Summary
Över en mängd olika tecken på sjukdom, mer fysiologiskt relevanta modeller är utvecklade och implementerade i drug discovery program. Ny modell systemet beskrivs här visar hur tredimensionella tumör spheroids kan vara odlade och screening i ett hög genomströmning 1536-well plate-baserat system att söka efter nya onkologi droger.
Abstract
Cancerceller har rutinmässigt varit odlade i två dimensioner (2D) på en plast yta. Denna teknik, saknar dock en sann miljö en tumör massa utsätts för i vivo. Solida tumörer växer inte som ett blad bifogas plast, men i stället som en samling klonal celler i en tredimensionell (3D) utrymme interagerar med sina grannar och med skilda rumsliga egenskaper såsom störningar av normal cellulär polaritet. Dessa interaktioner orsaka 3D-odlade celler förvärva morfologiska och cellulära egenskaper som är mer relevanta i vivo tumörer. Dessutom en tumör massa är i direkt kontakt med andra celltyper som stromaceller och immuna celler, samt den extracellular matrisen från alla andra celltyper. Matrisen deponeras består av makromolekyler som kollagen och Fibronektin.
I ett försök att öka översättning av forskningsresultat i onkologi från bänk till säng, har många grupper börjat undersöka användningen av 3D-modellsystem i deras strategier för utveckling av läkemedel. Dessa system är tänkt att vara mer fysiologiskt relevanta eftersom de försöker sammanfatta den komplex och heterogen miljön av en tumör. Dessa system, men kan vara ganska komplicerat, och även om det är mottagliga för tillväxt i 96 brunnar format och några nu även i 384, de erbjuder några alternativ för storskalig tillväxt och screening. Denna observerade gap har lett till utvecklingen av metoderna som beskrivs här i detalj till kultur tumör spheroids i en hög genomströmning kapacitet i 1536 brunnar. Dessa metoder utgör en kompromiss till mycket komplexa matrix-baserat system, som är svåra att skärmen och konventionella 2D-analyser. En mängd cancer cellinjer härbärgerat olika genetiska mutationer screenas framgångsrikt, undersöka sammansatta effekt genom att använda ett kuraterade bibliotek av föreningar inriktning Mitogen-Activated proteinkinas eller MAPK utbildningsavsnitt. Sfäroid kultur Svaren jämförs sedan med svaret från celler odlade i 2D, och differentiell aktiviteter redovisas. Dessa metoder ger en unik protokoll för testning sammansatta aktivitet i en hög genomströmning 3D miljö.
Introduction
Under det senaste årtiondet, har fler och fler studier implementerat 3D cell kultur modeller att förstå begrepp som inte är fullt återgetts av växande celler i 2D på plast. Exempel på dessa begrepp är växlingen i normala epitelceller polaritet1 där den rumsliga orienteringen av apikala och basala lager av celler är förlorade, samt rollen som den extracellular matrisen reglera överlevnad och cell öde. Onkologi forskning, i synnerhet, har använt 3D-modeller för att förstå grundläggande biologi cancerceller och skillnaderna mellan 2D och 3D cell kultur system3,4. Utvecklingen av mer sofistikerade cell kultur tekniker och deras ytterligare anpassning till flera format har aktiverat sökandet efter nya läkemedel i 3D-inställningar. I motsats till celler som odlas under 2D förhållanden, 3D-modeller av tumörer varierar i komplexitet från skiktad cellulära system5 till single-cell-typ sfärer av olika storlekar, till komplexa multi-cell-typ sfärer6,7, 8. upptäckten av nya föreningar eller biologiska läkemedel som kraftigt inducerar celldöd i dessa 3D modellsystem är därför av stort intresse i drogen utveckling kampanjer. Effektmått av dessa analyser är ofta identiska med dem som utförs i 2D kulturer att bedöma förändringar i cellproliferation, men när bedrivs i en mer fysiologiskt relevanta inställning, de kan avslöja den sanna nivån av beroende av målgenen eller väg som förhördes.
