Summary
Uma grande variedade de indicações de doença, modelos mais fisiologicamente relevantes estão sendo programas de descoberta de drogas desenvolvida e implementada em. O novo sistema de modelo aqui descrito demonstra como tridimensional tumor esferoides podem ser cultivadas e exibidos em um sistema de baseado em placa de 1536-bem elevado-throughput para pesquisar novas drogas de Oncologia.
Abstract
As células cancerosas rotineiramente têm sido cultivadas em duas dimensões (2D) em uma superfície de plástico. Esta técnica, no entanto, carece o verdadeiro ambiente um tumor massa é exposta ao vivo em. Tumores sólidos crescem não como uma folha anexada ao plástico, mas em vez disso como uma coleção de células clonais em um tridimensional (3D) espaço interagindo com seus vizinhos e com distintas Propriedades espaciais tais como o rompimento da polaridade celular normal. Essas interações causam células 3D-cultivadas para adquirir características morfológicas e celulares que são mais relevantes para tumores na vivo . Além disso, um tumor em massa está em contato direto com outros tipos de células, como células do estroma e imunes, bem como de todos os outros tipos de células, a matriz extracelular. A matriz depositada é composta de macromoléculas como o colágeno e fibronectina.
Na tentativa de aumentar a tradução dos resultados da investigação em oncologia do banco ao lado da cama, muitos grupos começaram a investigar o uso de sistemas de modelo 3D em suas estratégias de desenvolvimento de drogas. Estes sistemas são pensados para ser mais fisiologicamente relevantes porque eles tentam recapitular o ambiente heterogêneo e complexo de um tumor. Estes sistemas, no entanto, podem ser bastante complexos, e, embora passível de crescimento em formatos de 96 poços e alguns agora mesmo em 384, oferecem poucas opções para o crescimento em grande escala e triagem. Este observado lacuna levou ao desenvolvimento dos métodos aqui descritos pormenorizadamente esferoides de tumor de cultura em uma capacidade de alta produtividade em placas de 1536-bem. Esses métodos representam um compromisso aos sistemas baseados na matriz altamente complexos, que são difíceis de tela e ensaios 2D convencionais. Uma variedade de linhas de células de câncer abrigando diferentes mutações genéticas são rastreados com êxito, examinando a eficácia do composto usando uma biblioteca com curadoria de compostos visando o caminho Mitogen-Activated proteína quinase ou MAPK. As respostas de cultura esferoide são então comparadas com a resposta das células cultivadas em 2D, e diferenciais atividades são relatadas. Esses métodos fornecem um protocolo exclusivo para testes de atividade composta num ambiente 3D de alto rendimento.
Introduction
Na última década, cada vez mais estudos têm implementado o uso de modelos de cultura celular 3D para entender conceitos que não são totalmente instaurados pelo crescimento de células em 2D em plástico. Exemplos desses conceitos incluem as alternâncias na célula epitelial normal polaridade1 onde a orientação espacial das camadas basais e apicais das células são perdidos, bem como o papel da matriz extracelular na regulação da sobrevivência e destino da célula. Pesquisa de Oncologia, em particular, tem usado modelos 3D para entender a biologia básica das células cancerosas e as diferenças entre 2D e 3D celular cultura sistemas3,4. O desenvolvimento de técnicas mais sofisticadas de cultura celular e sua adaptação adicional para formatos múltiplos bem permitiu a busca de novas drogas nas configurações 3D. Em contraste com células cultivadas sob condições 2D, modelos 3D de variedade de tumores em complexidade de sistemas celulares em camadas5 single-célula do tipo esferas de tamanhos diferentes, para o complexo de multi-cell-tipo de esferas6,7, 8. a descoberta de novos compostos ou produtos biológicos que induzem a morte celular potente nestes sistemas modelo 3D é, portanto, de grande interesse nas campanhas de desenvolvimento de drogas. Pontos de extremidade destes ensaios muitas vezes são idênticos às realizadas em culturas 2D para avaliar alterações na proliferação celular, mas quando realizado em uma configuração mais fisiologicamente relevante, eles podem revelar o verdadeiro nível de dependência do gene alvo ou caminho sendo interrogado.
