Summary
रोग संकेत की एक विस्तृत विविधता के पार, और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल विकसित किया जा रहा है और दवा खोज कार्यक्रमों में लागू होता है । नए मॉडल प्रणाली यहां वर्णित कैसे तीन आयामी ट्यूमर spheroids और प्रसंस्कृत किया जा सकता है एक उच्च प्रवाह १५३६-अच्छी तरह से प्लेट में जांच के लिए नए कैंसर विज्ञान दवाओं के लिए खोज के आधार पर प्रदर्शित करता है ।
Abstract
कैंसर की कोशिकाओं को नियमित रूप से एक प्लास्टिक की सतह पर दो आयामों (2d) में संस्कृति है । इस तकनीक, तथापि, सच है पर्यावरण एक ट्यूमर द्रव्यमान का अभाव vivo मेंउजागर होता है । ठोस ट्यूमर एक प्लास्टिक से जुड़ी चादर के रूप में नहीं हो जाना है, लेकिन बजाय एक तीन आयामी (3 डी) अंतरिक्ष में क्लोनिंग कोशिकाओं का एक संग्रह के रूप में अपने पड़ोसियों के साथ बातचीत, और ऐसे सामांय सेलुलर ध्रुवीकरण के विघटन के रूप में विशिष्ट विशेष गुण के साथ । इन बातचीत के कारण 3 डी-कल्चरल कोशिकाओं रूपात्मक और सेलुलर विशेषताओं जो अधिक vivo ट्यूमर में करने के लिए प्रासंगिक है प्राप्त करने के लिए । इसके अतिरिक्त, एक ट्यूमर बड़े पैमाने पर अन्य कोशिका प्रकार जैसे stromal और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ सीधे संपर्क में है, साथ ही अन्य सभी प्रकार के सेल से extracellular मैट्रिक्स. मैट्रिक्स जमा अणुओं जैसे कोलेजन और fibronectin के रूप में शामिल है ।
चेन्नाई से बेडसाइड तक ऑन्कोलॉजी में शोध निष्कर्षों का अनुवाद बढ़ाने के प्रयास में कई समूहों ने अपनी औषध विकास रणनीतियों में 3डी मॉडल सिस्टम के इस्तेमाल की जाँच शुरू कर दी है. इन पद्धतियों को अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक माना जाता है क्योंकि वे एक ट्यूमर के जटिल और विषम वातावरण को दोहराऊंगा करने का प्रयास करते हैं. इन प्रणालियों, तथापि, काफी जटिल हो सकता है, और, हालांकि ९६ में विकास के लिए उत्तरदायी-अच्छी तरह से प्रारूपों, और कुछ अब भी ३८४ में, वे बड़े पैमाने पर विकास और स्क्रीनिंग के लिए कुछ विकल्प प्रदान करते हैं. यह स्वीकार्य अंतर १५३६ में एक उच्च प्रवाह क्षमता में संस्कृति ट्यूमर spheroids को विस्तार से यहां वर्णित तरीकों के विकास के लिए नेतृत्व किया है अच्छी तरह से प्लेटें । इन तरीकों अत्यधिक जटिल मैट्रिक्स के लिए एक समझौता-आधारित प्रणाली है, जो स्क्रीन के लिए मुश्किल है, और पारंपरिक 2 डी परख प्रतिनिधित्व करते हैं । विभिंन आनुवंशिक उत्परिवर्तनों बंदरगाह कैंसर सेल लाइनों की एक किस्म को सफलतापूर्वक जांच कर रहे हैं, Mitogen-सक्रिय प्रोटीन कळेनासे या MAPK मार्ग लक्ष्यीकरण यौगिकों के एक उपचारात्मक पुस्तकालय का उपयोग करके यौगिक प्रभावकारिता का परीक्षण । अंडाकार आकृति संस्कृति प्रतिक्रियाओं फिर 2d में उगाया कोशिकाओं की प्रतिक्रिया की तुलना में कर रहे हैं, और विभेदक गतिविधियों की सूचना है । इन पद्धतियों एक उच्च-प्रवाह 3d सेटिंग में यौगिक गतिविधि का परीक्षण करने के लिए एक अनंय प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।
Introduction
पिछले एक दशक में, अधिक से अधिक अध्ययन 3 डी सेल संस्कृति मॉडल के उपयोग के लिए अवधारणाओं कि प्लास्टिक पर 2d में कोशिकाओं को बढ़ने से पूरी तरह से recapitulated नहीं कर रहे है समझने के लिए लागू किया है । इन अवधारणाओं के उदाहरण सामांय उपकला कोशिका ध्रुवीयता1 में बारी है जहां शिखर और कोशिकाओं के बेसल परतों के स्थानिक अभिविन्यास खो रहे हैं, साथ ही अस्तित्व और कोशिका भाग्य को विनियमित करने में extracellular मैट्रिक्स की भूमिका शामिल हैं । ऑन्कोलॉजी अनुसंधान, विशेष रूप से, 3d मॉडल का इस्तेमाल किया है कैंसर कोशिकाओं के बुनियादी जीवविज्ञान और 2d और 3 डी सेल कल्चर सिस्टम3,4के बीच मतभेद को समझने के लिए । अधिक परिष्कृत सेल संस्कृति तकनीक और बहु-अच्छी तरह से प्रारूपों के लिए उनके आगे अनुकूलन के विकास 3 डी सेटिंग्स में नई दवाओं के लिए खोज सक्षम है । 2 डी शर्तों के तहत हो कोशिकाओं के विपरीत, ट्यूमर के 3d मॉडल स्तरित सेलुलर सिस्टम से जटिलता में रेंज5 एकल सेल प्रकार के क्षेत्रों के लिए विभिंन आकारों, जटिल बहु सेल प्रकार6,7 क्षेत्रों के लिए, 8. उपंयास यौगिकों या तर्क है कि शक्तिशाली इन 3 डी मॉडल सिस्टम में सेल मौत प्रेरित की खोज है, इसलिए, दवा विकास अभियानों में उच्च ब्याज की । इन परख के अंतिमबिंदु अक्सर 2d संस्कृतियों में प्रदर्शन करने के लिए सेल प्रसार में परिवर्तन का आकलन उन लोगों के समान हैं, लेकिन जब एक और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक सेटिंग में आयोजित, वे लक्ष्य जीन या मार्ग की निर्भरता का सही स्तर पर प्रकट हो सकता है पूछताछ.
