Summary
En una amplia variedad de indicaciones de enfermedad, modelos más fisiológico relevantes están siendo programas de descubrimiento de drogas desarrollado e implementado en. El nuevo sistema del modelo aquí descrito muestra tumor cómo tridimensional de esferoides pueden ser cultivados y defendidos en un sistema de base de placa de alto rendimiento 1536-bien buscar nuevos medicamentos de Oncología.
Abstract
Las células cancerosas han sido cultivadas habitualmente en dos dimensiones (2D) en una superficie de plástico. Esta técnica, sin embargo, carece de un tumor verdadero medio ambiente masa está expuesta a en vivo. Tumores sólidos crecen no como una hoja de plástico, pero en su lugar como una colección de células clonales en una tridimensional (3D) espacio interactuando con sus vecinos y con distintas propiedades espaciales como la alteración de la polaridad celular normal. Estas interacciones provocan las células cultivadas 3D adquieren características morfológicas y celulares que son más relevantes para tumores en vivo . Además, un tumor masa está en contacto directo con otros tipos celulares como células stromal e inmunes, así como la matriz extracelular de todos los tipos de célula. La matriz depositada se compone de macromoléculas como colágeno y fibronectina.
En un intento por aumentar la traducción de resultados de la investigación en oncología de banco a cabecera, muchos grupos han comenzado a investigar el uso de sistemas de modelo 3D en sus estrategias de desarrollo de drogas. Estos sistemas son probablemente más fisiológico relevantes porque intentar recapitular el ambiente complejo y heterogéneo de un tumor. Estos sistemas, sin embargo, pueden ser bastante complejos y, aunque susceptibles de crecimiento en formatos de 96 pozos y algunos incluso en 384, ofrecen pocas opciones para el crecimiento a gran escala y proyección. Esto observado diferencia ha conducido al desarrollo de los métodos descritos aquí en detalle esferoides tumorales de cultura en una capacidad de alto rendimiento en placas 1536 pocillos. Estos métodos representan un compromiso para los sistemas basados en matriz muy complejos, que son difíciles de pantalla y los análisis 2D convencionales. Una variedad de líneas celulares de cáncer que diferentes mutaciones genéticas son correctamente evaluados, examinar eficacia compuesto mediante el uso de una biblioteca de comisariado de compuestos contra el camino del Kinase de proteína Mitogen-Activated o MAPK. Las respuestas de la cultura de esferoide entonces se compararon con la respuesta de las células cultivadas en 2D, y se divulgan actividades diferenciadas. Estos métodos proporcionan un protocolo único para las pruebas de actividad compuesto en un entorno 3D de alto rendimiento.
Introduction
En la última década, cada vez más estudios han implementado el uso de modelos de cultura celular 3D para entender conceptos que no son completamente recapitulados por cultivo de células en 2D en el plástico. Ejemplos de estos conceptos incluyen las alteraciones en células epiteliales normales polaridad1 donde la orientación espacial de las capas basals y apicales de las células se pierden, así como el papel de la matriz extracelular en la regulación de la supervivencia y el destino celular. Investigación oncológica, en particular, ha utilizado modelos 3D para entender la biología básica de las células cancerosas y las diferencias entre 2D y 3D de la célula cultura sistemas3,4. El desarrollo de técnicas más sofisticadas de la cultura de célula y su posterior adaptación a formatos múltiples bien ha permitido la búsqueda de nuevos fármacos en entornos 3D. En contraste con las células cultivadas bajo condiciones de 2D, modelos en 3D de la gama de tumores en la complejidad de sistemas celulares5 esferas solo tipo de células de diferentes tamaños, esferas de celdas de tipo complejo6,7, 8. el descubrimiento de nuevos compuestos o productos biológicos que potentemente inducen muerte celular en estos sistemas de modelo 3D es, por tanto, de gran interés en las campañas de desarrollo de drogas. Puntos finales de estos ensayos son a menudo idénticos a los realizados en culturas 2D para evaluar los cambios en la proliferación celular, pero cuando llevó a cabo en un entorno más fisiológicamente relevante, puede revelar el verdadero nivel de dependencia de la gene de la blanco o vía interrogado.