Como apresentado acima, uma variedade de sistemas modelo foram desenvolvidos para estudar respostas de drogas nos sistemas de cultura 3D, mas a maioria usa ou placas de microtitulação de 96 ou 384-bem e não é facilmente adaptável para os formatos de elevado-throughput screening (HTS) geralmente usados em campanhas de rastreio droga descoberta. Tais sistemas incluem o uso de tecnologias da gota, culturas de esferoide, células com partículas magnéticas para induzir a levitação, culturas e incorporando géis naturais ou sintéticas, como o colágeno, Matrigel ou polietileno glicol (PEG)2 a pulsar de suspensão . Aqui, apresentamos os métodos detalhados de uma técnica previamente desenvolvido para produzir culturas 3D esferoide de linhas de células de câncer estabelecido em um formato de placa 1536. Neste protocolo, um meio altamente definido é usado que impede a fixação de linhas de células normalmente aderentes9. Este sistema tem limitações (ou seja, é totalmente não pode recapitular um sistema complexo modelo de câncer), mas, no entanto, estes ensaios permitem uma seleção de alto rendimento de grandes coleções de pequenas moléculas e comparações transversalmente da resposta da droga entre 2D e 3D culturas contra uma variedade de linhas de células e compostos.
As linhas de células selecionado para demonstrar os métodos neste artigo todos harbor mutações em genes relacionados com a MAPK, sinalizando o caminho, um caminho que é altamente prejudicado em câncer, e para que muitos terapêutica estão disponíveis. Muitas das linhas tem ativação oncogênicas mutações no vírus Kirsten Rat Sarcoma também conhecido como KRAS, o RAS Neuroblastoma ou ARN, do oncogene do vírus Harvey Rat Sarcoma ou HRAS e os associado quinases Fibrosarcomas rapidamente acelerado, também conhecido como Bruno. Literatura recente sugere que os inibidores de diferentes nós deste percurso são excepcionalmente mais eficazes em um subconjunto das linhas celulares quando cultivadas sob condições 3D9,10. Um estudo descobriu que quando as células cancerosas com RAS ativo foram cultivadas em 3D, eles demonstraram uma sensibilidade aumentada aos inibidores de MAPK e ainda mais, que esta abordagem poderia identificar caminhos e alvo inibidores que podem ser perdidos em 2D tradicional configuração. O objetivo deste estudo é apresentar os métodos de cultura destas linhas de celular, e ainda mais, para demonstrar o diferencial de respostas para estes inibidores que podem ser observadas somente quando estiver usando 3D célula sistemas de cultura.
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Protocol
1. cultivo de esferoides Tumor 1536-bem 3D
- Preparar um tronco médio tumor 3D fresco esferoide (substituição de soro de nocaute, meio celular + selênio-insulina-transferrina), adicionando os seguintes reagentes para 500 mL de meio de águias de modificado de Dulbecco (DMEM/F12): 1 x penicilina/estreptomicina, 10 ng/mL de humanos básico fator de crescimento fibroblástico (bFGF), 20 ng/mL de humano fator de crescimento epidérmico (EGF), 0,4% albumina de soro bovino (BSA) (fração V), 1 x insulina-transferrina-selênio e substituição de soro 1% nocaute (KO) (não congelamento-descongelamento).
- Filtro-esterilize o meio inteiro com os suplementos através de um sistema de filtro de garrafa-topo 0,4 µm.
- Destacar as linhas de células de câncer, que tem vindo a crescer de acordo com as condições de cultura de rotina recomendado, dos frascos de cultura celular tradicional lavando-os 3 x com fosfato 1x tampão salino (PBS) e adicionando uma quantidade apropriada de tripsina 0,25% (1 mL por 5cm2) por 5 min criar uma camada fina sobre as células. Neutralizar a tripsina com 5 x a quantidade do meio contendo o soro e proceder a contagem das células. Por exemplo, use 25 mL de meio para 5 mL de tripsina.
- Ajuste a concentração da solução de célula a 62,5 x 104 células/mL para um total de 500 células por poço em 8 µ l de meio de esferoide de sementes para as placas de tecido-cultura-Tratado de 1536-bem.