के रूप में ऊपर शुरू की, मॉडल प्रणालियों की एक किस्म 3 डी संस्कृति प्रणालियों में दवा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है, लेकिन बहुमत या तो ९६ या ३८४-अच्छी तरह से microtiter प्लेट का उपयोग करें और उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग (HTS) प्रारूपों अक्सर उपयोग करने के लिए आसानी से अनुकूलनीय नहीं कर रहे है ड्रग डिस्कवरी जांच अभियान । इस तरह के सिस्टम छोटी बूंद प्रौद्योगिकियों, अंडाकार आकृति संस्कृतियों, चुंबकीय कणों के साथ pulsating कोशिकाओं उत्तोलन प्रेरित करने के लिए, और ऐसी कोलेजन, Matrigel, या पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) के रूप में प्राकृतिक या सिंथेटिक जैल शामिल संस्कृतियों के उपयोग में शामिल2 . यहां, हम एक पहले से विकसित तकनीक के विस्तृत तरीकों के लिए एक १५३६-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में स्थापित कैंसर सेल लाइनों से 3 डी अंडाकार आकृति संस्कृतियों का उत्पादन प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल में, एक उच्च परिभाषित माध्यम का उपयोग किया जाता है जो सामान्य रूप से अनुयाई कक्ष पंक्तियाँ9के अनुलग्नक को रोकता है । इस प्रणाली की सीमाएं है (यानी, यह पूरी तरह से कैंसर की एक जटिल मॉडल प्रणाली दोहराऊंगा नहीं कर सकते हैं), लेकिन फिर भी, इन परख एक उच्च छोटे अणुओं और दवा की प्रतिक्रिया के crosswise तुलना के बड़े संग्रह का प्रवाह जांच सक्षम सेल लाइनों और यौगिकों की एक किस्म के खिलाफ 2d और 3 डी संस्कृतियों के बीच ।
सेल लाइनों इस लेख में सभी बंदरगाह उत्परिवर्तनों MAPK संकेतन मार्ग से संबंधित जीन में, एक मार्ग है जो अत्यधिक कैंसर में dysregulated है, और जिसके लिए कई चिकित्सकीय उपलब्ध है के तरीकों को प्रदर्शित करने के लिए चुना है । लाइनों के कई कर्स्टन चूहे सार्कोमा वायरस में oncogenic उत्परिवर्तनों को सक्रिय किया है भी KRAS के रूप में जाना जाता है, Neuroblastoma रास या NRAS, हार्वे चूहे सार्कोमा वायरस oncogene या HRAS, और एसोसिएटेड kinases तेजी से त्वरित Fibrosarcomas, के रूप में भी जाना जाता RAFs । हाल के साहित्य पता चलता है कि इस मार्ग के विभिंन नोड्स के अवरोधकों जब 3 डी शर्तों9,10के तहत हो सेल लाइनों के एक सबसेट में विशिष्ट रूप से अधिक प्रभावोत्पादक हैं । एक अध्ययन में पाया गया कि जब सक्रिय रास के साथ कैंसर कोशिकाओं को 3 डी में संस्कृति थे, वे MAPK अवरोधकों के लिए एक वृद्धि की संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया, और आगे, कि इस दृष्टिकोण रास्ते और लक्षित अवरोधकों कि पारंपरिक 2d में याद किया जा सकता है की पहचान सकता है सेटिंग. इस अध्ययन के लक्ष्य के लिए इन सेल लाइनों संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया तरीकों को पेश करने के लिए है, और आगे, इन अवरोधकों जो केवल जब 3 डी सेल संस्कृति प्रणालियों का उपयोग कर मनाया जा सकता है के लिए विभेदक प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. १५३६ की संवर्धन-अच्छी तरह से 3 डी ट्यूमर Spheroids
- एक ताजा 3 डी ट्यूमर अंडाकार आकृति मध्यम स्टेम तैयार (सेल मध्यम + नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट + इंसुलिन-कैल्सीटोनिन-सेलेनियम) Dulbecco के संशोधित ईगल्स मध्यम (DMEM/F12) के ५०० मिलीलीटर के लिए निंनलिखित एजेंट जोड़कर: 1x पेनिसिलिन/streptomycin, मानव के 10 एनजी/ बेसिक fibroblast ग्रोथ फैक्टर (bFGF), ह्यूमन एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (EGF), ०.४% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) (अंश वी), 1x इंसुलिन-कैल्सीटोनिन-सेलेनियम, और 1% नॉकआउट (KO) सीरम रिप्लेसमेंट (फ्रीज-गल नहीं) के 20 एनजी/