Som infördes ovan, olika modellsystem har utvecklats för att studera drog svaren i 3D kultur system, men flesta använder antingen 96 eller 384-väl mikrotiter plattor och är inte lätt att anpassa till de high-throughput screening (HTS) format används ofta i Drug discovery screening kampanjer. Sådana system inkluderar användning av hängande droppe teknik, sfäroid kulturer, pulserande celler med magnetiska partiklar att inducera levitation och kulturer innehåller naturliga eller syntetiska geler som kollagen, Matrigel eller polyetylenglykol (PEG)2 . Här presenterar vi de detaljerade metoderna för en tidigare utvecklade teknik för att producera 3D sfäroid kulturer från etablerad cancer cellinjer i 1536-well platta format. I detta protokoll används en mycket definierade medium som förhindrar fastsättning av normalt fastsittande cell linjer9. Detta system har begränsningar (dvsdet kan inte helt sammanfatta komplexa modellsystem av cancer), men dock dessa analyser aktivera en high-throughput screening av stora samlingar av små molekyler och på tvären jämförelser av narkotika svar mellan 2D och 3D kulturer mot en mängd olika cellinjer och föreningar.
Cellinjer valt för att demonstrera metoderna i denna artikel alla harbor mutationer i gener besläktade med den MAPK signalering väg, en väg som är mycket dysreglerad i cancer, och för vilka många therapeutics finns tillgängliga. Många av linjerna har aktiverande onkogena mutationer i Kirsten råtta sarkom viruset också kallad KRAS, neuroblastom RAS eller de nationella Regleringsmyndigheterna, i Harvey råtta sarkom virus onkogen eller HRAS och de associerade kinaser snabbt accelererade fibrosarkom, även känd som RAFs. Nyare litteratur tyder på att hämmare av olika noder i denna väg är unikt effektivare i en delmängd av cellinjer som när den odlas under 3D villkor9,10. En studie fann att när cancerceller med aktiv RAS odlades i 3D, de visade ökad känslighet för MAPK-hämmare, och vidare att detta tillvägagångssätt kunde identifiera vägar och riktade hämmare som kan missas i den traditionella 2D inställningen. Målet med denna studie är att presentera de metoder som används till kultur dessa cellinjer och ytterligare, för att påvisa differential cell Svaren till dessa hämmare som kan observeras endast när du använder 3D kultur system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. odling av 1536-väl 3D tumör Spheroids
- Förbereda en fräsch 3D tumör sfäroid medium stam (cell medium + knockout serum ersätter + insulin-transferrin-selen) genom att lägga till följande reagenser till 500 mL Dulbeccos modifierade Eagles Medium (DMEM/F12): 1 x penicillin/streptomycin, 10 ng/mL av mänskliga Basic fibroblast tillväxtfaktor (bFGF), 20 ng/mL av human epidermal growth factor (EGF), 0,4% bovint serumalbumin (BSA) (del V), 1 x insulin-transferrin-selen och 1% knockout (KO) serum ersätter (inte frysning-tining).
- Filter-sterilisera hela mediet med tillskott genom ett 0,4 µm flaska-top filtersystem.
- Lossa de cancer cellinjer, som har ökat enligt Rekommenderad rutin odlingsbetingelser, från de traditionella cellkultur kolvarna genom att tvätta dem 3 x med 1 x fosfat buffrad saltlösning (PBS) och lägga till en lämplig mängd 0,25% trypsin (1 mL per 5 cm2) under 5 minuter att skapa ett tunt lager över cellerna. Neutralisera trypsin med 5 x mängden mediet som innehåller serum och fortsätt att räkna cellerna. Exempelvis använda 25 mL medium för 5 mL av trypsin.
- Justera koncentration av cell lösningen på 62,5 x 104 celler/mL för att utsäde sammanlagt 500 celler per brunn i 8 µL sfäroid medium plattorna 1536-väl vävnad-kultur-behandlade.
- I biologiska säkerhetsdragskåp, utsäde cellerna med en steriliserad, små rostfritt-stål-tippas kassett med ett peristaltiska-pump-baserade system. Mellan olika cellinjer, spola slangen av kassetten med 1 x PBS och 70% etanol för 10 s.
