموعات البيانات الفردية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| اسم خط الخلية | النسب | براف | رأس |
| A-375 | سرطان الجلد | V600E | WT |
| بكسبك-3 | البنكرياس | V487-P492 > A | WT |
| Calu6 | سرطان الرئة من الخلايا غير الصغيرة | WT | Q61K كراس |
| كليات 116 | القولون والمستقيم | WT | G13C كراس |
| 298-التصنيف الدولي للبراءات | سرطان الجلد | WT | Q61L تخطيطية |
| كيلونيوتن-62 | الرئة صدفية | WT | HRAS Q61L |
| NCI-H1299 | الرئة | WT | G12D تخطيطية |
| PANC-1 | البنكرياس | WT | G12D كراس |
| سكميل-30 | سرطان الجلد | WT | Q61K تخطيطية |
الجدول 1: معلومات خط الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأساليب المقدمة هنا إظهار بروتوكول مفصلة حول كيفية إنتاج الماغنيسيوم ورم في لوحات 1536-جيدا لعروض مجمع على نطاق واسع. هذه الأساليب كانت في البداية مقتبسة من العمل في المعهد الوطني للسرطان حيث كانت تزرع الماغنيسيوم ورم في فحوصات الإنتاجية المنخفضة في لوحات 6-جيدا وكذلك 96 طرح أسئلة حول تبعيات الوراثية وحساسية مجمع13، 14 , 15. ميزة حاسمة وفريدة من نوعها لهذا البروتوكول أن الماغنيسيوم تتشكل من خلايا الأنسجة المستزرعة 2D التقليدية في 1536-لوحات باستخدام تعريف الوسائط المشار إليها كالمجلس الأعلى للقضاة + كو + لها. حالما يتم المصنف الخلايا في، أنها مختومة بأختام تنفس لوحة لاصقة لمنع أي التبخر خلال مدة تشكيل كروي د 3. يمكن أيضا أن تكون مثقف الماغنيسيوم لفترات أطول من الوقت باستخدام هذا النهج16. بعد 3 د تشكيل المجال، يتم إضافة مركبات لمد 5 قبل المعايرة التغييرات في نمو الخلايا مع كاشف الحال على أساس انتشار. بعد التطبيع بابار مراقبة وحساب IC50s بين الخلايا المزروعة في 2D مقابل 3D، تتم مقارنة التغيرات في الخلايا المعالجة بمجمع إلى الخلايا المعالجة بالتحكم.
منذ 1536-البئر اللوحات لوحات معاملة الأنسجة العادية ولوحات غير المغلفة بالمائية أو الخلية طارد، وحد من هذا البروتوكول هو استخدام وسيلة محددة، الذي يشكل عاملاً حاسما في نجاح تنفيذ هذا البروتوكول. استبدال المصل كو في البداية تم اختباره لقدرته على تقديم المعونة بنجاح في نمو الخلايا الجذعية الجنينية في 3D17 ، وفي هذا البروتوكول قد تم تكييفها لنمو العديد من ورم كروي خطوط13،15، 18 , 19-أن نلاحظ أنه، على الرغم من ظروف وسائل الإعلام المختلفة للخلايا نمو 2D مقابل 3D الماغنيسيوم، لدينا سابقا يتضح أن الآثار المتفاوتة لحساسية المخدرات يجري التوسط في تنسيق النمو، ولا ببساطة الاختلافات في وسائل الإعلام تكوين9.
لضمان النجاح لهذا البروتوكول، كخطوة استكشاف الأخطاء وإصلاحها، ويقترح أن سلسلة من التجارب الإنمائية المقايسة تجري أولاً لتحسين كل خط الخلية قبل الشروع في شاشة واسعة النطاق. في هذا المثال، قيمت كافة خطوط الخلية جزيئي أولاً لتحديد إذا أنها يمكن أن تبذر في بنفس الكثافة بدءاً من خلايا 500 كل بئر. ثم أنها كانت جزيئي مع لوحات [دمس] فقط لدراسة الانحرافات المعيارية (SD) ومعاملات التباين (السير الذاتية) لمدة فترة النمو. حتى مع هذا التطور الإنزيم في المكان، بعض خطوط نمت بمعدل أسرع من غيرها، وأنه كان من الأفيد لمواصلة تحسين كثافة البذر ومدة التجربة من هذه الخطوط أكثر تحديا. وأخيراً، تثبت البيانات المقدمة هنا أن هناك اتجاها، بدلاً من ظاهرة عالمية، لبعض خطوط الخلية مثل NSCLC خط 6 كالو فريد أكثر حساسية لمركبات استهداف MAPK المسار في مقارنة بتلك التي نمت في 2D 3D. ويجري المزيد من التجارب لتحديد ما الآليات البيولوجية قد تساهم في تنظيم هذا الاختلاف الصارخ في حساسية.