- Em uma câmara de segurança biológica, propagar as células usando uma fita de aço inox-ponta esterilizada, pequena com um sistema de bomba peristáltica-base. Entre as linhas de célula diferente, irrigue o tubo da fita com 1X PBS e 70% etanol por 10 s.
- Alternativamente, as sementes as células usando um manipulador líquido localizado dentro de um quarto de HEPA-filtrado usando uma fita de aço inox-ponta esterilizada, pequena e uma bomba peristáltica ou uma bomba de seringa anexado, dependendo do número de placas por célula linha necessária.
- Sele as placas usando um selo de placa adesiva respirável ou manualmente ou usando um aferidor de placa.
- Coloque as placas em uma incubadora de fiação fixado em 10 rpm e 37 ° C com 5% de dióxido de carbono (CO2) e 95% de humidade relativa. Permitir que os esferoides ao formulário para 3-d.
2. cultivo de linhas 2D 1536-bem câncer
Nota: As linhas de câncer 2D 1536-bem devem ser cultivadas 24 h antes da adição do composto com as placas 3D.
- Preparar um meio de células de câncer 2D, adicionando os seguintes reagentes a 500 mL de um meio de cultura apropriado para as linhas selecionadas: 1 x penicilina/estreptomicina e 10% soro bovino fetal (FBS).
- Filtro-esterilize o meio inteiro com os suplementos através de um sistema de filtro de garrafa-topo 0,4 µm.
- Destacar as linhas de células de câncer, que tem vindo a crescer de acordo com as condições de cultura de rotina recomendado, dos frascos de cultura celular tradicional lavando-os 3 x com 1X PBS e adicionando uma quantidade apropriada de tripsina 0,25% (1 mL por 5 cm2) por 5 min para Crie uma camada fina sobre as células. Neutralizar a tripsina com 5 x a quantidade do meio contendo o soro e proceder a contagem das células. Por exemplo, use 25 mL de meio para 5 mL de tripsina.
- Ajuste a concentração da solução de célula a 62,5 x 104 células/mL para um total de 500 células por poço em 8 µ l de meio completo de sementes em placas de tecido-cultura-Tratado de 1536-boas.
- Em uma câmara de segurança biológica, propagar as células usando uma fita de aço inox-ponta esterilizada, pequena com um sistema de bomba peristáltica-base. Entre as linhas de célula diferente, irrigue o tubo da fita com 1X PBS estéril e de 70% etanol por 10 s.
- Alternativamente, propagar as células usando um manipulador líquido localizado dentro de uma sala de robótica HEPA-filtrado usando uma fita de aço inox-ponta esterilizada, pequena e uma bomba peristáltica ou a bomba de seringa anexado, dependendo do volume das placas por célula linha necessária.
- Sele as placas usando um selo de placa adesiva respirável ou manualmente ou usando um aferidor de placa.
- Coloque as placas em uma incubadora de fiação fixado em 10 rpm e 37 ° C por 24 h antes da adição de composto, com 5% CO2 e 95% de humidade relativa.
3. compostos de adição
- Prepare diluições de 8 pontos, 3 vezes seriais de inibidores MAPK em 100% dimetilsulfóxido (DMSO) em um robô de manipulação de líquido com uma concentração superior de 10 mM. O inibidor de proteossomo Bortezomib é usado como um controle positivo para uma célula completa matando para determinar a gama dinâmica do ensaio.
- Rápido-gire todo ensaio placas e placas compostas em 100 g de x para coletar qualquer condensação. Remova o selo de adesivo de cada prato e coloque uma placa em uma afinação acústica dispensador para adicionar um total de 8 nL de cada composto/diluição, representando uma concentração final de 0,1% DMSO por alvéolo e uma dose superior composta de 10 µM.
- Após a adição do composto é concluída, coloque uma tampa de cultura celular feito sob medida, de aço inoxidável que evita a evaporação sobre a chapa e coloque a placa em uma incubadora de fiação a 37 ° C para a 5D, com 5% CO2 e 95% de humidade relativa.
4. detecção adição de reagente e a aquisição de dados brutos
- Pré-aquecer um volume adequado de um reagente de lise celular contendo luciferina para detectar alterações em trifosfato (ATP), adenina e, assim, as alterações a proliferação celular em temperatura ambiente ou em banho maria a 37 ° C. Adicionar um total de 3 µ l de reagente a deteção a cada poço usando uma bomba peristáltica e incube a placa na temperatura ambiente pelo menos 15 min.