- Alternativt, utsäde cellerna med en flytande hanterare som ligger inom ett HEPA-filtrerad rum med antingen en steriliserad, små rostfritt-stål-tippas kassett och en Peristaltisk pump eller en bifogad sprutpumpen, beroende på antalet plattor per cell fodrar behövs.
- Förslut plattorna med en ventilerande fästplatta tätning antingen manuellt eller använda en tallrik sealer.
- Lägg plattorna i en snurrande inkubator inställd på 10 rpm och 37 ° C med 5% koldioxid (CO2) och 95% relativ luftfuktighet. Tillåta spheroids formuläret för 3 d.
2. odling av 1536-väl 2D Cancer linjer
Obs: Raderna 1536-väl 2D cancer bör vara odlade 24 h före tillsats av föreningen till 3D plattorna.
- Förbereda ett 2D cancer cell medium genom att lägga till följande reagenser till 500 mL av en lämpligt odlingsmedium för valda rader: 1 x penicillin/streptomycin och 10% fetalt bovint serum (FBS).
- Filter-sterilisera hela mediet med tillskott genom ett 0,4 µm flaska-top filtersystem.
- Lossa de cancer cellinjer, som har ökat enligt Rekommenderad rutin odlingsbetingelser, från de traditionella cellkultur kolvarna genom att tvätta dem 3 x med 1 x PBS och lägga till en lämplig mängd 0,25% trypsin (1 mL per 5 cm2) för 5 min till skapa ett tunt lager över cellerna. Neutralisera trypsin med 5 x mängden mediet som innehåller serum och fortsätt att räkna cellerna. Exempelvis använda 25 mL medium för 5 mL av trypsin.
- Justera koncentration av cell lösningen på 62,5 x 104 celler/mL för att utsäde sammanlagt 500 celler per brunn i 8 µL av komplett medium i 1536-väl vävnad-kultur-behandlade plattor.
- I biologiska säkerhetsdragskåp, utsäde cellerna med en steriliserad, små rostfritt-stål-tippas kassett med ett peristaltiska-pump-baserade system. Mellan de olika cellinjer, spola slangen av kassetten med 1 x sterila PBS och 70% etanol för 10 s.
- Alternativt, utsäde cellerna med en flytande hanterare som ligger inom ett HEPA-filtrerad robotics rum med antingen en steriliserad, små rostfritt-stål-tippas kassett och en Peristaltisk pump eller bifogade sprutpumpen, beroende på plattorna per cell volym linje som behövs.
- Förslut plattorna med en ventilerande fästplatta tätning antingen manuellt eller använda en tallrik sealer.
- Lägg plattorna i en snurrande inkubator inställd på 10 rpm och 37 ° C under 24 h innan förening, med 5% CO2 och 95% relativ luftfuktighet.
3. sammansatta tillägg
- Förbereda 8-point, 3gånger seriella utspädningar av MAPK-hämmare i 100% dimetyl sulfoxid (DMSO) på en vätska-hantering robot med en 10 mM topp koncentration. Proteasomhämmare Bortezomib används som en positiv kontroll för en komplett cell döda för att avgöra det dynamiska omfånget av analysen.
- Quick-spin all assay plattor och sammansatta plåtar vid 100 x g att samla in någon kondens. Ta bort självhäftande förseglingen från varje platta och placera en tallrik på en akustisk dispenser set-up lägga till totalt 8 nL av varje förening/spädning som representerar en slutlig koncentration på 0,1% DMSO per brunn och en topp sammansatta dos av 10 µM.
- Efter tillsats av föreningen är klar, placera ett lock av skräddarsydda, rostfritt stål cell-kultur som förhindrar avdunstning på tallriken och placera plattan i en snurrande inkubator vid 37 ° C för 5 d, 5% CO2 och 95% relativ luftfuktighet.
4. identifiering av reagens tillägg och inköp av rådata
- Pre varm en tillräcklig volym ett cell lysis reagens som innehåller luciferin för att upptäcka förändringar i adenin adenosintrifosfat (ATP) och därmed förändringar i cell spridning i rumstemperatur eller i 37 ° C vattenbad. Lägga till totalt 3 µL av upptäckt reagens till varje brunn med hjälp av en Peristaltisk pump och inkubera plattan i rumstemperatur under minst 15 minuter.
