Summary
Over een breed scala van indicaties van de ziekte, meer fysiologisch relevante modellen worden ontwikkeld en uitgevoerd in drug discovery-programma's. Het nieuwe modelsysteem hier beschreven demonstreert hoe driedimensionale tumor spheroïden kunnen worden gekweekt en vertoond in een high-throughput 1536-well plaat-gebaseerd systeem om te zoeken naar nieuwe oncologie drugs.
Abstract
Kankercellen hebben routinematig zijn gekweekt in twee dimensies (2D) op een kunststof ondergrond. Deze techniek, mist echter de ware milieu een tumor massa wordt blootgesteld aan in vivo. Solide tumoren groeien niet als verbonden met kunststof blad, maar in plaats daarvan als een verzameling van klonen cellen in een driedimensionale (3D) ruimte interactie met hun buren en met verschillende ruimtelijke eigenschappen zoals de verstoring van de normale cellulaire polariteit. Deze interacties veroorzaken 3D-gekweekte cellen te verwerven van morfologische en cellulaire kenmerken die meer relevant voor in vivo tumoren zijn. Bovendien, een tumor massa is in direct contact met andere celtypes zoals stromale en immuun cellen, evenals de extracellulaire matrix van alle andere celtypes. De matrix gestort bestaat van macromoleculen zoals collageen en fibronectine.
In een poging om de vertaling van de onderzoeksresultaten in Oncologie van bench naar bed, zijn veel groepen begonnen met het gebruik van 3D-modelsystemen in hun drugsstrategieën ontwikkeling onderzoeken. Deze systemen worden verondersteld te zijn meer fysiologisch relevant omdat ze proberen te recapituleren van de complexe en heterogene omgeving van een tumor. Deze systemen, kunnen echter vrij complex en hoewel vatbaar voor groei in 96-Wells-formaten, en sommige nu zelfs in 384, ze weinig mogelijkheden voor grootschalige groei en screening. Dit waargenomen kloof heeft geleid tot de ontwikkeling van de methoden die hier worden beschreven in detail aan cultuur tumor spheroïden in een hoog-productie capaciteit in 1536-Wells-platen. Deze methoden vormen een compromis voor de zeer complexe matrix gebaseerde systemen, die moeilijk op scherm, en conventionele 2D testen. Een verscheidenheid van kanker cellijnen herbergen verschillende genetische mutaties zijn succesvol gescreend, samengestelde werkzaamheid te onderzoeken met behulp van een curator bibliotheek met verbindingen richten de Mitogen-Activated proteïne Kinase of MAPK-pathway. De sferoïde cultuur antwoorden worden dan vergeleken met de reactie van cellen gekweekt in 2D, en differentiële activiteiten worden gemeld. Deze methoden bieden een unieke protocol voor het testen van samengestelde activiteit in een 3D omgeving van hoge gegevensdoorvoer.
Introduction
In het afgelopen decennium hebben meer en meer studies het gebruik van 3D cel cultuur modellen te begrijpen concepten die niet volledig door de groeiende cellen in 2D op plastic zijn gerecapituleerd geïmplementeerd. Voorbeelden van deze concepten zijn de afwisseling in normale epitheliale cel polariteit1 waar de ruimtelijke oriëntatie van apicale en basale lagen van cellen zijn verloren, evenals de rol van de extracellulaire matrix bij het reguleren van de overleving en het lot van de cel. Oncologie onderzoek, heeft in het bijzonder 3D-modellen gebruikt om te begrijpen van de fundamentele biologie van kankercellen en de verschillen tussen 2D en 3D cel cultuur systemen3,4. De ontwikkeling van meer geavanceerde cel cultuur technieken en hun verdere aanpassing aan multi goed formaten heeft de zoektocht naar nieuwe geneesmiddelen in 3D instellingen ingeschakeld. In tegenstelling tot cellen gegroeid onder 2D, 3D-modellen van tumoren variëren in complexiteit verschillen van gelaagde cellulaire systemen5 tot single-cell-type bollen van verschillende grootte, tot complexe multi-cell-type bollen6,7, 8. de ontdekking van nieuwe verbindingen of biologics die krachtig het induceren van celdood in deze 3D-model-systemen is daarom van groot belang in drug ontwikkeling campagnes. Eindpunten van deze tests zijn vaak identiek zijn aan die uitgevoerd in 2D culturen te beoordelen van wijzigingen in celproliferatie, maar wanneer uitgevoerd in een meer fysiologisch relevante omgeving, zij kunnen openbaren de ware niveau van afhankelijkheid van de target-gen of het traject wordt ondervraagd.
