Summary
さまざまな病気の徴候でもっと生理学的に関連するモデル開発およびに実装した創薬プログラムであります。ここで説明した新しいモデルのシステムは、回転楕円体を培養し、新しい抗がん剤を検索する高スループット 1536 ウェル プレート ベース システムで上映することができますどのように立体化腫瘍を示しています。
Abstract
プラスチックの表面を 2 次元 (2 D) 中がん細胞で培養されたが日常的に。この手法は、しかし、欠けている腫瘍の真の環境質量は、 in vivoにさらされています。固形腫瘍はプラスチック、関連付けられているシートではなく育つが、三次元 (3 D) のクローン細胞のコレクションとして代わりにスペースの彼らの隣人と正常細胞の極性の中断などの空間特性の相互作用します。これらの相互作用を引き起こす 3 D 培養細胞の生体内で腫瘍により関連している形態学的および細胞の特性を獲得します。さらに、腫瘍間質と免疫細胞だけでなく、他のすべてのセル型から細胞外マトリックスなど他の細胞型との直接接触、質量。堆積したマトリックスは、コラーゲンとフィブロネクチンなどの高分子で構成されます。
ベンチから枕元に腫瘍学の研究成果の翻訳を向上しようとして、多くのグループは、医薬品開発戦略における 3 D モデル システムの使用を調査し始めています。これらのシステムは、彼らは腫瘍の複雑な異機種混在環境を再現しようと思うのでもっと生理学的に関連すると考えられます。これらのシステムはしかし、非常に複雑にすることができますが 96-ウェル フォーマットおよび 384 でも今いくつかの成長に従う、彼らは大規模な成長とスクリーニングのためのいくつかの選択肢を提供します。これは、観察のギャップは、1536 ウェル プレートの高スループット能力における文化腫瘍スフェロイドを詳しくここで説明する方法の開発につながっています。これらのメソッドは、画面、および従来の 2 D の試金することは困難である非常に複雑な行列ベース システムに妥協を表します。さまざまな遺伝的変異を異なるがん細胞は Mitogen-Activated 蛋白質キナーゼや MAPK 経路をターゲット化合物の精選されたライブラリを使用して化合物の有効性を調べること、正常に上映されます。スフェロイド培養反応を比較する、2次元の成長細胞の応答と差分の活動が報告されます。これらのメソッドは、高スループットの 3 D 設定の複合アクティビティをテストするための独自のプロトコルを提供します。
Introduction
過去 10 年間より多くの研究は、プラスチックで 2 D のセルの成長によって完全に締めくくっているない概念を理解する 3 D 細胞培養モデルの使用を実装しています。これらの概念の例としては、生存率と細胞の運命を制御する細胞外のマトリックスの役割と同様、細胞の樹状突起と基底層の空間的なオリエンテーションが失われ、正常な上皮細胞極性1交替。特に、腫瘍学研究は、がん細胞と 2 D と 3 D 細胞培養システム3,4の違いの基本的な生物学を理解するのに 3 D モデルを使用います。高度な細胞培養の技術とウェル フォーマットへ彼らのさらに適応の開発は、3 D 設定で新しい薬剤のための検索を可能にしました。階層型セルラー システム5から異なるサイズの単一細胞型球を複雑腫瘍範囲の 3 D モデル、2 D 条件の下で複雑なマルチ マルチセル型球6,7,細胞とは対照的8します。 新規化合物または強力これら 3 d モデル システムの細胞死を誘発する生物学的製剤の発見は、したがって、薬物開発キャンペーンで高金利。これらのアッセイのエンドポイントは通常は細胞増殖の変化を評価するために 2D 文化で実行されるものと同じ、彼らはターゲット遺伝子や経路中の依存性の本当のレベルを明らかにするかもしれないときにもっと生理学的に関連する設定で実施し、尋問。
3次元培養系における薬物応答を検討するさまざまなモデル システムを開発されていると上記で紹介したが、大半どちらか 96 または 384 ウェルのマイクロ プレートを使用でよく使われる高スループットス クリーニング (HTS) 形式に容易に適応しません。薬物探索スクリーニング キャンペーン。このようなシステムは、液滴技術、回転楕円体の文化、天然または合成ゲル コラーゲン、マトリゲル、ポリエチレング リコール (PEG)2 などを組み込んだ浮上、文化を誘発する磁性粒子と細胞を脈動をぶら下げの使用を含む.1536 ウェル プレート形式で確立された細胞株から 3 D 回転楕円体文化を生成する手法の開発済みの詳細な方法を紹介します。このプロトコルでは、通常付着性のセル行9の添付ファイルを防止する非常に定義された媒体が使用されます。このシステムの制限があります (すなわちがんの複雑なモデル システムに完全に要約するだろうことはできません)、それにもかかわらず、これらの試金は低分子化合物の大規模なコレクションおよび薬剤応答の横比較のハイスループットス クリーニングを有効にします。間細胞および化合物のさまざまな 2D および 3D の文化。
