Summary
다양 한 질병의 표시 더 순수 관련 모델 개발 및 구현에 약물 발견 프로그램 되. 여기에 설명 된 새로운 모델 시스템 spheroids를 경작 하 고 종양학 신약에 대 한 검색 하는 높은 처리량 1536-잘 접시 기반 시스템에서 상영 될 수 방법을 3 차원 종양을 보여 줍니다.
Abstract
암 세포는 정기적으로 플라스틱 표면에 2 차원 (2D)에서 경작 되었습니다. 그러나이 기술은,, 부족 진정한 환경 종양 질량에 비보에 노출 됩니다. 단단한 종양 시트 플라스틱, 첨부로 성장 하지만 3 차원 (3d) 클론 셀의 컬렉션으로 대신 그들의 이웃, 그리고 정상적인 세포 극성의 파괴와 같은 독특한 공간 속성의 상호 작용 공간. 이러한 상호 작용 종양 vivo에서 더 관련 된 형태학 및 세포 특성을 얻으려고 3 차원 배양 세포를 발생할. 또한, 종양 질량은 다른 세포 유형 stromal 및 면역 세포 뿐만 아니라 다른 모든 세포 유형에 서 세포 외 매트릭스와 직접 접촉에. 입금 매트릭스 고분자 콜라겐과 fibronectin 같은 구성 되어 있습니다.
머리 맡에 벤치에서 종양학에서 연구 결과의 번역을 증가 하는 시도에 많은 그룹 그들의 약 개발 전략에서 3D 모델 시스템의 사용을 조사 하기 시작 했습니다. 이러한 시스템은 종양의 복잡 하 고 이기종 환경 정리 하려고 하기 때문에 더 많은 생리 적으로 관련 된 것으로 생각 된다. 그러나 이러한 시스템은,, 매우 복잡할 수, 그리고, 비록 의무가 96 잘 형식과 384에도 지금 일부에서 성장, 그들은 대규모 성장 및 심사에 대 한 몇 가지 옵션 제공. 이 관찰 간격 여기 문화 종양 spheroids 1536-잘 접시의 높은 처리량 용량에 세부 사항에서 설명 하는 방법의 개발을 주도하 고 있다. 이 메서드는 매우 복잡 한 매트릭스 기반 시스템, 화면, 그리고 기존의 2D 분석 하기 어려운 타협을 나타냅니다. 은닉 다른 유전자 돌연변이 암 세포 라인의 다양 한은 성공적으로 상영 Mitogen-Activated 단백질 키 니 아 제 또는 MAPK 통로 대상으로 하는 화합물의 큐레이터 라이브러리를 사용 하 여 복합 효능을 검사. 회전 타원 체 문화 응답 그런 다음 2d, 성장 하는 세포의 응답에 비교 하 고 차동 활동 보고 됩니다. 이 메서드는 복합 활동 높은 처리량 3D 설정에서 테스트를 위한 고유 프로토콜을 제공 합니다.
Introduction
지난 10 년간에서 점점 더 많은 연구는 성장 하는 세포 차원에서 플라스틱에 의해 완전히 지 하지 개념 이해 3D 셀 문화 모델의 사용을 구현 했습니다. 이러한 개념의 예 생존 및 세포 운명 조절에 세포 외 매트릭스의 역할 뿐 아니라 정상 상피 세포 극성1 셀의 꼭대기와 기저 계층의 공간적 방향이 손실에 교대를 포함 합니다. 종양학 연구, 특히, 암 세포와 2D 및 3D 셀 문화 시스템3,4간의 차이의 기본적인 생물학을 이해 하 3D 모델을 사용 했다. 더 정교한 셀 문화 기술과 멀티 잘 포맷을 더 그들의 적응의 개발은 3D 설정에서 새로운 약물에 대 한 검색을 활성화 하 고 있다. 셀과 달리 성장 조건 하에서 2D, 3D 모델 종양 범위 복잡 한 계층화 된 셀룰러 시스템5 에서 다양 한 크기의 단일 셀 유형 분야에서에서의 복잡 한 cell 타입 분야6,7, 8. 소설 화합물 또는 potently 이러한 3D 모델 시스템에 세포 죽음을 유도 하는 생물 의약품의 발견은, 따라서, 약물 개발 캠페인에 높은 관심의. 이 분석 실험의 끝점 종종 세포 증식에 변화를 평가 하기 위해 2D 문화에서 그와 동일 하지만 더 순수 관련 설정에서 실시 하는 때 그들은 대상 유전자 나 통로가 되는 종속성의 진정한 수준을 드러낼 수 있습니다. 심문.