Zoals hierboven geïntroduceerde, allerlei modelsystemen zijn ontwikkeld om te studeren drug reacties in 3D cultuur systemen, maar de meeste gebruiken beide 96 of 384-well microtiterplaat platen en zijn niet gemakkelijk aan te passen aan de high-throughput screening (HTS) formaten vaak gebruikt in Drug discovery screening campagnes. Dergelijke systemen omvatten het gebruik van opknoping druppel technologieën, sferoïde culturen, pulserende cellen met magnetische deeltjes ertoe levitatie, en culturen waarin natuurlijke of synthetische gels zoals collageen, Matrigel of polyethyleenglycol (PEG)2 . Hier presenteren we de gedetailleerde methoden van een eerder ontwikkelde techniek om het produceren van 3D sferoïde culturen van gevestigde kanker cellijnen in een formaat van 1536-well plaat. In dit protocol wordt een zeer beschreven medium gebruikt waardoor de bevestiging van normaal aanhangend cel lijnen9. Dit systeem heeft beperkingen (dat wil zeggen, het kan niet volledig recapituleren een complex modelsysteem van kanker), maar toch deze testen een high-throughput screening van grote verzamelingen van kleine moleculen en kruiselings vergelijkingen van drug antwoord inschakelen tussen 2D en 3D culturen tegen allerlei soorten cellijnen en verbindingen.
De cellijnen geselecteerd om aan te tonen van de methoden in dit artikel alle harbor mutaties in de genen aan de MAPK weg, een weg die zeer dysregulated in kanker, signalering gerelateerde en voor welke veel therapieën beschikbaar zijn. Veel van de lijnen hebben activeren oncogene mutaties in het Kirsten Rat Sarcoom virus ook wel genoemd de KRAS, de neuroblastoom RAS of NRI's de Harvey Rat Sarcoom virus oncogen of HRAS en de bijbehorende kinases snel versnelde fibrosarcomen, ook bekend als RAFs. Recente literatuur suggereert dat de inhibitors van verschillende knooppunten van dit traject uniek doeltreffender in een subset van de cellijnen zijn als volwassen onder 3D voorwaarden9,10. Één studie vond toen kankercellen met actieve RAS werden gekweekt in 3D, dat zij een verhoogde gevoeligheid voor MAPK remmers aangetoond, en verder, dat deze aanpak kon identificeren trajecten en gerichte remmers die zou kunnen worden gemist in de traditionele 2D instelling. Het doel van deze studie is om te presenteren van de methoden die voor de cultuur van deze cellijnen en verder, om aan te tonen het verschil reacties op deze remmers die kunnen worden waargenomen, alleen bij het gebruik van 3D cel cultuur systemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. het kweken van 1536-well 3D Tumor spheroïden
- Voorbereiding van een verse 3D tumor sferoïde middellange stam (cel medium + knock-out serum vervanging insuline-transferrine-selenium) door de volgende reagentia toe te voegen aan 500 mL Dulbecco van bewerkt Eagles Medium (DMEM/F12): 1 x penicilline/streptomycine, 10 ng/mL van de mens fundamentele fibroblast groeifactor (bFGF), 20 ng/mL van menselijke epidermale groeifactor (EGF), 0,4% bovien serumalbumine (BSA) (deel V), 1 x insuline-transferrine-selenium, en 1% knock-out (KO) serum vervanging (doen niet bevriezen-ontdooien).