- फ़िल्टर-एक ०.४ µm बोतल टॉप फिल्टर प्रणाली के माध्यम से पूरक आहार के साथ पूरे माध्यम से निष्फल ।
- अलग कैंसर सेल लाइनों, जो की सिफारिश की दिनचर्या संस्कृति की स्थिति के अनुसार बढ़ गया है, पारंपरिक सेल संस्कृति कुप्पी से उंहें और 3x से धो 1x फास्फेट के साथ है खारा (पंजाब) और ०.२५% trypsin की एक उपयुक्त राशि जोड़ने (1 एमएल प्रति 5 सेमी2) 5 मिनट के लिए कोशिकाओं पर एक पतली परत बनाने के लिए । 5x के साथ trypsin को बेअसर सीरम युक्त माध्यम की राशि और कोशिकाओं की गिनती करने के लिए आगे बढ़ना. उदाहरण के लिए, trypsin के 5 मिलीलीटर के लिए मध्यम से 25 मिलीलीटर का उपयोग करें ।
- ६२.५ x 104 कोशिकाओं/एमएल के लिए सेल समाधान की एकाग्रता को समायोजित करने के क्रम में अंडाकार आकृति माध्यम के 8 µ एल में प्रति अच्छी तरह से १५३६-ऊतक-संस्कृति-इलाज प्लेटों में कुल ५०० कोशिकाओं के बीज के लिए ।
- एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में, बीज एक निष्फल, छोटे स्टेनलेस स्टील-एक सिकुड़नेवाला-पंप आधारित प्रणाली के साथ कैसेट इत्तला दे दी कोशिकाओं का उपयोग कर । विभिंन सेल लाइनों के बीच, 1x पंजाबियों और 10 एस के लिए ७०% इथेनॉल के साथ कैसेट की टयूबिंग फ्लश
- वैकल्पिक रूप से, बीज की कोशिकाओं एक तरल एक HEPA-फ़िल्टर या तो एक निष्फल, छोटे स्टेनलेस स्टील-कैसेट और एक सिकुड़नेवाला पंप या एक संलग्न सिरिंज पंप का उपयोग कर कमरे के भीतर स्थित हेंडलर का उपयोग कर, सेल लाइन प्रति प्लेटों की संख्या पर निर्भर करता है ।
- एक सांस चिपकने वाला प्लेट मुहर या तो मैंयुअल रूप से या एक थाली मुहर का उपयोग का उपयोग प्लेटों सील ।
- 5% कार्बन डाइऑक्साइड (2CO) और ९५% सापेक्षिक आर्द्रता के साथ 10 rpm और ३७ ° c पर सेट कताई मशीन में प्लेट रखें । spheroids को 3 डी के लिए फार्म की अनुमति दें ।
2. १५३६ के संवर्धन-अच्छी तरह से 2d कैंसर लाइनों
नोट: १५३६-ठीक 2d कैंसर लाइनों 3 डी प्लेटों के लिए यौगिक के अलावा से पहले 24 ज कल्चरित किया जाना चाहिए ।
- एक 2d कैंसर सेल माध्यम तैयार चयनित लाइनों के लिए एक उचित विकास के माध्यम से ५०० मिलीलीटर के लिए निंनलिखित एजेंट जोड़कर: 1x पेनिसिलिन/streptomycin और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) ।
- फ़िल्टर-एक ०.४ µm बोतल टॉप फिल्टर प्रणाली के माध्यम से पूरक आहार के साथ पूरे माध्यम से निष्फल ।
- कैंसर सेल लाइनों, जो की सिफारिश की दिनचर्या संस्कृति की स्थिति के अनुसार बढ़ गया है अलग, पारंपरिक सेल से संस्कृति कुप्पी उंहें 1x पंजाबियों के साथ 3x धोने और ०.२५% trypsin (5 सेमी प्रति 1 मिलीलीटर की एक उचित राशि जोड़नेके लिए) 5 मिनट के लिए कक्षों के ऊपर एक पतली परत बनाएं । 5x के साथ trypsin को बेअसर सीरम युक्त माध्यम की राशि और कोशिकाओं की गिनती करने के लिए आगे बढ़ना. उदाहरण के लिए, trypsin के 5 मिलीलीटर के लिए मध्यम से 25 मिलीलीटर का उपयोग करें ।
- ६२.५ x 104 कोशिकाओं/एमएल के लिए सेल समाधान की एकाग्रता को समायोजित करने के क्रम में प्रति अच्छी तरह से 8 µ में कुल ५०० कोशिकाओं के बीज के लिए १५३६-अच्छी तरह से ऊतक-संस्कृति-इलाज प्लेटों में पूर्ण माध्यम के एल ।
- एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में, बीज एक निष्फल, छोटे स्टेनलेस स्टील-एक सिकुड़नेवाला-पंप आधारित प्रणाली के साथ कैसेट इत्तला दे दी कोशिकाओं का उपयोग कर । विभिंन सेल लाइनों के बीच, 1x बाँझ पंजाबियों और 10 एस के लिए ७०% इथेनॉल के साथ कैसेट की टयूबिंग फ्लश
- वैकल्पिक रूप से, बीज की कोशिकाओं के एक तरल एक के भीतर स्थित हेंडलर का उपयोग कर एक HEPA-फ़िल्टर्ड रोबोटिक्स कमरे का उपयोग कर या तो एक निष्फल, छोटे स्टेनलेस स्टील-इत्तला दे दी कैसेट और एक सिकुड़नेवाला पंप या संलग्न सिरिंज पंप, सेल प्रति प्लेट की मात्रा पर निर्भर करता है लाइन की जरूरत है ।
- एक सांस चिपकने वाला प्लेट मुहर या तो मैंयुअल रूप से या एक थाली मुहर का उपयोग का उपयोग प्लेटों सील ।
- एक कताई मशीन में 10 rpm और ३७ ° c पर सेट 24 एच के लिए पहले यौगिक अतिरिक्त के साथ, 5% CO2 और ९५% सापेक्ष आर्द्रता के साथ रखें ।
3. यौगिक अतिरिक्त
- 10 मिमी शीर्ष एकाग्रता के साथ एक तरल हैंडलिंग रोबोट पर १००% dimethyl sulfoxide (DMSO) में MAPK अवरोधकों के 8 सूत्री, 3-गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने की तैयारी करें । proteasome अवरोध करनेवाला Bortezomib एक पूरा सेल के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है परख के गतिशील रेंज निर्धारित हत्या ।
- त्वरित-सभी परख प्लेटें और १०० x g पर यौगिक प्लेटें किसी भी संघनित्र इकट्ठा करने के लिए स्पिन । प्रत्येक थाली से चिपकने वाला सील निकालें और एक ध्वनिक मशीन सेट-अप पर एक थाली जगह प्रत्येक यौगिक के 8 nL की कुल जोड़ने के लिए और अच्छी तरह से प्रति ०.१% DMSO की एक अंतिम एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक शीर्ष यौगिक खुराक 10 µ एम.
- यौगिक के अलावा पूरा हो गया है, एक कस्टम-निर्मित, स्टेनलेस स्टील सेल संस्कृति ढक्कन जो थाली पर वाष्पीकरण को रोकता है और 5 डी के लिए ३७ ° c में एक कताई मशीन में थाली जगह, 5% CO2 और ९५% सापेक्ष आर्द्रता के साथ ।
4. जांच एजेंट इसके अलावा और कच्चे डेटा के अधिग्रहण
- adenine ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) में परिवर्तन का पता लगाने के लिए luciferin युक्त एक सेल lysis रिएजेंट का एक पर्याप्त मात्रा पूर्व गर्म और, इस प्रकार, कक्ष के तापमान पर या एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में सेल प्रसार में परिवर्तन । प्रत्येक अच्छी तरह से एक सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग करने के लिए पता लगाने के एजेंट के 3 µ l की कुल जोड़ें और कमरे के तापमान पर थाली मशीन कम से 15 मिनट के लिए ।
- एक प्लेट luminometer पर luminescence पर कब्जा ।
5. डाटा प्रोसेसिंग
- साधन से कच्चे डेटा निकालने और सभी कुओं तटस्थ नियंत्रण के रूप में अकेले DMSO युक्त के औसत के लिए परीक्षण यौगिकों युक्त सभी क्षेत्रों को सामान्य. इस मान से, प्रत्येक यौगिक की प्रतिशत वृद्धि अवरोध की गणना. यह Microsoft Excel में सूत्र फ़ंक्शन का उपयोग कर पूरा हो जाता है जहाँ f (x) = {(नमूना मान संबंधित हल्की इकाइयाँ (RLUs)/(औसत DMSO मान RLUs) * 100)}.
- खुराक-प्रतिक्रिया घटता है और एक रेखांकन कार्यक्रम का उपयोग कर यौगिक एकाग्रता के खिलाफ ५.१ कदम से सामान्यीकृत डेटा के मूल्यों रेखांकन द्वारा निरोधात्मक IC50s उत्पन्न करते हैं.