- Fånga luminiscens på en tallrik luminometern.
5. databearbetning
- Extrahera rådata från instrumentet och normalisera alla fält som innehåller test föreningar med genomsnittet av alla brunnar innehållande DMSO ensam som neutral kontroll. Från detta värde, beräkna procentuell tillväxthämning av varje förening. Detta är klar med hjälp av formeln funktionen i Microsoft Excel där f (x) = {(prova värde relativa ljus enheter (RLUs) / (medelvärde DMSO RLUs) * 100)}.
- Generera dos-responskurvor och hämmande IC50s av grafritande värdena på de normaliserade datan från steg 5.1 mot sammansatta koncentrationen använder en grafritande program.
Obs: Vi analyserade data med hjälp av Helios, ett internt NIBR programvaruverktyg. För att slutföra denna funktion, valt vi verktyget icke-parametriska kurva.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En mängd etablerade cancercell linjer kända för att växa bra under 2D odlingsbetingelser testades med hjälp av metoder som beskrivs här. Representativa bilder från en mängd MAPK mutant cancer cellinjer (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS och KNS-62:HRAS) ses i figur 1. Dessa bilder visar att även om cellinjer har olika morfologier, bildade varje 3D-strukturer i 1536-väl assay tallrikar. Figur 2 visar att, när den används för storskalig screening, kan differentiell sammansatta känslighet mellan kulturer odlas i 2D jämfört med dem i 3D observeras. Varje punkt i diagrammet representerar en förenings hämmande koncentration där det finns en 50% cell dödande eller föreningens IC50 svar i båda inställningarna. För att demonstrera att effekten inte medieras enbart av de olika medierna, odlades Calu-6 celler i samma media använder antingen 2D vävnad-odlade plattor eller 3D Scivax biofilm plattor som förhindrar fastsättning. Den ökad känslighet eller lägre IC50 för villkoret 3D tillväxt ses i kompletterande Figur1 för två föreningar i samma media. Linjer som Calu-6 visar ökad känslighet för föreningarna som när den odlas på 3D villkor, medan linjerna som SK-MEL-30 är mindre känsliga i 3D jämfört med 2D. Tabell 1 inkluderar ytterligare bakgrundsinformation om alla cellinjer som användes i denna skärm.
Exempel på representativa dos-responskurvor visualiseras i figur 3. Denna siffra visar differentiella effekten av två föreningar, RAF265 (figur 3A) och RAF709 (figur 3B), som hämmar aktiviteten hos RAF kinaser. Båda föreningarna är mer potent i 3D villkor i Calu-6, som är en icke-småcellig lungcancer linje hysande Q61K, en aktiverande mutation i proteinet KRAS. Samtidigt är båda föreningarna likaså potent i 3D spheroids och 2D kulturer från HCT116 kolon cancer raden som innehåller den G13D-aktiverande mutationen i KRAS. För att visa att effekten av ökad känslighet medieras av tillväxt skick 3D jämfört med 2D, och inte bara som olika medier, Calu-6 celler odlades använder FBS båda villkor. Som sett i kompletterande Figur1, när både 2D och 3D villkor använder FBS, visar 3D kulturen fortfarande ökad känslighet för de föreningar som producerar en lägre IC50.
Slutligen, 3D analysen också tillåtet en observation av fenomenet med paradoxal tillväxt aktivering, som förekommer när det finns en ofullständig hämning av RAF dimerer i starkt aktiverade RAS mutant linjer och inte i dimer-oberoende väg aktivering i BRAF V600E mutationer11,12. Denna aktivering ses i figur 4, vid behandling med en BRAF-hämmare Dabrafenib 3D villkor KNS-62, en HRAS-muterade small cell lung cancer linje och också i cellen atypiska-BRAF muterade bukspottskörteln linje BxPC-3. Tillväxten aktiveras vid låga koncentrationer av läkemedlet, och tillväxten är bara förträngt vid höga koncentrationer av läkemedlet (figur 4B). Denna aktivering förvånansvärt inte sågs i KRAS mutant linje Calu-6 och inte kan förväntas i raden V600E BRAF muterade A375. Vi har observerat en paradoxal aktivering av Calu-6 med andra 3D tillväxtmodeller (inga data anges).