Como anteriormente, se han desarrollado una variedad de sistemas modelo para estudiar las respuestas de la droga en los sistemas de cultivo 3D, pero la mayoría utiliza o placas de microtitulación de 96 o 384 pocillos y no es fácilmente adaptable a los formatos de high-throughput screening (HTS) de uso frecuente en campañas de proyección de descubrimiento de drogas. Tales sistemas incluyen el uso de colgantes tecnologías de gotita, culturas del esferoide, pulsátil de las células con partículas magnéticas para inducir la levitación y las culturas incorpora geles naturales o sintéticos tales como colágeno, Matrigel o polietilenglicol (PEG)2 . Aquí, presentamos los métodos detallados de una técnica previamente desarrollado para producir cultivos 3D esferoide de líneas celulares de cáncer establecido en un formato de placa de la pozo 1536. En este protocolo, se utiliza un medio altamente definido que evita que el accesorio de celular normalmente adherente líneas9. Este sistema tiene limitaciones (es decir, no puede recapitular completamente un sistema modelo complejo de cáncer), pero sin embargo, estos ensayos permiten una proyección de alto rendimiento de grandes colecciones de moléculas pequeñas y transversales comparaciones de la respuesta de la droga entre las culturas 2D y 3D contra una variedad de líneas de células y compuestos.
Las líneas celulares seleccionaron para demostrar los métodos en este artículo todo Puerto mutaciones en genes relacionados con la vía, un camino que es muy desequilibrada en el cáncer, de señalización de MAPK y de que muchos tratamientos están disponibles. Muchas de las líneas tienen activación oncogénicas mutaciones en el virus del Sarcoma de rata Kirsten también denominado KRAS, el RAS de Neuroblastoma o ANR, oncogene del virus del Sarcoma de Harvey rata o HRAS y las quinasas asociadas rápidamente acelerado Fibrosarcomas, también conocido como RAFs. La literatura reciente sugiere que los inhibidores de distintos nodos de esta vía son únicamente más eficaces en un subgrupo de las líneas celulares cuando se cultivan bajo condiciones 3D9,10. Un estudio encontró que cuando las células cancerosas con RAS activa fueron cultivadas en 3D, demostró una mayor sensibilidad a los inhibidores de la MAPK y además, que este enfoque podría identificar vías y dirigido inhibidores que podrían perderse en el tradicional 2D ajuste. El objetivo de este estudio es presentar los métodos utilizados para estas líneas celulares de la cultura, y además, para demostrar el diferencial de las respuestas a estos inhibidores que se pueden observar solamente cuando se usa 3D celular sistemas de cultivo.
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Protocol
1. cultivo de esferoides de Tumor bien 1536 3D
- Preparar un tallo mediano fresco 3D tumor esferoide (medio celular + recambio de nocaut suero insulina-transferrina-selenio) mediante la adición de los reactivos siguientes a 500 mL de medio de águilas modificado de Dulbecco (DMEM/F12): 1 x penicilina/estreptomicina, 10 ng/mL de humanos factor de crecimiento básico del fibroblasto (bFGF), 20 ng/mL de humano factor de crecimiento epidérmico (EGF), 0.4% albúmina de suero bovino (BSA) (fracción V), 1 x insulina-transferrina-selenio y el reemplazo de suero 1% nocaut (KO) (no hielo-deshielo).
- Filtro-esterilizar el medio entero con los suplementos a través de un sistema de filtro superior de la botella 0.4 μm.
- Separar las líneas celulares de cáncer, que han ido creciendo según condiciones de cultivo de rutina recomendados, de los frascos tradicionales de cultivo de células lavándolas x 3 con fosfato 1 x tampón salino (PBS) y agregar una cantidad apropiada de tripsina 0.25% (1 mL por 5 cm2) durante 5 minutos crear una fina capa sobre las células. Neutralizar la tripsina con 5 veces la cantidad de medio que contiene el suero y proceder a contar las células. Por ejemplo, utilizar 25 mL de medio de 5 mL de tripsina.
