Geração de esferoides Tumor tridimensional de alta produtividade para triagem de drogas

Resumo

Uma grande variedade de indicações de doença, modelos mais fisiologicamente relevantes estão sendo programas de descoberta de drogas desenvolvida e implementada em. O novo sistema de modelo aqui descrito demonstra como tridimensional tumor esferoides podem ser cultivadas e exibidos em um sistema de baseado em placa de 1536-bem elevado-throughput para pesquisar novas drogas de Oncologia.

Resumo

As células cancerosas rotineiramente têm sido cultivadas em duas dimensões (2D) em uma superfície de plástico. Esta técnica, no entanto, carece o verdadeiro ambiente um tumor massa é exposta ao vivo em. Tumores sólidos crescem não como uma folha anexada ao plástico, mas em vez disso como uma coleção de células clonais em um tridimensional (3D) espaço interagindo com seus vizinhos e com distintas Propriedades espaciais tais como o rompimento da polaridade celular normal. Essas interações causam células 3D-cultivadas para adquirir características morfológicas e celulares que são mais relevantes para tumores na vivo . Além disso, um tumor em massa está em contato direto com outros tipos de células, como células do estroma e imunes, bem como de todos os outros tipos de células, a matriz extracelular. A matriz depositada é composta de macromoléculas como o colágeno e fibronectina.

Na tentativa de aumentar a tradução dos resultados da investigação em oncologia do banco ao lado da cama, muitos grupos começaram a investigar o uso de sistemas de modelo 3D em suas estratégias de desenvolvimento de drogas. Estes sistemas são pensados para ser mais fisiologicamente relevantes porque eles tentam recapitular o ambiente heterogêneo e complexo de um tumor. Estes sistemas, no entanto, podem ser bastante complexos, e, embora passível de crescimento em formatos de 96 poços e alguns agora mesmo em 384, oferecem poucas opções para o crescimento em grande escala e triagem. Este observado lacuna levou ao desenvolvimento dos métodos aqui descritos pormenorizadamente esferoides de tumor de cultura em uma capacidade de alta produtividade em placas de 1536-bem. Esses métodos representam um compromisso aos sistemas baseados na matriz altamente complexos, que são difíceis de tela e ensaios 2D convencionais. Uma variedade de linhas de células de câncer abrigando diferentes mutações genéticas são rastreados com êxito, examinando a eficácia do composto usando uma biblioteca com curadoria de compostos visando o caminho Mitogen-Activated proteína quinase ou MAPK. As respostas de cultura esferoide são então comparadas com a resposta das células cultivadas em 2D, e diferenciais atividades são relatadas. Esses métodos fornecem um protocolo exclusivo para testes de atividade composta num ambiente 3D de alto rendimento.

Introdução

Na última década, cada vez mais estudos têm implementado o uso de modelos de cultura celular 3D para entender conceitos que não são totalmente instaurados pelo crescimento de células em 2D em plástico. Exemplos desses conceitos incluem as alternâncias na célula epitelial normal polaridade¹ onde a orientação espacial das camadas basais e apicais das células são perdidos, bem como o papel da matriz extracelular na regulação da sobrevivência e destino da célula. Pesquisa de Oncologia, em particular, tem usado modelos 3D para entender a biologia básica das células cancerosas e as diferenças entre 2D e 3D celular cultura sistemas^3<....

Protocolo

1. cultivo de esferoides Tumor 1536-bem 3D

1. Preparar um tronco médio tumor 3D fresco esferoide (substituição de soro de nocaute, meio celular + selênio-insulina-transferrina), adicionando os seguintes reagentes para 500 mL de meio de águias de modificado de Dulbecco (DMEM/F12): 1 x penicilina/estreptomicina, 10 ng/mL de humanos básico fator de crescimento fibroblástico (bFGF), 20 ng/mL de humano fator de crescimento epidérmico (EGF), 0,4% albumina de soro bovino (BSA) (fração V), 1 x insulina-transferrina-selênio e substituição de soro 1% nocaute (KO) (não congelamento-descongelamento).
2. Filtro-esterilize o meio inteiro com os suplementos através de ....

Resultados

Uma variedade de células de câncer estabelecido linhas conhecidas para crescer bem em condições de cultura 2D foram testadas usando os métodos descritos aqui. Linhas de células de imagens representativas de uma variedade de câncer mutante MAPK (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS e KNS-62:HRAS) são vistos na Figura 1. Essas imagens demonstram que, embora as linhas de celular têm diversas morfologias, cada um formado estruturas 3D nas placas de ensaio .......

Discussão

Os métodos apresentados aqui demonstram um protocolo detalhado sobre como produzir esferoides de tumor em placas de 1536-bem para as sessões de composto em grande escala. Esses métodos foram inicialmente adaptados do trabalho no Instituto Nacional de câncer onde esferoides de tumor foram cultivadas em ensaios de baixa produtividade em placas 6-poços e 96 poços para fazer perguntas sobre genéticas dependências e sensibilidade composto^{13, 14 ,}

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes
DMEM Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)/F12	ATCC	30-2006	Adquirido como uma solução preparada. Esta receita foi considerada preferida em comparação com outros fornecedores.
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12	Lonza	12-604F	Adquirido como uma solução preparada.
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)	Lonza	12-115Q	Comprado como uma solução preparada.
Soro fetal bovino (FBS)	Seradigm	1500-500	Adquirido como uma solução preparada.
1x 0,25% de tripsina com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)	Hyclone	SH30042.01	Comprado como uma solução preparada.
1x Penicilina/Estreptomicina	Gibco	15140	Comprado como uma solução preparada.
10 ng/mL Fator de crescimento de fibrobastos básicos humanos (bFGF)	Sigma	F0291	Ressuspender em água estéril.
20 ng/mL Fator de Crescimento Epidérmico Humano (EGF)	Sigma	E9644	Ressuspender em água estéril.
0,4% de albumina de soro bovino (BSA)	Sigma	A9418	ressuspende em PBS estéril e filtro.
1x Insulina Transferrina Selênio (ITS)	Gibco	51500056
1% KnockOut (KO) Substituição de Soro	Gibco	10828-028	Adicione fresco logo antes de usar.
100% Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma	276855-100ML
CellTiter-Glo	Promega	G7573	Comprado como uma solução preparada.
Consumíveis
Combi Pequeno	ThermoFisher	24073295
Multifluxo Pequeno	BioTek	294085
Placas TC estéreis de 1536 poços (branco)	Corning	3727
Placas TC estéreis de 1536 poços (preto)	Placas
Scivax	MBL International	NCP-LH384-10
Equipment
Adhesives vedações
	LiCONiC
Tampas de aço inoxidável	The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF)
ATS Acoustic Dispensor	EDS Dispensador Acústico Biosystems
Echo	Labcyte
Luminometer	Envision-Perkin Elmer
Bomba Peristáltica- Multidrop Combi	ThermoFisher
Liquid Handler-Multiflow FX	BioTek

Corning 3893 Incubadora giratória