القدرة على الشاشة الماغنيسيوم في جو HTS الترا يسمح للثقافات ثلاثية الأبعاد لاستخدامها في وقت مبكر في عملية اكتشاف المخدرات وقد تمكن من تحديد هوية الرواية المسألة الكيميائية التي تنشط فقط في أجواء ثلاثية الأبعاد. مع أن الكثير من المرشحين السريرية يصل ابدأ إلى السوق بسبب الافتقار إلى الفعالية في المرضى، وأن كان مما يدل على نمو تثبيط في المختبر والانحدار في فيفو، فرق بدأت التشكيك في ما إذا كان تنفيذ 3D فحوصات سد هذه الفجوة في وقت سابق أثناء عملية الاكتشاف. يوجد عدد من أنواع مختلفة من لوحة لخلايا الثقافة في 3D عند استخدام أساليب 96-جيدا أو 384-جيدا. هنا، وقد قدمنا 1536-جيدا الأساليب التي تنتج عدة بؤر الماغنيسيوم الفردية. وفي المستقبل، يمكن مقارنة هذه النتائج على شاشات مماثلة باستخدام التكنولوجيات الجديدة التي يجري تطويرها مثل لوحات 1536-جيدا والتي يمكن أن تنمو خلايا كمعلق قطرات، أو اللوحات التي هي مغلفة بالمائية/ماتريجيل والتي القاع المستديرة، التي ستسمح بتشكيل مجال واحد كل بئر. هذه الظروف أن يدخل طبقات إضافية من التعقيد لشروط الثقافة المستخدمة للفرز، يجعلها ذات الصلة حتى أكثر الفيزيولوجية، ويمكن أن يحتمل أن تمثل زيادة معدل الترجمة من مقاعد البدلاء إلى السرير للرواية العلاجات. كما ستمكن هذه التكنولوجيات الأسئلة العلمية التي تنطوي على تدرجات نقص أو نشرها، التي تتطلب استخدام الماغنيسيوم أكبر.
الأساليب المقدمة هنا التركيز على فحص هذه الماغنيسيوم ضد مكتبة جزيء صغير من المركبات. وفي المستقبل، يمكن توسيع هذه الأساليب إلى الشاشة لرواية البيولوجيات وبيوثيرابيوتيكس مثل الأجسام المضادة ثنائية محددة أو يصرف جسم-المخدرات، قد توفر فيها الثقافات 3D التفاعلات ذات الصلة أكثر فسيولوجيا جسم مضاد-مستضد. وبالإضافة إلى ذلك، قد يكون استخدام 3D الماغنيسيوم الحاسمة لتطوير فحوصات الأمراض ذات الصلة لأهداف التفاهم والتدخلات في الفضاء الأورام المناعية الناشئة21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المؤلفين هم موظفون في شركة نوفارتيس، وأيضا بعض الموظفين حاملي الأسهم.
Acknowledgments
الكتاب تود أن تقر مارك فيرير في المركز الوطني للنهوض بالعلوم متعدية الجنسيات، والمعاهد الوطنية للصحة للدعم والتوجيه بشأن تطوير هذه الاختبارات الأولية. وبالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر فريمان أليسون، مارييﻻ جاسكيليوف واكر مايكل، ويعقوب هالينج وفيسيلينا كوك للمدخلات العلمية والمناقشة كأعضاء فريق المشروع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | ATCC | 30-2006 | Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors. |
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | Lonza | 12-604F | Purchased as a prepared solution. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Lonza | 12-115Q | Purchased as a prepared solution. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Hyclone | SH30042.01 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Purchased as a prepared solution. |
| 10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | Resuspend in sterile water. |
| 20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644 | Resuspend in sterile water. |
| 0.4% Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418 | Resuspend in sterile PBS and filter. |
| 1x Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Gibco | 51500056 | |
| 1% KnockOut (KO) Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | Add fresh right before use. |
| 100% Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7573 | Purchased as a prepared solution. |
| Consumables | |||
| Small Combi Cassette | ThermoFisher | 24073295 | |
| Small Multiflow Cassette | BioTek | 294085 | |
| 1536-well sterile TC plates (white) | Corning | 3727 | |
| 1536-well sterile TC plates (black) | Corning | 3893 | |
| Scivax Plates | MBL International | NCP-LH384-10 | |
| Equipment | |||
| Adhesives seals | ThermoFisher | AB0718 | |
| Spinning Incubator | LiCONiC | ||
| Stainless Steel Lids | The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF) | ||
| ATS Acoustic Dispensor | EDS Biosystems | ||
| Echo Acoustic Dispensor | Labcyte | ||
| Luminometer | Envision-Perkin Elmer | ||
| Peristaltic Pump- Multidrop Combi | ThermoFisher | ||
| Liquid Handler-Multiflow FX | BioTek |
References
- Lee, M., Vasioukhin, V. Cell polarity and cancer--cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor. Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69, 42-51 (2014).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 332 (3), 821-828 (2010).
- Li, L., Lu, Y. Optimizing a 3D Culture System to Study the Interaction between Epithelial Breast Cancer and Its Surrounding Fibroblasts. Journal of Cancer. 2, 458-466 (2011).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. 3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies. Journal of Cell Communication and Signaling. 5 (3), 239-248 (2011).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
- Mathews Griner, L. A., et al. Large-scale pharmacological profiling of 3D tumor models of cancer cells. Cell Death & Disease. 7 (12), e2492 (2016).
- Polo, M. L., et al. Responsiveness to PI3K and MEK inhibitors in breast cancer. Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice. PLoS One. 5 (5), e10786 (2010).
- Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
- Bhargava, A., et al. Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Elife. 5, e09976 (2016).
- Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells. Molecular Cancer. 9, 267 (2010).
- Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer. Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).
- Mathews, L. A., et al. Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells. Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).
- Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
- Sun, L., et al. Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells. Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).
- Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
- Mathews Griner, L. A., et al. High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).
- Herter, S., et al. A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).