대부분 중 96 또는 384-잘 결정 접시를 사용 하 고 높은 처리량 검열 (HTS) 형식에서 자주 사용 한다에 쉽게 적응 하지 않습니다 하지만 모델 시스템의 다양 한 3D 문화 시스템에 약물 응답 공부 하 개발 되어 위의 도입, 약물 발견 심사 캠페인입니다. 이러한 시스템 물방울 기술, 회전 타원 체 문화, 공중 부양, 그리고 자연 또는 합성 젤 콜라겐, Matrigel, 또는 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)2 등을 통합 하는 문화를 유도 하기 위해 마그네틱 입자와 셀 pulsating 매달려의 사용을 포함 . 여기, 우리는 1536-잘 접시 형태로 설립된 암 세포 선에서 3D 회전 타원 체 문화 생산 이전 개발 기술의 상세한 방법 제시. 이 프로토콜 높은 정의 매체 사용 일반적으로 부착 셀 라인9의 부착을 방지 합니다. 이 시스템에 제한 사항 (즉, 그것은 완전히 암의 복잡 한 모델 시스템 정리 수 없습니다), 하지만 그럼에도 불구 하 고,이 분석 실험 작은 분자의 대규모 컬렉션 및 약 응답의 십자로 비교의 높은 처리량 검열 다양 한 세포 및 화합물에 대 한 2D 및 3D 문화 사이
셀 라인 MAPK 신호 통로, 통로 높은 암, dysregulated에 관련 된 유전자의 모든 항구 돌연변이 들이 문서의 방법 보여 선택 하 고 있는 많은 치료제에 대 한 사용할 수 있습니다. 라인의 많은 키 얼 스 틴 쥐 육 종 바이러스 라고도 KRA, 신경 RAS 또는 NRAS, 하 비 쥐 육 종 바이러스 oncogene 또는 HRA, 및 관련된 kinases 빠르게 가속 Fibrosarcomas, 일컬어 종양 돌연변이 활성화 Raf는. 최근 문학이이 통로의 다른 노드의 억제제 셀 라인 3D 조건9,10에서 성장 될 때의 하위 집합에 고유 하 게 더 효능을 제안 합니다. 때 활성 RAS와 암 세포 차원에서 교양 있었다, 그들은 증가 감도 MAPK 억제제를 시연 하 고 또한,이 접근 경로 확인할 수 및 전통적인 2D에서 놓친 억제제를 대상으로 한 연구 발견 설정합니다. 이 연구의 목표는 이러한 셀 라인 문화 하는 데 사용 하는 방법을 제시 하 고 또한, 차등을 보여 주기 위해 3D를 사용 하는 경우에 관찰 될 수 있는 이러한 억제제에 대 한 응답 문화 시스템 세포.
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Protocol
1. 1536-좋은 3D 종양 Spheroids의 배양
- Dulbecco의 수정 이글스 매체 (DMEM/F12)의 500 mL를 다음과 같은 시 약을 추가 하 여 신선한 3D 종양 회전 타원 체 중간 줄기 (셀 매체 녹아웃 혈 청 교체 + 인슐린-처리가-셀레늄) 준비: 1 x 페니실린/스, 인간의 10 ng/mL 기본적인 섬유 아 세포 성장 요소 (bFGF), 인간 표 피 성장 인자 (EGF), 0.4% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) (분수 V), 인슐린-처리가-셀레늄, 및 1% 녹아웃 (KO) 혈 청 교체 (할 하지 동결-해 동) x 1의 20 ng/mL.
- 필터-소독 0.4 µ m 병 상단 필터 시스템을 통해 보충 교재를 가진 전체 매체.
- 그들을 세척 하 여 전통적인 세포 배양 플라스 크에서 권장된 일상적인 문화 조건에 따라 성장 암 세포 라인 분리 3 x 1 x 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 0.25 %trypsin (1 mL의 적절 한 금액을 추가 5 cm2) 당 5 분 셀 위에 얇은 레이어를 만듭니다. 혈 청을 포함 하는 매체의 금액 x 5 트립 신을 중화 하 고는 셀 이동 합니다. 예를 들어 5 ml의 트립 신 매체의 25 mL를 사용 합니다.