- Filter-steriliseren het gehele medium met de supplementen via een 0.4 µm fles-top-filtersysteem.
- Loskoppelen van de cellijnen van kanker, die zijn gegroeid volgens aanbevolen routine kweekomstandigheden, van de traditionele cultuur van de cel kolven door wassen ze 3 x met 1 x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en het toevoegen van een geschikte hoeveelheid van een 0,25% trypsine (1 mL per 5 cm2) gedurende 5 minuten om te maken van een dun laagje over de gewenste cellen. Neutraliseren van de trypsine met 5 x het bedrag van het medium met het serum en overgaan tot de cellen tellen. Gebruik bijvoorbeeld 25 mL voedingsbodem voor 5 mL trypsine.
- De concentratie van de oplossing van de cel voor 62,5 x 104 cellen/mL aanpassen om zaad van een totaal van 500 cellen per putje in 8 µL van sferoïde medium in de 1536-well weefsel-cultuur-testgroep platen.
- Seed in een biologische veiligheid kabinet, de cellen een gesteriliseerde, kleine roestvrij-staal-tipped cassette met een peristaltische pomp gebaseerde systeem. Tussen verschillende cellijnen, spoel de slang van de cassette met 1 x PBS en 70% Ethanol voor 10 s.
- U kunt ook zaad de cellen met behulp van een vloeibare handler gelegen binnen een HEPA-gefilterd kamer met behulp van een gesteriliseerde, kleine roestvrij-staal-tipped cassette en een peristaltische pomp of een bijgevoegde-spuitpomp, afhankelijk van het aantal platen per cellijn nodig.
- Het zegel van de platen met behulp van een ademend zelfklevende plaat zegel ofwel handmatig of met behulp van een plaat sealer.
- Plaats de platen in een draaiende incubator vastgesteldop 10 rpm en 37 ° C met 5% kooldioxide (CO2) en 95% relatieve vochtigheid. Toestaan dat de spheroïden naar formulier voor 3 d.
2. kweken van 1536-well 2D kanker lijnen
Opmerking: De 1536-well 2D kanker lijnen moeten worden gekweekt 24 h vóór de toevoeging van de stof aan de 3D platen.
- Een 2D kanker cel medium voor te bereiden door de volgende reagentia tot 500 mL van een geschikte groeimedium voor de geselecteerde regels toe te voegen: 1 x penicilline/streptomycine en 10% foetale runderserum (FBS).
- Filter-steriliseren het gehele medium met de supplementen via een 0.4 µm fles-top-filtersysteem.
- Loskoppelen van de cellijnen van kanker, die zijn gegroeid volgens aanbevolen routine kweekomstandigheden, van de traditionele cultuur van de cel kolven door wassen ze 3 x met 1 x PBS en het toevoegen van een geschikte hoeveelheid van een 0,25% trypsine (1 mL per 5 cm2) gedurende 5 minuten aan Maak een dunne laag over de gewenste cellen. Neutraliseren van de trypsine met 5 x het bedrag van het medium met het serum en overgaan tot de cellen tellen. Gebruik bijvoorbeeld 25 mL voedingsbodem voor 5 mL trypsine.
- De concentratie van de oplossing van de cel voor 62,5 x 104 cellen/mL aanpassen om zaad van een totaal van 500 cellen per putje in 8 µL van volledige medium in 1536-well weefsel-cultuur-testgroep platen.
- Seed in een biologische veiligheid kabinet, de cellen een gesteriliseerde, kleine roestvrij-staal-tipped cassette met een peristaltische pomp gebaseerde systeem. Tussen de verschillende cellijnen, spoel de slang van de cassette met 1 x steriele PBS en 70% Ethanol voor 10 s.
- U kunt ook zaad de cellen met behulp van een vloeibare handler gelegen binnen een HEPA-gefilterd robotica-kamer met behulp van een gesteriliseerde, kleine roestvrij-staal-tipped cassette en een peristaltische pomp of de bijgevoegde-spuitpomp, afhankelijk van het volume van de platen per cel lijn nodig.