- Capture a luminescência luminómetro uma placa.
5. processamento de dados
- Extrair os dados brutos do instrumento e normalizar todos os campos que contêm compostos de teste para a média de todos os poços contendo DMSO sozinho como o controle de neutro. Partir deste valor, calcule a inibição do crescimento percentual de cada composto. Isso é concluído usando a função fórmula no Microsoft Excel onde f (x) = {(amostra de unidades de luz valor relativo (RLUs) / (média de valor de DMSO RLUs) * 100)}.
- Gere as curvas dose-resposta e IC50s inibitório representando graficamente os valores de dados normalizados da etapa 5.1 contra a concentração de compostos usando um programa gráfico.
Nota: Foram analisados os dados usando o Helios, uma ferramenta de software interna NIBR. Para completar esta função, selecionamos a ferramenta de análise de curva não paramétrico.
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Representative Results
Uma variedade de células de câncer estabelecido linhas conhecidas para crescer bem em condições de cultura 2D foram testadas usando os métodos descritos aqui. Linhas de células de imagens representativas de uma variedade de câncer mutante MAPK (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS e KNS-62:HRAS) são vistos na Figura 1. Essas imagens demonstram que, embora as linhas de celular têm diversas morfologias, cada um formado estruturas 3D nas placas de ensaio de 1536-bem. A Figura 2 demonstra que, quando usado para a seleção em grande escala, sensibilidade composta diferencial entre as culturas cultivadas em 2D contra aqueles em 3D pode ser observada. Cada ponto no gráfico representa concentração inibitória de um composto onde há uma matança de célula de 50% ou resposta de IC50 do composto em ambas as configurações. Para demonstrar que o efeito não é mediado exclusivamente pelos diferentes meios de comunicação, Calu-6 células foram cultivadas na mesma mídia usando placas de tecido-cultivadas 2D ou 3D placas de biofilme Scivax que impedem a penhora. O aumento da sensibilidade ou IC50 inferior para a condição de crescimento 3D é visto em suplementar Figura 1 para dois compostos na mesma mídia. Linhas como Calu-6 demonstram um aumento da sensibilidade para os compostos quando cultivada em condições 3D, enquanto as linhas como SK-MEL-30 são menos sensíveis em 3D em comparação com 2D. A tabela 1 inclui informações adicionais sobre todas as linhas de célula que foram usadas nesta tela.
Exemplos de curvas dose-resposta representativos são visualizados na Figura 3. Esta figura demonstra a eficácia diferencial de dois compostos, RAF265 (Figura 3A) e RAF709 (Figura 3B), que inibe a atividade da quinase RAF. Ambos os compostos são mais potentes em 3D condições na Calu-6, que é um câncer de pulmão não-pequenas células linha abrigando Q61K, uma mutação de ativação da proteína KRAS. Ao mesmo tempo, ambos os compostos são similarmente potentes no esferoides 3D e 2D culturas da linha de câncer de cólon de HCT116, que contém a mutação G13D-ativando em KRAS. Para demonstrar que o efeito do aumento da sensibilidade é mediado pela condição de crescimento de 3D e 2D e não simplesmente pelas condições diferentes mídias, Calu-6 células foram cultivadas usando FBS sob ambas as condições. Como visto em suplementar a Figura 1, quando as condições 2D e 3D usam FBS, a cultura 3D ainda demonstra uma sensibilidade aumentada para os compostos produzindo um IC50 inferior.
Finalmente, o ensaio 3D também permitiu uma observação do fenômeno de ativação de crescimento paradoxal, que é conhecido por ocorrer quando há uma inibição incompleta de dímeros de RAF em linhas de mutante RAS altamente ativadas e não na via independente de dímero ativação encontrada em BRAF V600E mutações11,12. Essa ativação é vista na Figura 4, após o tratamento com o inibidor BRAF Dabrafenib sob condições 3D em KNS-62, um pequeno HRAS-mutado linha de câncer de pulmão de células e também na célula pancreática mutante BRAF atípica linha BxPC-3. O crescimento é ativado em baixas concentrações da droga, e o crescimento só é reprimido em concentrações elevadas do fármaco (Figura 4B). Essa ativação surpreendentemente não foi vista na linha mutante KRAS Calu-6 e não deve ser esperado na linha mutante BRAF V600E A375. Temos observado uma ativação paradoxal de Calu-6 usando outros modelos de crescimento 3D (dados não mostrados).