- 씨앗 잘 회전 타원 체 매체의 8 µ L 당 500 세포의 총 1536-잘 조직 문화 취급 판으로 위해 104 셀/mL x 62.5에 셀 용액의 농도 조정 합니다.
- 생물 안전 캐비닛, 연동 펌프-기반 시스템으로 소독, 작은 스테인레스 스틸 밀고 카세트를 사용 하 여 셀을 시드하십시오. 다른 셀 라인 사이 PBS와 70% x 1 카세트의 튜브를 플러시 에탄올 10 s.
- 또는, 종자 소독, 작은 스테인레스 스틸 밀고 카세트와 연동 펌프 또는 셀 줄 필요 번호판의 번호에 따라 연결 된 주사기 펌프를 사용 하 여 HEPA 필터 룸 내에 있는 액체 처리기를 사용 하 여 셀.
- 수동으로 사용 하 여 통기성 접착 판 도장 중 또는 접시 마감재를 사용 하 여 접시를 봉인.
- 10 rpm와 5% 이산화탄소 (CO2)와 95% 상대 습도 37 ° C에서 설정 회전 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 3 d 형태를 spheroids 수 있습니다.
2. 1536-잘 2D 암 라인의 경작
참고: 1536-잘 2D 암 라인 3D 판 화합물의 추가 하기 전에 24 시간 배양 한다.
- 선택한 라인에 대 한 적절 한 성장 매체의 500 mL를 다음과 같은 시 약을 추가 하 여 2D 암 세포 매체를 준비: 페니실린/스와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) x 1.
- 필터-소독 0.4 µ m 병 상단 필터 시스템을 통해 보충 교재를 가진 전체 매체.
- 분리 그들을 세척 하 여 전통적인 세포 배양 플라스 크에서 권장된 일상적인 문화 조건에 따라 성장 암 세포 선, PBS와 0.25 %trypsin (5 c m2당 1 mL)의 적절 한 금액을 추가 하는 5 분 x 1 3 x 셀 위에 얇은 레이어를 만듭니다. 혈 청을 포함 하는 매체의 금액 x 5 트립 신을 중화 하 고는 셀 이동 합니다. 예를 들어 5 ml의 트립 신 매체의 25 mL를 사용 합니다.
- 씨앗 잘 완전 한 매체의 8 µ L에서 당 500 세포의 총 1536-잘 조직 문화 취급 판으로 위해 104 셀/mL x 62.5에 셀 용액의 농도 조정 합니다.
- 생물 안전 캐비닛, 연동 펌프-기반 시스템으로 소독, 작은 스테인레스 스틸 밀고 카세트를 사용 하 여 셀을 시드하십시오. 다른 셀 라인 사이 살 균 PBS와 70% x 1 카세트의 튜브를 플러시 에탄올 10 s.
- 또는, 종자 소독, 작은 스테인레스 스틸 밀고 카세트와 연동 펌프 또는 셀 당 격판덮개의 볼륨에 따라 연결 된 주사기 펌프를 사용 하 여 HEPA 필터 로봇 룸 내에 있는 액체 처리기를 사용 하 여 셀 선 필요입니다.
- 수동으로 사용 하 여 통기성 접착 판 도장 중 또는 접시 마감재를 사용 하 여 접시를 봉인.
- 10 rpm 및 복합 추가, 5% CO2 와 95% 상대 습도와 이전 24 시간 동안 37 ° C 설정 회전 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
3. 복합 추가
- 10 m m 최고 농도와 액체 처리 로봇에 100% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 MAPK 억제제의 8 포인트, 3-fold 직렬 희석을 준비 합니다. 프로테아좀 억제제 Bortezomib 분석 결과의 동적 범위를 결정 하기 위해 죽이 완전 한 셀에 대 한 긍정적인 컨트롤로 사용 됩니다.
- 빠른 스핀 모든 시험 접시와 든 수집을 100 x g에서 복합 플레이트. 각 접시에서 접착 씰을 제거 하 고 8 총을 추가 하는 음향 분배기 설정에 접시를 놓고 각 화합물/희석 대표 하는 잘 당 0.1 %DMSO 최종 농도 10 µ M의 최고 복합 복용량의 nL.
- 화합물의 추가 완료 되 면, 주문 품, 스테인레스 스틸 셀 문화 뚜껑 접시에 증발을 방지 하 고 5d, 5% CO2 와 95% 상대 습도 대 한 37 ° C에서 회전 인큐베이터에 접시를 장소를 장소.