- Het zegel van de platen met behulp van een ademend zelfklevende plaat zegel ofwel handmatig of met behulp van een plaat sealer.
- Plaats de platen in een draaiende incubator vastgesteldop 10 rpm en 37 ° C gedurende 24 uur vóór de samengestelde toevoeging, met 5% CO2 en 95% relatieve vochtigheid.
3. samengestelde toevoeging
- Maak 8-punts, 3 katernen seriële verdunningen van MAPK remmers in 100% dimethylsulfoxide (DMSO) op een vloeistof-handling robot met de hoogste concentratie van een 10 mM. Het proteasoom-remmers Bortezomib wordt gebruikt als positieve controle voor een volledige cel doden om te bepalen van het dynamisch bereik van de bepaling.
- Quick-spin all assay platen en samengestelde platen op 100 x-g te verzamelen condensatie. De Zelfklevende zegel uit elke plaat verwijderen en plaatsen van een plaat op een akoestische dispenser set-up om toe te voegen voor een totaal van 8 nL van elke stof/verdunning vertegenwoordigen een eindconcentratie van 0,1% DMSO per putje en een top samengestelde dosis van 10 µM.
- Nadat de toevoeging van de verbinding is voltooid, plaats de deksel van een op maat gemaakte, roestvrij stalen cel-cultuur die voorkomt verdamping op de plaat en plaats van de plaat in een incubator van de spinnen bij 37 ° C voor 5 d, met 5% CO2 en 95% relatieve vochtigheid.
4. detectie reagens toevoeging en de verwerving van Raw-gegevens
- Vooraf warm een voldoende volume van lysis van de cel reagens met luciferine om te detecteren veranderingen in adenine adenosinetrifosfaat (ATP) en, dus, veranderingen in de celproliferatie bij kamertemperatuur of in een waterbad 37 ° C. Een totaal van 3 µL van het detectie-reagens toevoegen aan elk putje gebruik een peristaltische pomp en Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende ten minste 15 minuten.
- Het vastleggen van de luminescentie op een plaat luminometer.
5. de verwerking van de gegevens
- Pak de onbewerkte gegevens van het instrument en normaliseren van alle velden die bevatten test verbindingen met het gemiddelde van alle putjes met DMSO alleen als het neutrale besturingselement. Van deze waarde, berekenen de percentage groeiremming van elke stof. Dit is voltooid met behulp van de formule functie in Microsoft Excel waar f (x) = {(genieten van de relatieve waarde licht eenheden (RLUs) / (gemiddelde DMSO waarde RLUs) * 100)}.
- Het genereren van de dosis / respons-curven en remmende IC50s door de waarden van de genormaliseerde gegevens uit stap 5.1 tegen de samengestelde concentratie met behulp van een grafische programma graphing.
Opmerking: We analyseerde de gegevens met behulp van Helios, een interne NIBR softwaretool. Om deze functie te voeren, wij de niet-parametrische kromme Analysetool geselecteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een verscheidenheid van gevestigde kankercel lijnen bekend groeien goed onder 2D kweekomstandigheden werden getest met behulp van de methoden hier. Representatieve beelden uit een verscheidenheid van MAPK mutant kanker cellijnen (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS en KNS-62:HRAS) zijn te zien in Figuur 1. Deze beelden tonen aan dat hoewel de cellijnen verschillende morphologies hebben, elk gevormd 3D structuren in de 1536-well assay-platen. Figuur 2 toont aan dat, wanneer gebruikt voor grootschalig onderzoek, kan differentiële samengestelde gevoeligheid tussen culturen gegroeid in 2D versus die in 3D worden waargenomen. Elke stip op de grafiek vertegenwoordigt remmende concentratie van een stof waar er een 50% cel doden of van de compound IC50 reactie in beide instellingen. Om aan te tonen dat het effect niet uitsluitend door de verschillende media is bemiddeld, werden Calu-6 cellen gekweekt in de dezelfde media met 2D weefsel-gekweekte platen of 3D Scivax biofilm platen die bijlage voorkomen. De verhoogde gevoeligheid of lagere IC50 voor de 3D groei voorwaarde wordt gezien in aanvullende figuur 1 voor twee verbindingen in hetzelfde medium. Lijnen zoals Calu-6 tonen een verhoogde gevoeligheid voor de stoffen als volwassen 3D omstandigheden, terwijl de lijnen zoals SK-MEL-30 zijn in 3D ten opzichte van 2D minder gevoelig. Tabel 1 bevat extra achtergrondinformatie over de cellijnen die werden gebruikt in dit scherm.