नोट: हम Helios, एक आंतरिक NIBR सॉफ्टवेयर उपकरण का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण किया । इस समारोह को पूरा करने के लिए, हम nonparametric वक्र विश्लेषण उपकरण का चयन किया ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
स्थापित कैंसर सेल ज्ञात की एक किस्म 2 डी संस्कृति की स्थिति के तहत अच्छी तरह से विकसित करने के लिए यहां उल्लिखित विधियों का उपयोग परीक्षण किया गया । MAPK उत्परिवर्ती कैंसर सेल लाइनों की एक किस्म से प्रतिनिधि छवियां (कैलू-6: KRAS, NCI-H1299: NRAS, SK-मेल-30: NRAS, और KNS-62: HRAS) चित्रा 1में देखा जाता है । इन छवियों को प्रदर्शित करता है कि हालांकि सेल लाइनों विभिंन morphologies है, १५३६ में एक 3 डी संरचनाओं का गठन-अच्छी तरह से परख प्लेटें । चित्रा 2 दर्शाता है कि, जब बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया, 3 डी में उन बनाम 2d में उगाई संस्कृतियों के बीच अंतर यौगिक संवेदनशीलता मनाया जा सकता है । ग्राफ पर प्रत्येक डॉट एक है यौगिक निरोधात्मक एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है जहां एक ५०% सेल हत् या दोनों सेटिंग्स में है यौगिक IC50 प्रतिक्रिया है । प्रदर्शित करने के लिए कि प्रभाव अलग मीडिया द्वारा पूरी तरह से मध्यस्थता नहीं है, कैलू-6 कोशिकाओं को एक ही मीडिया में या तो 2d ऊतक-कल्चर्ड प्लेट्स या 3 डी Scivax के लिए जो लगाव को रोकने का उपयोग कर कल्चरित थे । बढ़ी हुई संवेदनशीलता या 3 डी वृद्धि की स्थिति के लिए कम IC50 एक ही मीडिया में दो यौगिकों के लिए पूरक चित्रा 1 में देखा जाता है । कैलू-6 की तरह लाइनें 3 डी की स्थिति के तहत हो जब यौगिकों के लिए एक वृद्धि की संवेदनशीलता का प्रदर्शन, जबकि SK-मेल-30 की तरह लाइनों 2d की तुलना में 3 डी में कम संवेदनशील हैं । तालिका 1 में इस स्क्रीन में उपयोग किए गए सभी कक्ष रेखाओं के बारे में अतिरिक्त पृष्ठभूमि जानकारी शामिल होती है ।
प्रतिनिधि खुराक-प्रतिक्रिया curves के उदाहरण चित्रा 3में कल्पना कर रहे हैं । यह आंकड़ा दो यौगिकों की अंतर प्रभावकारिता को दर्शाता है, RAF265 (चित्रा 3ए) और RAF709 (चित्र बी), जो आरएएफ kinases की गतिविधि को बाधित । दोनों यौगिकों कैलू-6 में 3 डी की स्थिति में और अधिक शक्तिशाली हैं, जो एक गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर लाइन Q61K बंदरगाह, प्रोटीन KRAS में एक सक्रिय उत्परिवर्तन है । एक ही समय में, दोनों यौगिकों इसी तरह HCT116 बृहदांत्र कैंसर लाइन है, जो KRAS में G13D सक्रिय उत्परिवर्तन शामिल से 3 डी spheroids और 2d संस्कृतियों में शक्तिशाली हैं । को प्रदर्शित करने के लिए कि वृद्धि की संवेदनशीलता का प्रभाव 3 डी बनाम 2d की वृद्धि की स्थिति और अलग मीडिया की स्थिति से नहीं बस द्वारा मध्यस्थता है, कैलू-6 कोशिकाओं दोनों शर्तों के तहत FBS का उपयोग कर उगाया गया । के रूप में पूरक चित्रा 1में देखा, जब दोनों 2d और 3 डी शर्तों FBS का उपयोग करें, 3d संस्कृति अभी भी एक कम IC50 उत्पादन यौगिकों के लिए एक वृद्धि की संवेदनशीलता को दर्शाता है ।
अंत में, 3 डी परख भी विरोधाभासी विकास सक्रियण, जो हो जब उच्च सक्रिय रास उत्परिवर्ती लाइनों में आरएएफ dimers के एक अपूर्ण निषेध है, और नहीं डिमर-स्वतंत्र मार्ग में जाना जाता है की घटना का अवलोकन की अनुमति दी सक्रियकरण BRAF V600E उत्परिवर्तनों में पाया11,12। इस सक्रियण चित्रा 4में देखा है, KNS में 3 डी शर्तों के तहत BRAF अवरोध करनेवाला Dabrafenib के साथ उपचार पर-६२, एक HRAS-छोटे कोशिका फेफड़ों के कैंसर की रेखा, और भी असामान्य में-BRAF उत्परिवर्ती अग्नाशय कोशिका लाइन BxPC-3. वृद्धि दवा की कम सांद्रता पर सक्रिय है, और वृद्धि केवल दवा (चित्रा 4B) के उच्च सांद्रता पर दमित है । । इस सक्रियण KRAS उत्परिवर्ती लाइन कैलू-6 में आश्चर्यजनक रूप से नहीं देखा गया था और V600E BRAF उत्परिवर्ती लाइन A375 में अपेक्षित नहीं है । हम कैलू के एक उलटा सक्रियण-6 अंय 3 डी विकास मॉडल का उपयोग कर देखा है (नहीं दिखाया डेटा) ।
चित्रा 1:3 डी १५३६ में बढ़ रही कैंसर कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों-अच्छी तरह से प्लेटें । कोशिकाओं को १५३६ में 3 डी की कुल के लिए चढ़ाया-अच्छी तरह से एक एजेंट मशीन और एक छोटे से कैसेट का उपयोग कर प्लेटें थे । उज्ज्वल क्षेत्र छवियों, एक औंधा माइक्रोस्कोप पर अधिग्रहीत एक 4x लेंस का उपयोग कर, MAPK उत्परिवर्ती सेल लाइनों में विभिंन 3d morphologies प्रदर्शन कैलू-6: KRAS, NCI-H1299: NRAS, SK-मेल-30: NRAS, और KNS-62: HRAS । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: एक तितर बितर साजिश 2d की तुलना में 3 डी-सेल लाइनों में यौगिक प्रभावकारिता बनाम । Spheroids, जो पहले 3 डी के लिए उत्पंन किया गया, तो यौगिक प्रभावकारिता निर्धारित किया गया था पहले एक अतिरिक्त 5 डी के लिए यौगिकों के साथ इलाज किया गया । प्रत्येक वृत्त एक अनंय यौगिक प्रतिसाद का प्रतिनिधित्व करता है । कक्ष प्रसार में परिवर्तन एक lytic सेल प्रसार reagent का उपयोग कर पाए गए थे, और IC50s Helios नामक आंतरिक सॉफ़्टवेयर के साथ एक चार-पैरामीटर उपस्कर प्रतिगमन विश्लेषण का उपयोग करते हुए परिकलित किए गए थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: खुराक प्रतिक्रिया घटता 2d- बनाम 3 डी-यौगिक प्रभावकारिता की तुलना. खुराक-प्रतिक्रिया घटता DMSO नियंत्रण की तुलना में यौगिक प्रभावकारिता प्रदर्शित करता है. KRAS उत्परिवर्ती कैलू के curves-6 और HCT116 कोशिकाओं दो आरएएफ अवरोधकों, RAF265 और RAF709 के साथ इलाज किया, यहां सेल विकास में परिवर्तन में एक प्रतिशत के रूप में प्रदर्शित कर रहे है (% वृद्धि निषेध) DMSO नियंत्रण कुओं की तुलना में । कोशिकाओं है कि 2 डी की स्थिति के तहत हो रहे थे की एक जनसंख्या लाल रंग में प्रकट होता है, और 3 डी spheroids के रूप में विकसित नीले रंग में हैं । डेटा के आस-पास ठोस पंक्तियाँ प्रत्येक डेटा सेट के लिए ९५% विश्वास अंतराल इंगित करती हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: कुछ 3 डी संस्कृतियों उलटा विकास सक्रियण की घटना पर कब्जा । खुराक-प्रतिक्रिया curves DMSO नियंत्रण की तुलना में यौगिक प्रभावकारिता (% विकास निषेध) प्रदर्शित करता है । KRAS उत्परिवर्ती कैलू के घटता-6, BRAF V600E उत्परिवर्ती A375, HRAS उत्परिवर्ती KNS-६२, और असामान्य BRAF उत्परिवर्ती BxPC-3 कोशिकाओं एक उलटा उत्प्रेरक Dabrafenib के साथ इलाज यहां प्रदर्शित कर रहे हैं । कोशिकाओं है कि 2 डी की स्थिति के तहत हो रहे थे की एक जनसंख्या लाल रंग में प्रकट होता है, और 3 डी spheroids के रूप में विकसित नीले रंग में हैं । डेटा के आस-पास ठोस पंक्तियाँ प्रत्येक डेटा सेट के लिए ९५% विश्वास अंतराल इंगित करती हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
पूरक चित्रा 1: खुराक-प्रतिक्रिया घटता 2d की तुलना- बनाम FBS में 3 डी यौगिक प्रभावकारिता मीडिया युक्त. खुराक-प्रतिक्रिया घटता DMSO नियंत्रण की तुलना में यौगिक प्रभावकारिता प्रदर्शित करता है. KRAS उत्परिवर्ती कैलू के curves-6 दो आरएएफ अवरोधकों, RAF265 और RAF709 के साथ इलाज कोशिकाओं, यहां सेल विकास में परिवर्तन में एक प्रतिशत के रूप में प्रदर्शित कर रहे है (% विकास निषेध) DMSO नियंत्रण कुओं की तुलना में । कोशिकाओं है कि 2 डी की स्थिति के तहत हो रहे थे की एक जनसंख्या लाल रंग में प्रकट होता है, और 3 डी spheroids के रूप में विकसित नीले रंग में हैं । दोनों स्थितियों FBS-युक्त मीडिया का उपयोग करें । त्रुटि पट्टियां 2 व्यक्तिगत डेटा सेट से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| कक्ष पंक्ति का नाम | वंश | BRAF | Ras |
| A-३७५ | मेलेनोमा | V600E | Wt |
| BxPC-3 | अग्नाशय | V487-P492 > एक | Wt |
| Calu6 | गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर | Wt | KRAS Q61K |
| HCT ११६ | कोलोरेक्टल | Wt | KRAS G13C |
| आईपीसी-२९८ | मेलेनोमा | Wt | NRAS Q61L |
| KNS-६२ | स्क्वैमस लंग | Wt | HRAS Q61L |
| NCI-H1299 | फेफड़ों | Wt | NRAS G12D |
| PANC-1 | अग्नाशय | Wt | KRAS G12D |
| SKMEL-30 | मेलेनोमा | Wt | NRAS Q61K |
तालिका 1: कक्ष पंक्ति जानकारी ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहां प्रस्तुत तरीकों को कैसे १५३६ में ट्यूमर spheroids उत्पादन के लिए अच्छी तरह से बड़े पैमाने पर यौगिक प्रदर्शन के लिए प्लेटों पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है । इन तरीकों से शुरू में काम से अनुकूलित किया गया राष्ट्रीय कैंसर संस्थान जहां ट्यूमर spheroids में कम प्रवाह की परख में बड़े थे 6-अच्छी तरह से और ९६-अच्छी तरह से प्लेटें आनुवंशिक निर्भरता और यौगिक13संवेदनशीलता के बारे में सवाल पूछने के लिए, 14 , 15. इस प्रोटोकॉल की एक महत्वपूर्ण और अनूठी विशेषता यह है कि spheroids पारंपरिक 2d ऊतक-१५३६ में प्रसंस्कृत कोशिकाओं से गठित कर रहे है-प्लेटें परिभाषित मीडिया का उपयोग कर SCM + KO के रूप में संदर्भित + इसके । एक बार कोशिकाओं में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, वे सांस चिपकने वाला प्लेट जवानों के साथ सील कर रहे हैं 3 डी अंडाकार आकृति गठन की अवधि में किसी भी वाष्पीकरण को रोकने के लिए. Spheroids भी समय की लंबी अवधि के लिए इस दृष्टिकोण16का उपयोग करने के लिए किया जा सकता है । क्षेत्र के गठन के 3 डी के बाद, यौगिकों 5 डी के लिए एक lytic आधारित प्रसार रिएजेंट के साथ कोशिका वृद्धि में परिवर्तन परख से पहले जोड़ रहे हैं । नियंत्रण कुओं और 2 डी बनाम 3d में प्रसंस्कृत कोशिकाओं के बीच IC50s की गणना करने के लिए सामान्यीकरण के बाद, यौगिक इलाज कोशिकाओं में परिवर्तन नियंत्रण इलाज कोशिकाओं की तुलना में कर रहे हैं.