4. 검출 시 약 추가 및 원시 데이터의 취득
- 전 따뜻한 실내 온도에서 세포 증식 또는 37 ° C 물 욕조에 아데닌 3 인산 염 (ATP)에서 변화 하 고, 따라서, 변화를 감지 하는 소를 포함 하는 셀 세포 시 약의 적절 한 볼륨. 검출 시 약의 3 µ L의 총 각 잘 연동 펌프를 사용 하 여를 추가 하 고 적어도 15 분 동안 실내 온도에 격판덮개를 품 어.
- 플레이트 루미 노에 발광을 캡처하십시오.
5입니다. 데이터 처리
- 악기에서 원시 데이터를 추출 하 고 중립 제어로 혼자 DMSO를 포함 하는 모든 우물의 평균 시험 화합물을 포함 하는 모든 필드를 정상화. 이 값에서 각 화합물의 백분율 성장 저해를 계산 합니다. 이 Microsoft Excel에서 수식 함수를 사용 하 여 완료 되 면 어디 f (x) = {(샘플 값은 상대적인 빛 단위 (RLUs) / (평균 DMSO 값 RLUs) * 100)}.
- 그래프 프로그램을 사용 하 여 복합 농도 대 한 단계로 5.1에서 정규화 된 데이터의 값을 그래프에 의해 복용량 응답 곡선 및 금지 IC50s를 생성 합니다.
참고: 우리는 헬 리오스, 내부 NIBR 소프트웨어 도구를 사용 하 여 데이터를 분석. 이 기능을 완료 하려면 우리는 비패라메트릭 곡선 분석 도구를 선택.
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Representative Results
여기에 설명 된 방법을 사용 하 여 2D 문화 조건 하에서 잘 성장 하는 것으로 알려져 라인 테스트 설립된 암 세포의 다양 한. 대표 이미지 MAPK 돌연변이 암의 다양 한 세포 라인 (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-멜-30:NRAS, 및 학회-62:HRAS) 그림 1에서 볼 수 있습니다. 이러한 이미지는 셀 라인을가지고 있지만 다양 한 형태학, 각각 형성 3D 구조 분석 결과 1536-잘 접시에서 보여 줍니다. 그림 2 는 보여줍니다, 대규모 심사를 위해 사용 될 때 3D에서 2D 대 에 성장 하는 문화 사이의 차동 복합 감도 관찰할 수 있습니다. 그래프에 각 점 대표 한 화합물의 억제 농도 50% 셀 살인 나 두 설정에서 화합물의 IC50 응답. 효과 다른 미디어에 의해 전적으로 중재 하지 보여, Calu-6 셀 2D 조직 배양 플레이트 또는 첨부 파일을 방지 하는 3D Scivax biofilm 접시를 사용 하 여 동일한 미디어에 교양 있었다. 감도 증가 또는 3D 성장 조건에 대 한 더 낮은 IC50 같은 미디어에 두 화합물에 대 한 보충 그림 1 에 표시 됩니다. Calu-6 같은 라인 SK-멜-30 같은 라인은 3d 2D에 비해 덜 민감한 3D 조건 하에서 성장 될 때 화합물에 증가 된 감도 보여줍니다. 표 1이이 화면에 사용 된 모든 셀 라인에 대 한 추가 배경 정보를 포함 합니다.
대표 복용량 응답 곡선의 예는 그림 3에서 시각화 됩니다. 이 그림의 두 화합물, RAF265 차동 효능을 보여 줍니다 (그림 3A)와 RAF709 (그림 3B)는 RAF kinases의 활동을 억제. 두 화합물은 3D에 더 강력한 Calu-6, 비 작은 세포 폐 암은 조건 라인 은닉 Q61K, KRA 단백질에 활성화 돌연변이. 같은 시간에 두 화합물 3D spheroids 및 HCT116 대 장 암 선, KRA의 G13D 활성화 돌연변이 포함에서 2D 문화에서 마찬가지로 강력한 있습니다. 감도 증가의 효과 의해 중재가 입증을 3D 와 2D와 단순히 다른 미디어 조건, Calu-6 셀의 성장 조건 FBS를 사용 하 여 두 조건 하에서 성장 했다. 2D 및 3D 조건 FBS를 사용 추가 그림 1, 본, 3D 문화는 여전히 낮은 IC50 생산 화합물에 감도 증가 보여 줍니다.