Figura 1: imagens representativas das células cancerosas crescem em placas 3D de 1536-bem. As células foram chapeadas para um total de 3-d em placas de 1536-bem utilizando um dispensador de reagente e um pequeno estojo. Bright-campo imagens, adquiridas em um microscópio invertido usando uma lente X 4, demonstram as diversas morfologias 3D nas linhas de célula mutante de MAPK Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS e KNS-62:HRAS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: um gráfico de dispersão comparando a 2D - contra o 3D-composto eficácia através das linhas de celular. Esferoides, que anteriormente foram gerados para 3-d, então foram tratadas com compostos para um adicional de 5 d antes de que determinou-se a eficácia do composto. Cada círculo representa uma única resposta composta. Foram detectadas alterações pela proliferação de células usando um reagente de proliferação celular lítica, e IC50s foram calculadas utilizando uma análise de regressão logística quatro-parâmetro com o software interno chamado Helios. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: curvas de Dose-resposta comparando 2D versus 3D-composto eficácia. As curvas dose-resposta demonstram a eficácia de compostos em comparação com os controles de DMSO. As curvas do mutante KRAS Calu-6 e HCT116 células tratadas com dois inibidores da RAF, RAF265 e RAF709, são exibidas aqui como uma porcentagem da alteração do crescimento celular (% de inibição do crescimento) em comparação com o DMSO controlar poços. Uma população de células que foram cultivadas em condições 2D aparece em vermelho, e crescido como 3D esferoides são em azul. As linhas sólidas em torno dos dados indicam os intervalos de confiança de 95% para cada conjunto de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: certas culturas 3D capturar o fenômeno de ativação de crescimento paradoxal. As curvas dose-resposta demonstram a eficácia de compostos (% de inibição do crescimento) em comparação com os controles de DMSO. As curvas do mutante KRAS Calu-6, mutante BRAF V600E A375, mutante HRAS KNS-62 e as BRAF mutante BxPC-3 células atípicas tratadas com um ativador paradoxal Dabrafenib são exibidos aqui. Uma população de células que foram cultivadas em condições 2D aparece em vermelho, e crescido como 3D esferoides são em azul. As linhas sólidas em torno dos dados indicam os intervalos de confiança de 95% para cada conjunto de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar Figura 1: curvas Dose-resposta comparando a 2D - contra o 3D-composto eficácia em FBS contendo mídia. As curvas dose-resposta demonstram a eficácia de compostos em comparação com os controles de DMSO. As curvas das KRAS mutantes Calu-6 células tratadas com dois inibidores da RAF, RAF265 e RAF709, são exibidas aqui como uma porcentagem da alteração do crescimento celular (% de inibição do crescimento) em comparação com o DMSO controlar poços. Uma população de células que foram cultivadas em condições 2D aparece em vermelho, e crescido como 3D esferoides são em azul. Ambas as condições usam mídia contendo FBS. As barras de erro representam desvios-padrão de 2 conjuntos de dados individuais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome de linha celular | Linhagem | BRAF | RAS |
| A-375 | Melanoma | V600E | WT |
| BxPC-3 | No pâncreas | V487-P492 > A | WT |
| Calu6 | Câncer de pulmão não-pequenas células | WT | KRAS Q61K |
| HCT 116 | Colo-rectal | WT | KRAS G13C |
| IPC-298 | Melanoma | WT | Q61L ARN |
| KNS-62 | Carcinoma de células pulmonares | WT | HRAS Q61L |
| NIC-H1299 | Pulmão | WT | G12D ARN |
| PANC-1 | No pâncreas | WT | KRAS G12D |
| SKMEL-30 | Melanoma | WT | Q61K ARN |
Tabela 1: Informações de linha de celular.