Figur 1: representativa bilder av cancerceller växer i 3D 1536 brunnar. Cellerna var klädd för sammanlagt 3 d i 1536 brunnar med hjälp av en reagens dispenser och en liten kassett. Bright-fältet bilder, förvärvat på ett inverterat Mikroskop med en 4 X-objektiv, demonstrera de olika 3D morfologier i de MAPK muterade cellinjer Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS och KNS-62:HRAS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: ett spridningsdiagram jämförde 2D - kontra den 3D-föreningen effekten över cellinjer. Spheroids, som genererades tidigare för 3 d, behandlades sedan med föreningar för en ytterligare 5 d innan förening effekten fastställdes. Varje cirkel representerar ett unikt sammansatta svar. Förändringar i cellproliferation som hittades med en lytisk cell spridning reagens och IC50s beräknades med en fyra-parametern logistisk regressionsanalys med den interna programvaran kallas Helios. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: dos-respons kurvor jämföra 2D - kontra 3D-förening effekt. Dos-respons kurvorna visar sammansatta effekten jämfört med DMSO kontrollerna. Kurvorna av KRAS mutant Calu-6 och HCT116-celler behandlas med två RAF-hämmare, RAF265 och RAF709, här visas som en procentsats i förändring i celltillväxt (% tillväxthämning) jämfört med DMSO kontrollbrunnar. En population av celler som odlades 2D villkor visas i rött, och de odlas som 3D spheroids är i blått. De heldragna linjerna runt data anger 95% konfidensintervallen för varje datamängd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: vissa 3D kulturer fånga företeelser som paradoxalt tillväxt aktiveringen. Dos-respons kurvorna visar sammansatta effekten (% tillväxthämning) jämfört med DMSO kontrollerna. Kurvorna i KRAS mutant Calu-6, BRAF V600E mutant A375, HRAS mutant KNS-62 och de atypiska BRAF muterade BxPC-3 celler behandlas med en paradoxal aktivator Dabrafenib visas här. En population av celler som odlades 2D villkor visas i rött, och de odlas som 3D spheroids är i blått. De heldragna linjerna runt data anger 95% konfidensintervallen för varje datamängd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Figur1: dos-responskurvor jämförde 2D - kontra den 3D-föreningen effekten i FBS som innehåller media. Dos-respons kurvorna visar sammansatta effekten jämfört med DMSO kontrollerna. Kurvorna i KRAS mutant Calu-6 celler behandlas med två RAF-hämmare, RAF265 och RAF709, här visas som en procentsats i förändring i celltillväxt (% tillväxthämning) jämfört med DMSO kontrollbrunnar. En population av celler som odlades 2D villkor visas i rött, och de odlas som 3D spheroids är i blått. Båda villkoren använda FBS-innehållande media. Felstaplar representera standardavvikelser från 2 enskilda datauppsättningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Cell linje namn | Härstamning | BRAF | RAS |
| A-375 | Melanom | V600E | WT |
| BxPC-3 | Bukspottskörteln | V487-P492 > A | WT |
| Calu6 | Icke-småcellig lungcancer | WT | KRAS Q61K |
| HCT 116 | Kolorektal | WT | KRAS G13C |
| IPC-298 | Melanom | WT | DE NATIONELLA REGLERINGSMYNDIGHETERNA Q61L |
| KNS-62 | Småcellig lungcancer | WT | HRAS Q61L |
| NCI-H1299 | Lungan | WT | DE NATIONELLA REGLERINGSMYNDIGHETERNA G12D |
| PANC-1 | Bukspottskörteln | WT | KRAS G12D |
| SKMEL-30 | Melanom | WT | DE NATIONELLA REGLERINGSMYNDIGHETERNA Q61K |
Tabell 1: Cell radinformationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder som presenteras här visar en detaljerad protokollet om hur man producerar tumör spheroids i 1536 brunnar för storskalig sammansatt filmvisningar. Dessa metoder var ursprungligen anpassad från arbete vid National Cancer Institute där tumören spheroids odlades i låg genomströmning analyser i 6-väl och 96 brunnar plattor att ställa frågor om genetiska beroenden och sammansatta känslighet13, 14 , 15. en kritisk och unik funktion i detta protokoll är att spheroids bildas från traditionella 2D vävnad-odlade celler i 1536-plattor med definierade media kallas SCM + KO + ITS. När cellerna är seedade i, är de förseglade med ventilerande fästplatta tätningar för att förhindra någon avdunstning över varaktigheten av 3 d sfäroid bildandet. Spheroids kan också vara odlade under längre tid med hjälp av denna metod16. Efter 3 d sphere bildas läggs föreningar för 5 d innan testmetoder förändringar i cellernas tillväxt med en lytisk-baserade spridning reagens. Efter normalisering till kontrollbrunnarna och beräkning av IC50s mellan celler odlade i 2D vs 3D, förändringar i förening-behandlade cellerna är jämfört med kontroll-behandlade cellerna.