마지막으로, 3D 분석 결과 또한 RAF 이합체 이합체-독립적인 통로 그리고 매우 활성화 된 RAS 돌연변이 라인에의 한 불완전 한 저해 때 발생 알려져 역설적 성장 활성화의 현상의 관찰을 허용 활성화 BRAF V600E 돌연변이11,12에서 발견. 그림 4에서 볼 수이 활성화 치료 학회-62에서 3D 조건 하에서 BRAF 억제 물 Dabrafenib, HRAS 돌연변이 작은 세포 폐 암 선 고도 비정형 BRAF 돌연변이 췌 장 세포에 라인 BxPC-3. 성장, 약의 낮은 농도에서 활성화 되 고 성장만 약물 (그림 4B)의 높은 농도에서 억압 된. 이 활성화 되지 놀랍게도 KRA 돌연변이 라인 Calu-6에 보였다 이며 BRAF V600E 돌연변이 라인 A375 예상 될 것이 지. 우리는 다른 3D 성장 모델 (데이터 표시 되지 않음)를 사용 하 여 Calu 6의 역설적인 활성화를 관찰 했습니다.
그림 1: 3D 1536-잘 접시에서 성장 하는 암 세포의 대표 이미지. 셀 시 약 디스펜서 및 작은 카세트를 사용 하 여 1536-잘 접시에 3 d의 총에 대 한 도금 했다. 브라이트 필드 이미지를 4 X 렌즈를 사용 하는 거꾸로 한 현미경에 인수 설명 MAPK 돌연변이 세포 라인 Calu에서 다양 한 3D 형태학-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-멜-30:NRAS, 및 학회-62:HRAS. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 점도 셀 라인에 걸쳐 2D- 대 3D 복합 효능 비교. 복합 효능은 결정 하기 전에 이전에 생성 된 3 d, spheroids 다음 추가 5 d에 대 한 화합물으로 치료 했다. 각 원형 독특한 복합 응답을 나타냅니다. 세포 증식에 변화 용균성 셀 확산 시 약을 사용 하 여 검색 된 그리고 IC50s 헬 리오스 라는 내부 소프트웨어와 함께 4-매개 변수 로지스틱 회귀 분석을 사용 하 여 계산 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 복용량 응답 곡선 비교 2D와 3D 화합물 효능. 복용량 응답 곡선 DMSO 컨트롤에 비해 복합 효능을 보여 줍니다. KRA 돌연변이 Calu-6 그리고 HCT116 세포 2 개의 RAF 억제제, RAF265 및 RAF709, 치료의 곡선 여기 표시 되는 DMSO에 비해 셀 성장 (% 성장 억제)에 변경에 백분율로 제어 우물. 2D 조건 하에서 성장 된 세포의 인구 빨간색으로 나타나고 3D spheroids로 성장 이들은 파란색. 데이터 주위 실선 각 데이터 집합에 대 한 95% 신뢰 간격을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 특정 3D 문화 캡처 역설적 성장 활성화의 현상. 복용량 응답 곡선 DMSO 컨트롤에 비해 복합 효능 (% 성장 억제)을 보여 줍니다. KRA 돌연변이 Calu-6, BRAF V600E 돌연변이 A375, HRAS 돌연변이 학회-62, Dabrafenib 여기 표시 됩니다 역설적 활성기 치료 불규칙 BRAF 돌연변이 BxPC-3 셀의 곡선. 2D 조건 하에서 성장 된 세포의 인구 빨간색으로 나타나고 3D spheroids로 성장 이들은 파란색. 데이터 주위 실선 각 데이터 집합에 대 한 95% 신뢰 간격을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1: 2D- 대 3D 복합 효능 미디어를 포함 하는 FBS에 비교 하는 복용량 응답 곡선. 복용량 응답 곡선 DMSO 컨트롤에 비해 복합 효능을 보여 줍니다. 2 개의 영국 공군 억제제, RAF265 및 RAF709, 치료 KRA 돌연변이 Calu-6 셀의 곡선 여기 표시 됩니다 백분율 셀 성장 (% 성장 억제)에 변화는 DMSO에 비해 우물을 제어. 2D 조건 하에서 성장 된 세포의 인구 빨간색으로 나타나고 3D spheroids로 성장 이들은 파란색. 두 조건 FBS 포함 된 미디어를 사용합니다. 오차 막대 2 개별 데이터 세트에서 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 셀 라인 이름 | 계보 | BRAF | RAS |
| A-375 | 흑색 종 | V600E | WT |
| BxPC-3 | 췌 장 | V487-P492 > A | WT |
| Calu6 | 비 작은 세포 폐 암 | WT | KRA Q61K |
| HCT 116 | 대 장 | WT | KRA G13C |
| IPC-298 | 흑색 종 | WT | NRAS Q61L |
| 학회-62 | 편평 상피 폐암 | WT | HRA Q61L |
| NCI H1299 | 폐 | WT | NRAS G12D |
| PANC-1 | 췌 장 | WT | KRA G12D |
| SKMEL-30 | 흑색 종 | WT | NRAS Q61K |
표 1: 셀 라인 정보입니다.