१५३६ के बाद से अच्छी तरह से प्लेटें नियमित रूप से ऊतक-प्लेटों का इलाज किया और नहीं hydrogel लेपित या कोशिका से बचाने वाली क्रीम प्लेटें हैं, इस प्रोटोकॉल की एक सीमा निर्धारित माध्यम है, जो इस प्रोटोकॉल के सफल निष्पादन के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है का उपयोग है । के लिए सीरम प्रतिस्थापन शुरू में सफलतापूर्वक 3 डी17 में भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के विकास में सहायता करने की क्षमता के लिए परीक्षण किया गया था और इस प्रोटोकॉल में कई ट्यूमर अंडाकार आकृति लाइनों के विकास के लिए अनुकूलित किया गया है13,15, 18 , 19. नोट करने के लिए है कि, हालांकि मीडिया की स्थिति 3 डी spheroids बनाम 2d कोशिकाओं के विकास के लिए अलग हैं, हम पहले से दिखा दिया है कि दवा संवेदनशीलता के अंतर प्रभाव वृद्धि स्वरूप द्वारा मध्यस्थता कर रहे हैं, और नहीं बस मीडिया संरचना9में मतभेद ।
इस प्रोटोकॉल की सफलता सुनिश्चित करने के लिए, एक समस्या निवारण कदम के रूप में, यह सुझाव दिया है कि परख विकास प्रयोगों की एक श्रृंखला पहले बाहर किया जाता है एक बड़े पैमाने पर स्क्रीन पर तैयार करने से पहले प्रत्येक कोशिका लाइन का अनुकूलन । इस उदाहरण में, सेल लाइनों के सभी परख पहले अगर वे अच्छी तरह से प्रति ५०० कोशिकाओं की एक ही प्रारंभिक घनत्व पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है निर्धारित करने के लिए मूल्यांकन कर रहे थे । वे तो DMSO केवल प्लेटों के साथ परख रहे थे मानक विचलन (एसडी) और वृद्धि की अवधि की अवधि के लिए विचरण के गुणांक (सीवी) की जांच करने के लिए । यहां तक कि जगह में इस परख विकास के साथ, कुछ लाइनों दूसरों की तुलना में तेजी से बढ़ी है, और यह गया है आगे बोने घनत्व और इन अधिक चुनौतीपूर्ण लाइनों के प्रयोग की अवधि को अनुकूलित करने के लिए फायदेमंद होगा । अंत में, यहां प्रस्तुत आंकड़ों का प्रदर्शन है कि वहां एक प्रवृत्ति है, बल्कि एक सार्वभौमिक घटना से, NSCLC रेखा कैलू-6 की तरह कुछ सेल लाइनों के लिए विशिष्ट रूप से अधिक 2d में हो उन की तुलना में 3 डी में MAPK मार्ग लक्ष्यीकरण यौगिकों के प्रति संवेदनशील हो । अतिरिक्त प्रयोगों के लिए निर्धारित क्या जैविक तंत्र संवेदनशीलता में इस हड़ताली अंतर को विनियमित करने के लिए योगदान हो सकता है चल रहे हैं ।
एक अल्ट्रा में spheroids स्क्रीन करने की क्षमता-HTS सेटिंग 3 डी संस्कृतियों दवा खोज प्रक्रिया में जल्दी पर इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देता है और एक 3 डी सेटिंग में ही सक्रिय है कि उपन्यास रासायनिक पदार्थ की पहचान को सक्षम कर सकते हैं. के साथ इतने सारे क्लिनिकल रोगियों में प्रभावकारिता की कमी के कारण बाजार तक पहुंचने कभी नहीं, हालांकि इन विट्रो में विकास निषेध का प्रदर्शन और vivo मेंहीनता, टीमों ने सवाल है कि 3 डी परख लागू कर सकता है शुरू कर दिया है डिस्कवरी प्रक्रिया के दौरान पहले इस गैप को पाटना । अलग प्लेट प्रकार के एक नंबर 3 डी में संस्कृति कोशिकाओं के लिए मौजूद है जब ९६ अच्छी तरह से या ३८४-अच्छी तरह से तरीकों का उपयोग कर । यहां, हम १५३६ प्रस्तुत किया है अच्छी तरह से तरीके जो व्यक्तिगत spheroids के कई घावों का उत्पादन । भविष्य में, इन निष्कर्षों समान स्क्रीन जो विकास के तहत कर रहे है जैसे १५३६-अच्छी तरह से प्लेटों जो हैंगिंग बूंदों के रूप में कोशिकाओं को विकसित कर सकते हैं, या प्लेट जो hydrogel/Matrigel के साथ लेपित है और कि गोल नीचे हैं, का उपयोग कर की तुलना में हो सकता है, जो एक अच्छी तरह से प्रति क्षेत्र के गठन के लिए अनुमति होगी । इन शर्तों संस्कृति स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया स्थितियों के लिए जटिलता के अतिरिक्त परतों को लागू करने, उंहें और भी अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक बनाने, और संभवतः पीठ से अनुवाद की एक वृद्धि की दर उपंयास के लिए बेडसाइड का प्रतिनिधित्व कर सकता है चिकित्सा. इन प्रौद्योगिकियों हाइपोक्सिया या प्रसार ढाल है, जो बड़े spheroids के उपयोग की आवश्यकता को शामिल वैज्ञानिक प्रश्नों को भी सक्षम होगा ।
यहां प्रस्तुत तरीकों को इन spheroids के यौगिकों के एक छोटे से अणु पुस्तकालय के खिलाफ स्क्रीनिंग पर ध्यान केंद्रित । भविष्य में, इन तरीकों को उपंयास के लिए एक विशिष्ट एंटीबॉडी या एंटीबॉडी दवा conjugates, जहां 3 डी संस्कृतियों और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक एंटीबॉडी-प्रतिजन बातचीत प्रदान कर सकते है के रूप में इस तरह के उपन्यास के लिए स्क्रीन का विस्तार कर सकते हैं । इसके अलावा, 3d spheroids का उपयोग उभरते इंयूनो-कैंसर विज्ञान अंतरिक्ष21में लक्ष्य और हस्तक्षेप को समझने के लिए रोग-प्रासंगिक परख विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखक नोवार्टिस के कर्मचारी हैं, और कुछ कर्मचारी भी stockholders हैं.