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Discussion
Os métodos apresentados aqui demonstram um protocolo detalhado sobre como produzir esferoides de tumor em placas de 1536-bem para as sessões de composto em grande escala. Esses métodos foram inicialmente adaptados do trabalho no Instituto Nacional de câncer onde esferoides de tumor foram cultivadas em ensaios de baixa produtividade em placas 6-poços e 96 poços para fazer perguntas sobre genéticas dependências e sensibilidade composto13, 14 , 15. um recurso crítico e original do presente protocolo é que os esferoides são formados a partir de células cultivadas tecido 2D tradicionais em 1536-placas usando definido mídia conhecido como SCM + KO + ITS. Uma vez que as células são semeadas em, elas são lacradas com selos de placa adesiva respirável para prevenir qualquer evaporação ao longo da duração da formação d 3 esferoide. Esferoides podem também ser cultivadas por longos períodos de tempo usando esta abordagem16. Depois de 3-d de formação de esfera, compostos são adicionados para a 5D das mudanças no crescimento de células com um reagente de proliferação lítica baseada antes. Após a normalização para os poços de controle e cálculo de IC50s entre as células cultivadas em 2D vs. 3D, as alterações nas células tratadas composto são comparadas com as células de controle-Tratado.
Desde 1536-poço placas são placas de tecido-Tratado regulares e placas não hidrogel-revestido ou repelente de célula, uma limitação do presente protocolo é o uso do meio definido, que é um fator crítico para a execução bem-sucedida do presente protocolo. A substituição de soro KO foi testada inicialmente por sua capacidade ajudar com sucesso o crescimento de células-tronco embrionárias em 3D17 e neste protocolo foi adaptada para o crescimento de muitos tumor esferoide linhas13,15, 18 , 19. observar é que, apesar das condições de mídia são diferentes para o crescimento da 2D células contra o 3D esferoides, temos previamente demonstrado que os efeitos diferenciais da sensibilidade de droga são mediados pelo formato do crescimento e não simplesmente as diferenças na composição de mídia9.
Para garantir o sucesso do presente protocolo, como uma etapa de solução de problemas, sugere-se que uma série de experiências de desenvolvimento de ensaio primeiro são realizadas para otimizar cada linha celular antes de embarcar em uma tela em grande escala. Neste exemplo, todas as linhas de célula analisadas primeiro foram avaliadas para determinar se eles podem ser semeados na mesma densidade inicial de 500 células por poço. Eles então foram doseados com DMSO somente placas para examinar os desvios-padrão (SD) e coeficientes de variação (CV) para a duração do período de crescimento. Mesmo com este desenvolvimento de ensaio no lugar, certas linhas cresceram mais rapidamente do que outros, e teria sido benéfico para otimizar ainda mais as densidades de semeadura e a duração da experiência destas linhas mais desafiador. Finalmente, os dados aqui apresentados demonstram que há uma tendência, ao invés de um fenômeno universal, para determinadas linhas de celulares como o CPNPC linha Calu-6 para ser excepcionalmente mais sensíveis a compostos como alvo via MAPK em 3D em comparação com aqueles cultivados em 2D. Experimentos adicionais estão em andamento para determinar o que mecanismos biológicos podem estar contribuindo para regulamenta esta diferença marcante de sensibilidade.
A capacidade de esferoides de tela em um cenário ultra-HTS permite culturas 3D ser usado no início do processo de descoberta de drogas e pode permitir a identificação da matéria química novela que apenas está ativa em um ambiente 3D. Com tantos clínicos candidatos nunca chegando ao mercado devido à falta de eficácia em pacientes, embora demonstrando crescimento inibição em vitro e regressão na vivo, equipes começaram a questionar se implementar 3D ensaios poderia colmatar esta lacuna mais cedo durante o processo de descoberta. Um número de tipos diferentes de placa existe para células de cultura em 3D ao usar métodos de 96 poços ou 384-bem. Aqui, apresentamos métodos 1536-bem que produzem múltiplos focos de esferoides individuais. No futuro, esses achados poderiam ser comparados com telas semelhantes, usando novas tecnologias que estão em desenvolvimento, tais como placas de 1536-bem que poderiam crescer células como gotas de suspensão, ou que são revestidas com hidrogel/Matrigel e que são de fundo redondo, que permitiria a formação de uma esfera por bem. Estas condições introduziriam camadas adicionais de complexidade para as condições de cultura, usado para a seleção, tornando-os ainda mais fisiologicamente relevantes e potencialmente poderiam representar um aumento do ritmo de tradução da bancada para a cabeceira para o romance terapias. Estas tecnologias também permitiria questões científicas envolvendo gradientes de hipóxia ou difusão, que exigem o uso de maiores esferoides.