Voorbeelden van representatieve dosis / respons-curven worden gevisualiseerd in Figuur 3. Dit cijfer toont de differentiële werkzaamheid van twee stoffen, RAF265 (Figuur 3 bis) en RAF709 (figuur 3B), die de activiteit van RAF kinases remmen. Beide verbindingen zijn meer potente in 3D voorwaarden in Calu-6, wat een niet-kleincellige longkanker lijn herbergen Q61K, een activerende mutatie in het KRAS-eiwit. Op hetzelfde moment zijn beide verbindingen ook krachtig in de 3D-spheroïden en 2D culturen uit de HCT116 dikke darm kanker lijn, waarin de G13D-activeren-mutatie bij KRAS. Om aan te tonen dat het effect van de verhoogde gevoeligheid wordt gemedieerd door de toestand van de groei van 3D versus 2D en niet alleen door de verschillende media voorwaarden, Calu-6 cellen waren gegroeid met FBS onder beide voorwaarden. Zoals gezien in aanvullende figuur 1, wanneer de voorwaarden van zowel 2D als 3D gebruik FBS, toont de 3D cultuur nog steeds een verhoogde gevoeligheid voor de productie van een lagere IC50 verbindingen.
Tot slot, de 3D bepaling ook toegestaan een observatie van het verschijnsel van de paradoxale groei activering, waarvan bekend is dat het zich voordoen als er een onvolledige inhibitie van RAF Dimeren in zeer geactiveerde RAS mutant lijnen, en niet in het dimeer-onafhankelijk traject activering gevonden in BRAF V600E mutaties11,12. Deze activering is te zien in Figuur 4, op een behandeling met de BRAF remmer Dabrafenib 3D omstandigheden in KNS-62, een kleine HRAS-gemuteerde cel long kanker lijn, en ook in de atypische-BRAF mutant alvleesklier cel lijn BxPC-3. De groei wordt geactiveerd bij lage concentraties van de drug en de groei wordt alleen onderdrukt bij hoge concentraties van de drug (figuur 4B). Deze activering was verrassend niet gezien in de KRAS mutant lijn Calu-6 en is niet te verwachten in de V600E BRAF mutant lijn A375. Wij hebben geconstateerd dat een paradoxale activering van Calu-6 met behulp van andere 3D groei modellen (gegevens niet worden weergegeven).