- Ajustar la concentración de la solución de células a 62,5 x 104 células/mL para un total de 500 células por pocillo en 8 μl del medio del esferoide de la semilla en las placas de tejido-cultura-Tratado de 1536-bien.
- En un gabinete de seguridad biológica, las células usando un cassette de punta de acero inoxidable esterilizado, pequeño con un sistema basado en la bomba peristáltica de la semilla. Entre diferentes líneas celulares, limpie el tubo del casete con 1 x PBS y el 70% de etanol durante 10 s.
- Por otra parte, la semilla las células usando un controlador líquido situado dentro de un cuarto de HEPA-filtrado utilizando una cinta esterilizada, la pequeña punta de acero inoxidable y una bomba peristáltica o una bomba de jeringa adjunta, dependiendo del número de placas por línea celular es necesitada.
- Sellar las placas usando un sello de placa adhesiva transpirable ya sea manualmente o usando un sellador de placas.
- Coloque las placas en una incubadora de spinning de 10 rpm y 37 ° C con 5% dióxido de carbono (CO2) y 95% de humedad relativa. Permita que los esferoides a forma d 3.
2. cultivo de 1536-bien 2D del cáncer
Nota: Las líneas de cáncer 2D 1536-bien se deben cultivar 24 h antes de la adición del compuesto a las placas 3D.
- Preparar un medio de células de cáncer 2D mediante la adición de los reactivos siguientes a 500 mL de un medio de crecimiento apropiado para las líneas seleccionadas: 1 x penicilina/estreptomicina y 10% suero fetal bovino (FBS).
- Filtro-esterilizar el medio entero con los suplementos a través de un sistema de filtro superior de la botella 0.4 μm.
- Separar las líneas celulares de cáncer, que han ido creciendo según condiciones de cultivo de rutina recomendados, de los frascos tradicionales de cultivo de células lavándolas 3 x 1 x PBS y agregar una cantidad apropiada de tripsina 0.25% (1 mL por 5 cm2) por 5 min a crear una capa fina sobre las células. Neutralizar la tripsina con 5 veces la cantidad de medio que contiene el suero y proceder a contar las células. Por ejemplo, utilizar 25 mL de medio de 5 mL de tripsina.
- Ajustar la concentración de la solución de células a 62,5 x 104 células/mL para un total de 500 células por pocillo en 8 μl de medio completo de semillas en placas tratados con tejido y cultura 1536-bien.
- En un gabinete de seguridad biológica, las células usando un cassette de punta de acero inoxidable esterilizado, pequeño con un sistema basado en la bomba peristáltica de la semilla. Entre las diferentes líneas celulares, limpie el tubo del casete con 1 x PBS estéril y el 70% de etanol durante 10 s.
- Por otra parte, la semilla las células usando un controlador líquido situado dentro de una sala de robótica HEPA-filtrado usando un cassette de punta de acero inoxidable esterilizado, pequeño y una bomba peristáltica o la bomba de jeringa adjunta, según el volumen de las placas por celda línea necesitada.
- Sellar las placas usando un sello de placa adhesiva transpirable ya sea manualmente o usando un sellador de placas.
- Coloque las placas en una incubadora de spinning de 10 rpm y 37 ° C durante 24 h antes de la adición compuesta, con 5% CO2 y 95% de humedad relativa.
3. adición de compuestos
- Preparar diluciones de 8 puntos, 3-fold serie de inhibidores de la MAPK en 100% de dimetilsulfóxido (DMSO) en un robot de manipulación de líquidos con una concentración superior de 10 mM. El inhibidor de proteasoma Bortezomib se utiliza como control positivo de una celda completa matando para determinar el rango dinámico del ensayo.
- Centrifugado rápido todo ensayo placas y placas compuestas a 100 x g para recoger la condensación. Retire el sello adhesivo de cada placa y coloque una placa en una configuración acústica dispensador para agregar un total de 8 nL de cada compuesto/dilución representando a una concentración final de 0.1% DMSO por pozo y una dosis superior compuesta de 10 μm.