Sedan 1536-brunnen plattorna är regelbundna vävnad-behandlade plattor och inte hydrogel-belagd eller cell-myggmedel plattor, en begränsning av detta protokoll är användningen av de definierade medium, som är en kritisk faktor framgångsrika genomförandet av detta protokoll. Att KO serum ersätta testades initialt för sin förmåga att framgångsrikt stöd i tillväxten av embryonala stamceller i 3D17 och i detta protokoll har anpassats för tillväxten av många tumör sfäroid linjerna13,15, 18 , 19. att notera är att även om media villkoren är olika för tillväxten av 2D celler kontra 3D spheroids, vi har tidigare visat att differential effekterna av drogen känslighet medieras av formatet tillväxt, och inte helt enkelt skillnaderna i media sammansättning9.
För att säkerställa framgången för detta protokoll, som en felsökningsåtgärd, föreslås det att en serie test utveckling experiment utförs först för att optimera varje cellinje innan man påbörjar en storskalig skärm. I det här exemplet var alla cell linjer analyseras först utvärderas för att avgöra om de kunde vara seedad på samma start täthet 500 celler per brunn. De analyserades sedan med DMSO-bara plattor att undersöka standardavvikelser (SD) och utjämningskoefficienter variansen (CVs) under hela tillväxtperioden. Även med denna assay utveckling på plats, vissa linjer växte snabbare än andra, och det hade varit fördelaktigt att ytterligare optimera den sådd täthet och varaktigheten av experiment av dessa mer utmanande linjer. Slutligen, de data som presenteras här visar att det finns en tendens, i stället för ett universellt fenomen, för vissa cellinjer som NSCLC linje Calu-6 för att vara unikt känsligare för föreningar inriktning det MAPK utbildningsavsnittet i 3D jämfört med de som odlas i 2D. Ytterligare experiment pågår för att avgöra vilka biologiska mekanismer kan bidra till att reglera denna slående skillnad i känslighet.
Förmågan att skärmen spheroids i en ultra-HTS-inställningen tillåter 3D kulturer ska användas tidigt i processen drug discovery och kan möjliggöra identifiering av nya kemiska materia som är endast aktiv i en 3D miljö. Med kunde så många kliniska kandidater aldrig når marknaden på grund av utebliven effekt hos patienter, om än visar tillväxt hämning in vitro och regression i vivo, lag har börjat ifrågasätta huruvida genomförandet av 3D-analyser överbrygga denna klyfta tidigare under identifieringsprocessen. Det finns ett antal olika plattan typer att odla celler i 3D när med 96 brunnar eller 384-bra metoder. Här har vi presenterat 1536-bra metoder som producerar flera foci av enskilda spheroids. I framtiden, kunde dessa fynd jämföras med liknande skärmar med hjälp av ny teknik som är under utveckling till exempel 1536 brunnar som kunde odla cellerna som hängande droppar eller plattor som är belagda med hydrogel/Matrigel och som är runda-botten, som skulle möjliggöra för bildandet av en sfär per brunn. Dessa villkor skulle införa ytterligare lager av komplexitet till de odlingsbetingelser som används för screening, vilket gör dem ännu mer fysiologiskt relevanta, och potentiellt kan utgöra en ökad frekvens av översättning från bänken till säng för roman terapier. Dessa tekniker skulle också göra det möjligt för vetenskapliga frågor som rör hypoxi eller diffusion lutningar, som kräver användning av större spheroids.