Figuur 1: representatieve beelden van kankercellen groeien in 3D 1536-Wells-platen. Cellen werden verguld voor een totaal van 3 d in 1536-Wells-platen met behulp van een reagens dispenser en een kleine cassette. Bright-veld beelden, verworven op een omgekeerde Microscoop met behulp van een 4 X lens, tonen de verschillende 3D-morphologies in de mutant cellijnen MAPK Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS en KNS-62:HRAS. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: een vergelijking van de 2D - ten opzichte van de 3D-compound werkzaamheid over cellijnen scatterplot. Spheroïden, die eerder voor 3 d werden gegenereerd, werden vervolgens behandeld met verbindingen voor een extra 5 d voordat de samengestelde doeltreffendheid werd vastgesteld. Elke cirkel vertegenwoordigt een uniek samengestelde reactie. Veranderingen in de celproliferatie werden waargenomen met behulp van een reagens lytische cel proliferatie, en IC50s werden berekend aan de hand van een vier-parameter logistische regressie-analyse met de interne software genaamd Helios. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: dosis / respons-curven vergelijken 2D - en 3D-compound werkzaamheid. De dosis / respons-curven de samengestelde doelmatigheid ten opzichte van de besturingselementen DMSO aan te tonen. De curven van de KRAS mutant Calu-6 en HCT116 cellen behandeld met twee RAF-remmers, RAF265 en RAF709, worden hier weergegeven als een percentage in de verandering in de celgroei (remming van de groei van de %) in vergelijking met de DMSO controle putten. Een bevolking van cellen die zijn geteeld in 2D omstandigheden in het rood weergegeven en die gegroeid als 3D spheroïden zijn in het blauw. De ononderbroken lijnen rond de gegevens geven de 95%-betrouwbaarheidsintervallen voor iedere gegevensverzameling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: bepaalde 3D culturen vangen de verschijnselen van paradoxale groei activering. De dosis / respons-curven de samengestelde doelmatigheid (remming van de groei van de %) in vergelijking met de DMSO besturingselementen aan te tonen. De curven van de KRAS mutant Calu-6, BRAF V600E mutant A375 HRAS mutant KNS-62 en de atypische BRAF BxPC-3 mutantcellen behandeld met een paradoxale activator Dabrafenib worden hier weergegeven. Een bevolking van cellen die zijn geteeld in 2D omstandigheden in het rood weergegeven en die gegroeid als 3D spheroïden zijn in het blauw. De ononderbroken lijnen rond de gegevens geven de 95%-betrouwbaarheidsintervallen voor iedere gegevensverzameling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 1: dosis / respons-curven vergelijken de 2D - ten opzichte van de 3D-compound werkzaamheid in FBS met media. De dosis / respons-curven de samengestelde doelmatigheid ten opzichte van de besturingselementen DMSO aan te tonen. De curven van de KRAS Calu-6 mutantcellen behandeld met twee RAF-remmers, RAF265 en RAF709, worden hier weergegeven als een percentage in de verandering in de celgroei (remming van de groei van de %) in vergelijking met de DMSO controle putten. Een bevolking van cellen die zijn geteeld in 2D omstandigheden in het rood weergegeven en die gegroeid als 3D spheroïden zijn in het blauw. Beide voorwaarden FBS-bevattende media gebruiken. De foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties uit 2 afzonderlijke gegevenssets. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Cel Lijnnaam | Afkomst | BRAF | RAS |
| A-375 | Melanoom | V600E | WT |
| BxPC-3 | Alvleesklier | V487-P492 > A | WT |
| Calu6 | Niet-kleincellige longkanker | WT | KRAS Q61K |
| HCT 116 | Colorectale | WT | KRAS G13C |
| IPC-298 | Melanoom | WT | NRI 'S Q61L |
| KNS-62 | Squamous Lung | WT | HRAS Q61L |
| NCI-H1299 | Long | WT | NRI 'S G12D |
| PANC-1 | Alvleesklier | WT | KRAS G12D |
| SKMEL-30 | Melanoom | WT | NRI 'S Q61K |
Tabel 1: Cel regelgegevens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde methoden aantonen een gedetailleerd protocol over het produceren van tumor spheroïden in 1536-Wells-platen voor grootschalige samengestelde screenings. Deze methoden zijn in eerste instantie aangepast vanaf werk aan het National Cancer Institute, waar de tumor spheroïden werden geteeld in lage-throughput assays in 6-well en 96-wells-platen om vragen te stellen over genetische afhankelijkheden en samengestelde gevoeligheid13, 14 , 15. een kritische en unieke kenmerk van dit protocol is dat de spheroïden worden gevormd uit traditionele 2D weefsel-gekweekte cellen in 1536-platen met behulp van gedefinieerd media genoemd SCM + KO + ITS. Zodra de cellen worden overgeënt, zijn ze verzegeld met ademend zelfklevende plaat zegels om te voorkomen dat eventuele verdamping gedurende de looptijd van de 3 d sferoïde vorming. Spheroïden kunnen ook worden gekweekt voor langere tijd met behulp van deze aanpak-16. Na 3 d van bol formatie, verbindingen toegevoegd voor 5 d voor de keuring van de veranderingen in de celgroei van de met een reagens lytische gebaseerde proliferatie. Na normalisatie aan de controleputjes en berekening van IC50s tussen cellen gekweekt in 2D vs. 3D, de veranderingen in de cellen van stof-behandeld worden vergeleken met de controle-behandelde cellen.