- Una vez finalizada la adición del compuesto, coloque una tapa de cultura de célula a medida, acero inoxidable que previene la evaporación de la placa y coloca la placa en una incubadora de spinning a 37 ° C durante 5 d, con 5% CO2 y 95% de humedad relativa.
4. adición de reactivo detección y adquisición de datos
- Precaliente un volumen adecuado de un reactivo de lisis de la célula que contiene luciferin para detectar cambios en trifosfato de adenina (ATP) y, por lo tanto, en la proliferación celular a temperatura ambiente o en baño de agua de 37 ° C. Añadir un total de 3 μl del reactivo de detección a cada pocillo utilizando una bomba peristáltica e incubar la placa a temperatura ambiente durante al menos 15 minutos.
- Captura de la luminiscencia en un luminómetro de placa.
5. procesamiento de datos
- Extraer los datos en bruto del instrumento y normalizar todos los campos que contienen compuestos de prueba para la media de todos los pozos que contiene DMSO solamente como el control neutral. Calcular a partir de este valor, la inhibición del crecimiento porcentual de cada uno de ellos. Esto se ha completado utilizando la función fórmula en Microsoft Excel donde f (x) = {(muestra unidades de luz relativas de valor (RLUs) / (promedio de valor de DMSO RLUs) * 100)}.
- Generar las curvas de dosis-respuesta y IC50s inhibitorio graficando los valores de los datos normalizados de medida 5.1 contra la concentración de compuesto utilizando un programa de graficación.
Nota: Se analizaron los datos utilizando Helios, una herramienta de software interna de NIBR. Para completar esta función, seleccionamos la herramienta de análisis no paramétrico de la curva.
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Representative Results
Una variedad de células de cáncer establecido líneas que crecen bien bajo condiciones de cultivo 2D se analizaron usando los métodos descritos aquí. Imágenes representativas de una variedad de cáncer mutante MAPK líneas celulares (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS y KNS-62:HRAS) se ven en la figura 1. Estas imágenes demuestran que aunque las líneas celulares tienen morfologías diferentes, cada uno formado estructuras 3D en las placas de ensayo de 1536-bien. Figura 2 muestra, cuando se utiliza para la proyección a gran escala, sensibilidad diferencial compuesto entre culturas cultivadas en 2D y en 3D se observan. Cada punto en el gráfico representa la concentración inhibitoria de un compuesto donde existe una muerte celular 50% o respuesta de IC50 de compuesto en ambos entornos. Para demostrar que el efecto no es mediado solamente por los diferentes medios de comunicación, Calu-6 células fueron cultivadas en el mismo medio utilizando placas de cultivo de tejido 2D o 3D Scivax biofilm las placas que impiden la fijación. El aumento de la sensibilidad o menor CI50 para la condición de crecimiento 3D se ve en la figura 1 complementaria para dos compuestos en el mismo medio. Líneas como Calu-6 muestran una mayor sensibilidad a los compuestos cuando se cultiva bajo condiciones de 3D, mientras que líneas como SK-MEL-30 son menos sensibles en 3D en comparación con el 2D. La tabla 1 incluye información adicional acerca de todas las líneas celulares que se utilizaron en esta pantalla.
Ejemplos de curvas de dosis-respuesta a representante se visualizan en la figura 3. Esta cifra demuestra la eficacia diferencial de dos compuestos, RAF265 (Figura 3A) y RAF709 (figura 3B), que inhiben la actividad de quinasas RAF. Ambos compuestos son más potentes en 3D condiciones Calu-6, que es un cáncer de pulmón de células no pequeñas línea que Q61K, una mutación activante de la proteína KRAS. Al mismo tiempo, ambos compuestos son igualmente potentes en los esferoides 3D y 2D culturas desde la línea de cáncer de colon HCT116, que contiene la mutación activadora de G13D en KRAS. Para demostrar que el efecto de la mayor sensibilidad está mediado por la condición de crecimiento de 3D y 2D y no simplemente por las condiciones de los diferentes medios de comunicación, Calu-6 células fueron cultivadas con FBS en ambas condiciones. Como se ve en figura 1 complementaria, cuando las condiciones tanto en 2D como en 3D utilizan FBS, la cultura 3D todavía muestra un aumento de la sensibilidad a los compuestos produciendo un IC50 inferior.