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Discussion
여기에 제시 된 방법을 대규모 복합 검 진을 위해 1536-잘 접시에 종양 spheroids를 생산 하는 방법에 대 한 상세한 프로토콜을 보여 줍니다. 이러한 방법은 종양 spheroids 유전 종속성 및 복합 감도13, 에 대 한 질문 6-잘, 96 잘 접시에 낮은 처리량 분석 실험에서 성장 했다 국립 암 연구소에 직장에서 처음 적응 했다 14 , 15.이 프로토콜의 중요 하 고 독특한 기능은 spheroids 1536-플레이트를 사용 하 여 정의 된 전통적인 2D 조직 배양 세포에서 형성 되는 미디어 SCM + 코 + ITS 라고. 일단 셀에 씨를 뿌리고, 그들은 3 d 회전 타원 체 형성의 기간 동안 어떤 증발을 방지 하기 위해 숨 접착제 열판으로 봉인 됩니다. Spheroids 사용 하 여이 접근16시간의 긴 기간 동안 또한 배양 수 있습니다. 구체 형성의 3 d, 후 화합물 용균성 기반 확산 시 약으로 세포 성장에 변경 시 금 전에 5 d에 대 한 추가 됩니다. 제어 우물과 2D 대 에서 경작 하는 세포 사이 IC50s의 계산을 정규화 후 3D, 화합물 취급 셀에 변경 내용을 제어 처리 셀에 비교 됩니다.
1536-잘 접시는 일반적인 조직 처리 접시 고 아니라 하이드로 겔 코팅 또는 셀-구 충 제 접시,이 프로토콜의 한계는이 프로토콜의 성공적인 실행에 중요 한 요소는 정의 된 매체를 사용 하 여. 고 혈 청 대체 처음 성공적으로 3D17 에서 배아 줄기 세포의 성장에 도움이 하는 기능에 대 한 테스트 및이 프로토콜에 맞게 조정 되었습니다 많은 종양 회전 타원 체 라인13,15, 의 성장에 대 한 18 , 19. 마약 감도의 차동 효과 성장 형식에 의해 중재는 시연, 미디어 조건이 다른 2D의 성장 세포 대 3D spheroids에 대 한, 비록 우리는 이전 주의 하 고 단순히 미디어 구성9차이.
문제 해결 단계와이 프로토콜의 성공을 보장 하는 일련의 분석 결과 개발 실험 처음 대형 화면에 착수 하기 전에 각 셀 라인을 최적화 하기 위해 실시는 좋습니다. 이 예제에서는 모든 셀 라인 분석 처음 그들이 잘 당 500 세포의 동일한 시작 밀도에 시드 수 경우 확인 하려면 평가 했다. 그들은 다음 DMSO 전용 번호판을 표준 편차 (SD)와 성장 기의 기간에 대 한 분산 (CVs)의 계수 검사로 분석 했다. 심지어 장소에서이 분석 결과 개발, 특정 다른 사람 보다 더 빨리 성장와 시드 밀도이 더 어려운 라인의 실험 기간을 더욱 최적화에 도움이 되었을 것 이다. 마지막으로, 여기에 제시 된 데이터는 경향 보다는 보편적인 현상, 특정는 NSCLC 같은 셀 라인 라인 Calu-6 차원에서 성장 그에 비해 3d에서 MAPK 통로 대상으로 하는 화합물에 고유 하 게 더 민감한 보여 줍니다. 추가 실험 어떤 생물 학적 메커니즘 크롤링으로 조절 감도이 눈에 띄는 차이를 확인 하려면 진행 되 고 있습니다.