Acknowledgments
लेखक के लिए अनुवाद विज्ञान, उनके समर्थन और इन परख के प्रारंभिक विकास पर मार्गदर्शन के लिए स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों को आगे बढ़ाने के लिए राष्ट्रीय केंद्र में मार्क फेरर स्वीकार करना चाहते हैं । इसके अलावा, हम एलिसन फ्रीमैन, Mariela Jaskelioff, माइकल अकर, जैकब Haling, और Vesselina Cooke उनके वैज्ञानिक इनपुट और परियोजना टीम के सदस्यों के रूप में चर्चा के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | ATCC | 30-2006 | Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors. |
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | Lonza | 12-604F | Purchased as a prepared solution. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Lonza | 12-115Q | Purchased as a prepared solution. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Hyclone | SH30042.01 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Purchased as a prepared solution. |
| 10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | Resuspend in sterile water. |
| 20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644 | Resuspend in sterile water. |
| 0.4% Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418 | Resuspend in sterile PBS and filter. |
| 1x Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Gibco | 51500056 | |
| 1% KnockOut (KO) Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | Add fresh right before use. |
| 100% Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7573 | Purchased as a prepared solution. |
| Consumables | |||
| Small Combi Cassette | ThermoFisher | 24073295 | |
| Small Multiflow Cassette | BioTek | 294085 | |
| 1536-well sterile TC plates (white) | Corning | 3727 | |
| 1536-well sterile TC plates (black) | Corning | 3893 | |
| Scivax Plates | MBL International | NCP-LH384-10 | |
| Equipment | |||
| Adhesives seals | ThermoFisher | AB0718 | |
| Spinning Incubator | LiCONiC | ||
| Stainless Steel Lids | The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF) | ||
| ATS Acoustic Dispensor | EDS Biosystems | ||
| Echo Acoustic Dispensor | Labcyte | ||
| Luminometer | Envision-Perkin Elmer | ||
| Peristaltic Pump- Multidrop Combi | ThermoFisher | ||
| Liquid Handler-Multiflow FX | BioTek |
References
- Lee, M., Vasioukhin, V. Cell polarity and cancer--cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor. Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69, 42-51 (2014).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 332 (3), 821-828 (2010).
- Li, L., Lu, Y. Optimizing a 3D Culture System to Study the Interaction between Epithelial Breast Cancer and Its Surrounding Fibroblasts. Journal of Cancer. 2, 458-466 (2011).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. 3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies. Journal of Cell Communication and Signaling. 5 (3), 239-248 (2011).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
- Mathews Griner, L. A., et al. Large-scale pharmacological profiling of 3D tumor models of cancer cells. Cell Death & Disease. 7 (12), e2492 (2016).
- Polo, M. L., et al. Responsiveness to PI3K and MEK inhibitors in breast cancer. Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice. PLoS One. 5 (5), e10786 (2010).
- Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
- Bhargava, A., et al. Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Elife. 5, e09976 (2016).
- Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells. Molecular Cancer. 9, 267 (2010).
- Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer. Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).
- Mathews, L. A., et al. Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells. Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).
- Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
- Sun, L., et al. Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells. Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).
- Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
- Mathews Griner, L. A., et al. High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).
- Herter, S., et al. A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).