Por último, el ensayo 3D también permite una observación del fenómeno de activación paradójica de crecimiento, que se sabe que ocurre cuando hay una inhibición incompleta de dímeros de la RAF en altamente activada RAS líneas mutantes y no en la vía independiente de dímero activación en BRAF V600E mutaciones11,12. Esta activación se ve en la figura 4, sobre el tratamiento con el inhibidor BRAF Dabrafenib condiciones 3D KNS-62, un pequeño HRAS-transformado línea de cáncer de pulmón de la célula y también en la célula pancreática mutante BRAF atípica línea BxPC-3. El crecimiento se activa a bajas concentraciones de la droga, y el crecimiento sólo es reprimido en las altas concentraciones de la droga (Figura 4B). Esta activación sorprendentemente no fue vista en la línea mutante de KRAS Calu-6 y no debe esperar en la línea mutante BRAF V600E A375. Hemos observado una activación paradójica de Calu-6 otros modelos de crecimiento 3D (datos no mostrados).
Figura 1: imágenes representativas de las células cancerosas crecen en placas de 1536 pocillos 3D. Las células fueron plateadas para un total de 3 d en placas 1536-bien mediante un dispensador de reactivo y un casete pequeño. Imágenes del brillante-campo, adquiridos en un microscopio invertido con una lente de X 4, demuestran las diversas morfologías 3D en las líneas de la célula del mutante de MAPK Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS y KNS-62:HRAS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: un diagrama de dispersión comparando el 2D versus 3D-compuesto de la eficacia a través de líneas de celular. Esferoides, que previamente fueron generadas para 3 d, luego fueron tratadas con compuestos para un adicional 5 d antes de que se determinó la eficacia compuesta. Cada círculo representa una respuesta compuesta única. Cambios en la proliferación de célula fueron detectadas usando un reactivo de proliferación celular lítica, y IC50s se calcularon mediante un análisis de cuatro parámetros de regresión logística con el software interno llamado Helios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: curvas de dosis-respuesta comparando 2D versus 3D compuesto eficacia. Las curvas dosis-respuesta demuestran la eficacia compuesta en comparación con los controles de DMSO. Las curvas de las KRAS mutante Calu-6 y células HCT116 tratadas con dos inhibidores de RAF, RAF265 y RAF709, aparecen aquí como un porcentaje en el cambio en el crecimiento celular (% inhibición del crecimiento) en comparación con el DMSO control de pozos. Una población de las células que fueron cultivadas bajo condiciones 2D aparece en rojo, y los cultiva como esferoides 3D están en azul. Las líneas sólidas alrededor de los datos indican intervalos de confianza del 95% para cada conjunto de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: algunas culturas 3D capturan los fenómenos de activación del crecimiento paradójico. Las curvas dosis-respuesta demuestran la eficacia compuesta (% inhibición del crecimiento) en comparación con los controles de DMSO. Las curvas de los mutantes KRAS Calu-6, mutante BRAF V600E A375, mutante HRAS KNS-62 y el BRAF mutante BxPC-3 células anormales con un paradójico activador Dabrafenib se muestran aquí. Una población de las células que fueron cultivadas bajo condiciones 2D aparece en rojo, y los cultiva como esferoides 3D están en azul. Las líneas sólidas alrededor de los datos indican intervalos de confianza del 95% para cada conjunto de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementario Figura 1: curvas de dosis-respuesta comparando el 2D versus 3D-compuesto eficacia en equipos que contengan medios. Las curvas dosis-respuesta demuestran la eficacia compuesta en comparación con los controles de DMSO. Las curvas de las KRAS mutante Calu-6 las células tratadas con dos inhibidores de RAF, RAF265 y RAF709, aparecen aquí como un porcentaje en el cambio en el crecimiento celular (% inhibición del crecimiento) en comparación con el DMSO control de pozos. Una población de las células que fueron cultivadas bajo condiciones 2D aparece en rojo, y los cultiva como esferoides 3D están en azul. Ambas condiciones utilizan los medios de comunicación que contiene FBS. Las barras de error representan desviaciones de 2 conjuntos de datos individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre de la línea celular | Linaje | BRAF | RAS |
| A-375 | Melanoma | V600E | WT |
| BxPC-3 | Pancreático | P492 V487 > A | WT |
| Calu6 | Cáncer de pulmón de células no pequeñas | WT | KRAS Q61K |
| HCT 116 | Colorrectal | WT | KRAS G13C |
| IPC-298 | Melanoma | WT | Q61L DE LA ANR |
| KNS-62 | Pulmón squamous | WT | Q61L HRAS |
| NCI-H1299 | Pulmón | WT | G12D DE LA ANR |
| PANC-1 | Pancreático | WT | KRAS G12D |
| SKMEL-30 | Melanoma | WT | Q61K DE LA ANR |
Tabla 1: Información de línea de celular.