울트라-HTS 설정에서 화면 spheroids 수 초기에 약물 검색 프로세스에서 사용 될 3D 문화를 허용 하 고는 3D 설정에서 활성화 하는 새로운 화학 물질의 식별을 가능 하 게 수 있습니다. 너무 많은 임상 후보 성장 억제에 시험관 및 회귀에 vivo에서보여주는 이기는 하지만 결코 환자에 효능의 부족으로 인해 시장에 도달, 팀 시작 했습니다 심문 여부 분석 실험 3D를 구현 할 수 있었다 검색 프로세스 동안 이전이 간격을 연결 합니다. 96-잘 또는 384-잘 방법을 사용 하 여 때 다른 접시 종류의 숫자 문화 셀 3D에 존재 합니다. 여기, 우리는 개별 spheroids의 여러 foci 생산 1536-잘 방법을 제시 했습니다. 미래에 이러한 결과 셀 상품, 교수형으로 성장할 수 있습니다.는 1536-잘 접시 또는 격판덮개는 하이드로 겔/Matrigel 코팅 되 있으며 라운드-하단, 같은 개발 하는 새로운 기술을 사용 하 여 비슷한 화면 비교 될 수 있습니다. 잘 당 한 구의 형성에 대 한 수 있습니다. 이러한 조건 심사, 심지어 더 순수 관련, 그들을 만들기 위해 사용 하는 문화 조건에 복잡성의 추가 레이어를 소개 것 및 잠재적으로 소설에 대 한 머리 맡에 벤치에서 번역의 증가 속도 나타내는 수 있습니다. 요법입니다. 이러한 기술 더 큰 spheroids의 사용을 요구 하는 저 산소 증 또는 확산 그라디언트를 포함 하는 과학적인 질문을 설정할 것.
방법 제시 여기 이들이 spheroids 화합물의 분자 라이브러리에 대 한 심사에 초점. 미래에 이러한 방법을 수 소설 biologics 및 bi-특정 항 체 또는 항 체 약물 어원이 같은 말, 3D 문화 더 순수 관련 항 체 항 원 상호 작용을 제공할 수 있습니다 같은 biotherapeutics에 대 한 화면을 확장 합니다. 또한, 3D spheroids 사용 하 여 이해 목표와 신흥 면역-종양학 공간21개입 질병 관련 분석 실험 개발에 중요 한 있을 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 노바 티 스의 직원 그리고 일부 직원 들도 주주.
Acknowledgments
저자 그의 지원 및이 분석 실험의 초기 개발에 대 한 지침에 대 한 변환 과학 발전, 건강의 국가 학회에 대 한 국립 센터에서 페 러 마크를 인정 하 고 싶습니다. 또한, 우리는 그들의 과학적인 입력 및 토론으로 프로젝트 팀 구성원에 대 한 앨리슨 프리먼, Mariela Jaskelioff, 마이클 애 커, Jacob Haling, 및 Vesselina 쿡을 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | ATCC | 30-2006 | Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors. |
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | Lonza | 12-604F | Purchased as a prepared solution. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Lonza | 12-115Q | Purchased as a prepared solution. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Hyclone | SH30042.01 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Purchased as a prepared solution. |
| 10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | Resuspend in sterile water. |
| 20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644 | Resuspend in sterile water. |
| 0.4% Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418 | Resuspend in sterile PBS and filter. |
| 1x Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Gibco | 51500056 | |
| 1% KnockOut (KO) Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | Add fresh right before use. |
| 100% Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7573 | Purchased as a prepared solution. |
| Consumables | |||
| Small Combi Cassette | ThermoFisher | 24073295 | |
| Small Multiflow Cassette | BioTek | 294085 | |
| 1536-well sterile TC plates (white) | Corning | 3727 | |
| 1536-well sterile TC plates (black) | Corning | 3893 | |
| Scivax Plates | MBL International | NCP-LH384-10 | |
| Equipment | |||
| Adhesives seals | ThermoFisher | AB0718 | |
| Spinning Incubator | LiCONiC | ||
| Stainless Steel Lids | The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF) | ||
| ATS Acoustic Dispensor | EDS Biosystems | ||
| Echo Acoustic Dispensor | Labcyte | ||
| Luminometer | Envision-Perkin Elmer | ||
| Peristaltic Pump- Multidrop Combi | ThermoFisher | ||
| Liquid Handler-Multiflow FX | BioTek |
References
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