Os métodos aqui apresentaram enfocam esses esferoides contra uma biblioteca pequena molécula de compostos de triagem. No futuro, estes métodos poderiam expandir a tela para novos produtos biológicos e biotherapeutics tais como anticorpos bi-específicos ou conjugados de anticorpo-droga, onde culturas 3D podem proporcionar interações antígeno-anticorpo mais fisiologicamente relevantes. Além disso, o uso de esferoides 3D pode ser crítico para o desenvolvimento de doenças relevantes ensaios para alvos de compreensão e intervenções em espaço emergente imuno-Oncologia21.
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Disclosures
Os autores são empregados da Novartis, e alguns funcionários também são acionistas.
Acknowledgments
Os autores que gostaria de agradecer Marc Ferrer no centro nacional por avançando Ciências translacionais, institutos nacionais de saúde para seu apoio e orientação sobre o desenvolvimento inicial destes ensaios. Além disso, gostaríamos de agradecer a Alyson Freeman, Mariela Jaskelioff, Michael Acker, Jacob Haling e Vesselina Cooke para sua entrada científica e discussão como membros da equipe do projeto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | ATCC | 30-2006 | Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors. |
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | Lonza | 12-604F | Purchased as a prepared solution. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Lonza | 12-115Q | Purchased as a prepared solution. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Hyclone | SH30042.01 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Purchased as a prepared solution. |
| 10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | Resuspend in sterile water. |
| 20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644 | Resuspend in sterile water. |
| 0.4% Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418 | Resuspend in sterile PBS and filter. |
| 1x Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Gibco | 51500056 | |
| 1% KnockOut (KO) Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | Add fresh right before use. |
| 100% Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7573 | Purchased as a prepared solution. |
| Consumables | |||
| Small Combi Cassette | ThermoFisher | 24073295 | |
| Small Multiflow Cassette | BioTek | 294085 | |
| 1536-well sterile TC plates (white) | Corning | 3727 | |
| 1536-well sterile TC plates (black) | Corning | 3893 | |
| Scivax Plates | MBL International | NCP-LH384-10 | |
| Equipment | |||
| Adhesives seals | ThermoFisher | AB0718 | |
| Spinning Incubator | LiCONiC | ||
| Stainless Steel Lids | The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF) | ||
| ATS Acoustic Dispensor | EDS Biosystems | ||
| Echo Acoustic Dispensor | Labcyte | ||
| Luminometer | Envision-Perkin Elmer | ||
| Peristaltic Pump- Multidrop Combi | ThermoFisher | ||
| Liquid Handler-Multiflow FX | BioTek |
References
- Lee, M., Vasioukhin, V. Cell polarity and cancer--cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor. Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69, 42-51 (2014).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 332 (3), 821-828 (2010).
- Li, L., Lu, Y. Optimizing a 3D Culture System to Study the Interaction between Epithelial Breast Cancer and Its Surrounding Fibroblasts. Journal of Cancer. 2, 458-466 (2011).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. 3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies. Journal of Cell Communication and Signaling. 5 (3), 239-248 (2011).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
- Mathews Griner, L. A., et al. Large-scale pharmacological profiling of 3D tumor models of cancer cells. Cell Death & Disease. 7 (12), e2492 (2016).
- Polo, M. L., et al. Responsiveness to PI3K and MEK inhibitors in breast cancer. Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice. PLoS One. 5 (5), e10786 (2010).
- Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
- Bhargava, A., et al. Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Elife. 5, e09976 (2016).
- Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells. Molecular Cancer. 9, 267 (2010).
- Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer. Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).
- Mathews, L. A., et al. Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells. Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).
- Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
- Sun, L., et al. Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells. Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).
- Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
- Mathews Griner, L. A., et al. High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).
- Herter, S., et al. A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).