Sinds de 1536-well platen zijn regelmatige weefsel-behandelde platen en niet hydrogel-bekleed of cel repellent platen, een beperking van dit protocol is het gebruik van de beschreven medium, die een kritieke factor aan de succesvolle uitvoering van dit protocol. De vervanging van de serum KO was in eerste instantie getest op haar vermogen om met succes in de groei van embryonale stamcellen in 3D17 en in dit protocol is aangepast voor de groei van vele tumor sferoïde lijnen13,15, 18 , 19. om op te merken is dat, hoewel de media voorwaarden verschillend zijn voor de groei van de 2D ten opzichte van de 3D spheroïden cellen, wij eerder hebben aangetoond dat de Differentiele effecten van de drug gevoeligheid zijn gemedieerd door het formaat van de groei, en niet gewoon de verschillen in media samenstelling9.
Om het welslagen van dit protocol, als een procedure voor probleemoplossing, wordt voorgesteld dat een reeks assay ontwikkeling experimenten eerst voor het optimaliseren van elke cel regel alvorens op een grootschalige scherm worden uitgevoerd. In dit voorbeeld werden alle van de cellijnen vehiculumcontrolegroep eerst geëvalueerd om te bepalen als zij kon worden ontpit op de dezelfde begin dichtheid van 500 cellen per putje. Ze werden vervolgens vehiculumcontrolegroep met DMSO-alleen platen standaarddeviaties (SD) en de coëfficiënten van variantie (CVs) voor de duur van de groeiperiode te onderzoeken. Zelfs met de ontwikkeling van deze bepaling in plaats, bepaalde lijnen groeide sneller dan anderen en het zou geweest zijn gunstig voor de seeding dichtheden en de duur van het experiment van deze meer uitdagende lijnen verder te optimaliseren. Tot slot, de hier gepresenteerde gegevens aantonen dat er is een tendens, in plaats van een universeel fenomeen, voor bepaalde cellijnen als de NKCLK lijn Calu-6 te uniek gevoeliger voor verbindingen die zijn gericht op het traject van de MAPK in 3D in vergelijking met die geteeld in 2D. Extra experimenten zijn gaande om te bepalen wat biologische mechanismen kunnen bijdragen aan het reguleren van dit opvallende verschil in gevoeligheid.
De mogelijkheid om scherm spheroïden in een ultra-HTS instelling kunt 3D culturen te vroeg in het detectieproces van de drug worden gebruikt en kan de identificatie van nieuwe chemische stof die is alleen actief in een 3D omgeving. Met kon zo veel klinische kandidaten nooit bereiken van de markt als gevolg van een gebrek aan doeltreffendheid bij patiënten, zij tonen groei remming in vitro en regressie in vivo, teams zijn begonnen verhoor of uitvoering van 3D testen Deze kloof eerder tijdens het detectieproces. Er bestaan een aantal verschillende plaat typen aan cultuur cellen in 3D bij het gebruik van 96-Wells of 384-well methoden. Wij hebben hier, 1536-well methoden die meerdere foci van individuele spheroïden produceren ingediend. In de toekomst kunnen deze bevindingen worden vergeleken met vergelijkbare schermen met behulp van nieuwe technologieën die in ontwikkeling zoals 1536-Wells-platen die cellen als opknoping druppels kunnen groeien of platen die zijn bekleed met een hydrogel/Matrigel en die ronde bodem, die zou voorzien in de vorming van één bol per putje. Deze voorwaarden zou introduceren extra lagen van ingewikkeldheid aan de kweekomstandigheden gebruikt voor screening, waardoor ze zelfs meer fysiologisch relevant, en kon potentieel vertegenwoordigen een verhoogd tarief van de vertaling van bench naar bedside voor roman therapieën. Deze technologieën zouden ook wetenschappelijke vragen waarbij hypoxie of diffusie verlopen, waarvoor het gebruik van grotere spheroïden.