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Discussion
Los métodos presentados aquí demuestran un protocolo detallado en cómo producir esferoides tumorales en placas 1536 pocillos para proyecciones a gran escala de compuestos. Estos métodos fueron inicialmente adaptados del trabajo del Instituto Nacional del cáncer donde esferoides tumorales fueron cultivadas en los ensayos de rendimiento bajo en placas bien 6 y 96 pocillos para hacer preguntas sobre las dependencias genéticas y sensibilidad compuesto13, 14 , 15. una característica fundamental y única de este protocolo es que los esferoides son formados de células cultivadas tejido tradicionales 2D en 1536 placas usando define los medios de comunicación denominan SCM + KO + su. Una vez que las células se siembran en, que están sellados con sellos de placa adhesiva transpirable para evitar cualquier evaporación sobre la duración de la formación del esferoide d 3. Esferoides también pueden ser cultivados por períodos más largos de tiempo usando este enfoque16. Después de 3 d de formación de esfera, compuestos se agregan durante 5 d antes del ensayo los cambios en el crecimiento de la célula con un reactivo lítico basado en proliferación. Después de la normalización a los pozos de control y cálculo de IC50s entre las células cultivadas en 2D vs 3D, los cambios en las células tratadas con compuestos son en comparación con las células tratadas con control.
Desde el pozo 1536 placas son placas de tejido tratado regulares y placas de hidrogel cubierto o repelente de la célula, una limitación de este protocolo es el uso del medio definido, que es un factor crítico para la ejecución exitosa de este protocolo. La reposición de suero KO fue probada inicialmente por su capacidad para ayudar con éxito en el crecimiento de las células madre embrionarias en 3D17 y en el presente Protocolo ha sido adaptada para el crecimiento de muchos tumor esferoide líneas13,15, 18 , 19. tener en cuenta es que, aunque las condiciones de los medios de comunicación son diferentes para el crecimiento de la 2D células esferoides versus 3D, que tenemos previamente demostró que los efectos diferenciales de la sensibilidad de la droga están mediados por el formato de crecimiento y no simplemente las diferencias en la composición de los medios de comunicación9.
Para garantizar el éxito de este protocolo, como un paso de solución de problemas, se sugiere que una serie de experimentos de desarrollo de ensayo primero se llevan a cabo para optimizar cada línea celular antes de embarcarse en una gran pantalla. En este ejemplo, primero todas las líneas celulares analizadas fueron evaluados para determinar si podrían ser sembradas en la misma partida densidad de 500 células por pocillo. Luego fueron analizadas con las placas solamente DMSO para examinar desviaciones de estándar (SD) y los coeficientes de variación (CV) para la duración del período de crecimiento. Incluso con el desarrollo de este ensayo en lugar, ciertas líneas crecieron más rápidamente que otros, y habría sido beneficioso optimizar aún más las densidades de siembra y la duración de la experiencia de estas líneas más difíciles. Finalmente, los datos presentados aquí demuestran que hay una tendencia, en lugar de un fenómeno universal, de ciertas líneas celulares como NSCLC línea Calu-6 para ser excepcionalmente más sensibles a los compuestos contra la vía MAPK en 3D en comparación con aquellos en 2D. Experimentos adicionales están en marcha para determinar qué mecanismos biológicos podrían contribuir a regular esta notable diferencia en la sensibilidad.