Metoderna som presenteras här fokus på screening dessa spheroids mot en liten molekyl bibliotek av föreningar. I framtiden kommer kunde dessa metoder expandera till skärm för romanen biologics och biotherapeutics såsom bi-specifika antikroppar eller antikropp-drogen konjugat, där 3D kulturer kan ge mer fysiologiskt relevanta antikropp-antigen interaktioner. Dessutom, kan användning av 3D spheroids vara avgörande för att utveckla sjukdom-relevanta analyser för förståelse mål och insatser i de framväxande immunonkologiska utrymme21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna är anställda av Novartis, och vissa medarbetare är också aktieägare.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna Marc Ferrer på National Center för framflyttning translationell vetenskaper, National Institutes of Health för hans stöd och vägledning på den inledande utvecklingen av dessa analyser. Dessutom vill vi tacka Alyson Freeman, Mariela Jaskelioff, Michael Acker, Jacob Haling och Vesselina Cooke för deras vetenskapliga input och diskussion som projektets teammedlemmar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | ATCC | 30-2006 | Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors. |
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | Lonza | 12-604F | Purchased as a prepared solution. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Lonza | 12-115Q | Purchased as a prepared solution. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Hyclone | SH30042.01 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Purchased as a prepared solution. |
| 10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | Resuspend in sterile water. |
| 20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644 | Resuspend in sterile water. |
| 0.4% Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418 | Resuspend in sterile PBS and filter. |
| 1x Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Gibco | 51500056 | |
| 1% KnockOut (KO) Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | Add fresh right before use. |
| 100% Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7573 | Purchased as a prepared solution. |
| Consumables | |||
| Small Combi Cassette | ThermoFisher | 24073295 | |
| Small Multiflow Cassette | BioTek | 294085 | |
| 1536-well sterile TC plates (white) | Corning | 3727 | |
| 1536-well sterile TC plates (black) | Corning | 3893 | |
| Scivax Plates | MBL International | NCP-LH384-10 | |
| Equipment | |||
| Adhesives seals | ThermoFisher | AB0718 | |
| Spinning Incubator | LiCONiC | ||
| Stainless Steel Lids | The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF) | ||
| ATS Acoustic Dispensor | EDS Biosystems | ||
| Echo Acoustic Dispensor | Labcyte | ||
| Luminometer | Envision-Perkin Elmer | ||
| Peristaltic Pump- Multidrop Combi | ThermoFisher | ||
| Liquid Handler-Multiflow FX | BioTek |
References
- Lee, M., Vasioukhin, V. Cell polarity and cancer--cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor. Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69, 42-51 (2014).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 332 (3), 821-828 (2010).
- Li, L., Lu, Y. Optimizing a 3D Culture System to Study the Interaction between Epithelial Breast Cancer and Its Surrounding Fibroblasts. Journal of Cancer. 2, 458-466 (2011).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. 3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies. Journal of Cell Communication and Signaling. 5 (3), 239-248 (2011).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
- Mathews Griner, L. A., et al. Large-scale pharmacological profiling of 3D tumor models of cancer cells. Cell Death & Disease. 7 (12), e2492 (2016).
- Polo, M. L., et al. Responsiveness to PI3K and MEK inhibitors in breast cancer. Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice. PLoS One. 5 (5), e10786 (2010).
- Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
- Bhargava, A., et al. Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Elife. 5, e09976 (2016).
- Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells. Molecular Cancer. 9, 267 (2010).
- Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer. Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).
- Mathews, L. A., et al. Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells. Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).
- Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
- Sun, L., et al. Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells. Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).
- Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
- Mathews Griner, L. A., et al. High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).
- Herter, S., et al. A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).