De methoden gepresenteerd hier gericht op screening van deze spheroïden tegen een klein molecuul bibliotheek met verbindingen. Deze methoden kunnen in de toekomst uitbreiden naar scherm voor roman biologics en biotherapeutics zoals bi-specifieke antilichamen of antilichaam-drug geconjugeerde, waar 3D culturen meer fysiologisch relevante antilichaam-antigeen interactie kunnen bieden. Bovendien kan het gebruik van 3D-spheroïden worden cruciaal voor het ontwikkelen van de ziekte-relevante tests voor begrip doelstellingen en interventies in de opkomende immuno-oncologie ruimte21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs zijn werknemers van Novartis, en sommige werknemers zijn ook aandeelhouders.
Acknowledgments
De auteurs wil erkennen Marc Ferrer aan het National Center for Advancing translationeel Sciences, National Institutes of Health voor zijn steun en begeleiding op de initiële ontwikkeling van deze tests. Daarnaast zouden we graag bedanken Alyson Freeman, Mariela Jaskelioff, Michael Acker, Jacob Haling en Vesselina Cooke voor hun wetenschappelijke inbreng en discussie als project teamleden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | ATCC | 30-2006 | Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors. |
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | Lonza | 12-604F | Purchased as a prepared solution. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Lonza | 12-115Q | Purchased as a prepared solution. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Hyclone | SH30042.01 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Purchased as a prepared solution. |
| 10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | Resuspend in sterile water. |
| 20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644 | Resuspend in sterile water. |
| 0.4% Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418 | Resuspend in sterile PBS and filter. |
| 1x Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Gibco | 51500056 | |
| 1% KnockOut (KO) Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | Add fresh right before use. |
| 100% Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7573 | Purchased as a prepared solution. |
| Consumables | |||
| Small Combi Cassette | ThermoFisher | 24073295 | |
| Small Multiflow Cassette | BioTek | 294085 | |
| 1536-well sterile TC plates (white) | Corning | 3727 | |
| 1536-well sterile TC plates (black) | Corning | 3893 | |
| Scivax Plates | MBL International | NCP-LH384-10 | |
| Equipment | |||
| Adhesives seals | ThermoFisher | AB0718 | |
| Spinning Incubator | LiCONiC | ||
| Stainless Steel Lids | The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF) | ||
| ATS Acoustic Dispensor | EDS Biosystems | ||
| Echo Acoustic Dispensor | Labcyte | ||
| Luminometer | Envision-Perkin Elmer | ||
| Peristaltic Pump- Multidrop Combi | ThermoFisher | ||
| Liquid Handler-Multiflow FX | BioTek |
References
- Lee, M., Vasioukhin, V. Cell polarity and cancer--cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor. Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69, 42-51 (2014).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 332 (3), 821-828 (2010).
- Li, L., Lu, Y. Optimizing a 3D Culture System to Study the Interaction between Epithelial Breast Cancer and Its Surrounding Fibroblasts. Journal of Cancer. 2, 458-466 (2011).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. 3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies. Journal of Cell Communication and Signaling. 5 (3), 239-248 (2011).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
- Mathews Griner, L. A., et al. Large-scale pharmacological profiling of 3D tumor models of cancer cells. Cell Death & Disease. 7 (12), e2492 (2016).
- Polo, M. L., et al. Responsiveness to PI3K and MEK inhibitors in breast cancer. Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice. PLoS One. 5 (5), e10786 (2010).
- Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
- Bhargava, A., et al. Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Elife. 5, e09976 (2016).
- Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells. Molecular Cancer. 9, 267 (2010).
- Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer. Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).
- Mathews, L. A., et al. Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells. Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).
- Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
- Sun, L., et al. Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells. Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).
- Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
- Mathews Griner, L. A., et al. High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).
- Herter, S., et al. A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).