La capacidad de esferoides de pantalla en un ambiente ultra-HTS permite cultivos 3D para ser utilizado desde el principio en el proceso de descubrimiento de fármacos y puede permitir la identificación de materia química novedosa que sólo está activa en un entorno 3D. Con tantos candidatos clínicos nunca lleguen al mercado debido a la falta de eficacia en los pacientes, aunque demostrando crecimiento inhibición in vitro y la regresión en vivo, equipos han empezado a cuestionar si ensayos de aplicación 3D podría brecha más temprano durante el proceso de descubrimiento. Existe un número de tipos de placa distintos para células en cultivo en 3D cuando se utilizan métodos bien 96 o 384 pocillos. Aquí, hemos presentado métodos de 1536-bien que producen los focos múltiples de los esferoides. En el futuro, estos resultados se podrían comparar con pantallas similares utilizando las nuevas tecnologías que se están desarrollando como placas 1536 pocillos que crecieran las células como gotas que cuelga, o placas que están cubiertos con hidrogel/Matrigel y que son de fondo redondo, que permitiría la formación de una esfera por pozo. Estas condiciones introducirían más capas de complejidad a las condiciones de cultivo utilizado para la detección, haciéndolos incluso más fisiológicamente relevantes y potencialmente podrían representar un aumento de la frecuencia de la traducción de banco a cabecera de novela terapias. Estas tecnologías también permitiría preguntas científicas que involucran gradientes de hipoxia o difusión, que requieren el uso de esferoides más grandes.
Los métodos presentan aquí enfocan estos esferoides contra una biblioteca de pequeñas moléculas de los compuestos de detección. En el futuro, estos métodos podrían ampliar a la pantalla de productos biológicos nuevos y biotherapeutics como anticuerpos específicos bi o conjugados anticuerpo-drogas, donde las culturas 3D pueden proporcionar interacciones antígeno-anticuerpo más fisiológicamente relevantes. Además, el uso de esferoides 3D puede ser crítico para el desarrollo de enfermedades relevantes ensayos de comprensión objetivos e intervenciones en la inmuno-Oncología emergente espacio21.
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Disclosures
Los autores son empleados de Novartis, y algunos empleados son también accionistas.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer Marc Ferrer en el centro nacional para el avance de Ciencias traslacionales, institutos nacionales de salud por su apoyo y orientación sobre el desarrollo inicial de estos ensayos. Además, nos gustaría agradecer a Alyson Freeman, Mariela Jaskelioff, Michael Acker, Jacob Haling y Vesselina Cooke por sus contribuciones científicas y discusión como miembros del equipo del proyecto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | ATCC | 30-2006 | Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors. |
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | Lonza | 12-604F | Purchased as a prepared solution. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Lonza | 12-115Q | Purchased as a prepared solution. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Hyclone | SH30042.01 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Purchased as a prepared solution. |
| 10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | Resuspend in sterile water. |
| 20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644 | Resuspend in sterile water. |
| 0.4% Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418 | Resuspend in sterile PBS and filter. |
| 1x Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Gibco | 51500056 | |
| 1% KnockOut (KO) Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | Add fresh right before use. |
| 100% Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7573 | Purchased as a prepared solution. |
| Consumables | |||
| Small Combi Cassette | ThermoFisher | 24073295 | |
| Small Multiflow Cassette | BioTek | 294085 | |
| 1536-well sterile TC plates (white) | Corning | 3727 | |
| 1536-well sterile TC plates (black) | Corning | 3893 | |
| Scivax Plates | MBL International | NCP-LH384-10 | |
| Equipment | |||
| Adhesives seals | ThermoFisher | AB0718 | |
| Spinning Incubator | LiCONiC | ||
| Stainless Steel Lids | The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF) | ||
| ATS Acoustic Dispensor | EDS Biosystems | ||
| Echo Acoustic Dispensor | Labcyte | ||
| Luminometer | Envision-Perkin Elmer | ||
| Peristaltic Pump- Multidrop Combi | ThermoFisher | ||
| Liquid Handler-Multiflow FX | BioTek |
References
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