細胞株は MAPK シグナル伝達経路は非常に癌の調節不全を経路に関係する遺伝子の突然変異港すべてこの資料の方法を示すが選択し、多くの治療法があります。路線の多くがあるもと呼ばれ、KRA、神経芽細胞腫 RAS または nras 登録で、ハーヴェイ ラット肉腫ウイルスの癌遺伝子または HRA、関連するキナーゼ、急速に加速する Fibrosarcomas として知られているキルステン ラット肉腫ウイルス発癌性突然変異をアクティブにします。Raf。最近の文献では、この経路の異なるノードの阻害剤は、3 D の条件9,10の下で育てられたときの細胞のサブセットの一意により効果があることを示唆しています。1 つの研究が見つかりました 3 D でアクティブな RAS 癌細胞培養、それら MAPK の阻害剤への感受性の増加を示したし、さらに、このアプローチは経路を識別することができるし、伝統的な 2 D で逃したかもしれない阻害剤を対象と設定します。本研究の目的はこれらの細胞株を培養するために使用方法を提示する、さらに、差分を示す 3 D を使用して場合にのみに観察することができますこれらの阻害剤への応答細胞培養システム。
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Protocol
1. 腫瘍 1536 ウェル 3 D 回転楕円体の培養
- ダルベッコ変更イーグルス媒体 (DMEM/f12 キー) の 500 mL に次の試薬を追加して新鮮な 3 D 腫瘍回転楕円体中幹 (細胞培地 + ノックアウト血清交換 + インシュリン ・ トランスフェリン ・ セレニウム) を準備: 1 x ペニシリン/ストレプトマイシン、人間の 10 ng/mL塩基性繊維芽細胞成長因子 (bFGF)、ひと上皮成長因子 (EGF)、0.4% ウシ血清アルブミン (BSA) (一部分 V)、インシュリン ・ トランスフェリン-セレンと 1% のノックアウト (KO) 血清交換 (はない凍結融解) x 1 の 20 ng/mL。
- フィルター - 0.4 μ m ボトル上部フィルター システムを通じてサプリメントで培地全体を滅菌します。
- それらを洗浄することにより伝統的な細胞培養フラスコからの推奨されるルーチン培養条件に従って成長している癌セルラインをデタッチ 3 x 1 x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と 0.25% トリプシン (1 mL の適切な量を追加します。5 cm2) あたり細胞の薄層を作成する 5 分間。血清を含む培地の量 × 5 とトリプシンを中和し、セルをカウントに進みます。たとえば、5 ml のトリプシン 25 mL の培地を使用します。
- 1536 ウェル組織文化処理板に回転楕円体中の 8 μ L の井戸あたり 500 セルの合計をシードするために4セル/mL の 10 x 62.5 に細胞液の濃度を調整します。
- 生物学的安全キャビネット、蠕動ポンプがベース システムと滅菌、小さなステンレス鋼先端のカセットを使用してセルをシードします。別のセル行の間フラッシュ 1 × PBS と 70% とカセットのチューブ 10 用エタノール s。
- また、滅菌、小さなステンレス鋼先端カセットと蠕動性ポンプまたは枚必要なセルの行の数によっての接続されたシリンジ ポンプ使用 HEPA フィルターの部屋内にある液体ハンドラーを使用してセルをシードします。
- どちらか通気性粘着プレート シールを使用して手動でまたはプレート シーラーを使用してプレートをシールします。
- 10 rpm と 5% の二酸化炭素 (CO2) と相対湿度 95% の 37 ° C に設定回転インキュベーターにプレートを配置します。3 d のフォームに回転楕円体を許可します。
2. 1536 ウェル 2D 癌細胞株の培養
注: 1536 ウェル 2 D がん線を 3 D プレートに化合物の付加の前に 24 時間培養する必要があります。
- 選択した行の適切な成長培地 500 mL に次の試薬を追加して 2 D がん細胞の培地を準備: ペニシリン/ストレプトマイシンと 10% ウシ胎児血清 (FBS) × 1。
- フィルター - 0.4 μ m ボトル上部フィルター システムを通じてサプリメントで培地全体を滅菌します。
- それらを洗浄することにより伝統的な細胞培養フラスコからの推奨されるルーチン培養条件に従って成長している癌セルラインをデタッチ x PBS と 0.25% トリプシン (5 cm2あたり 1 mL) の適切な量を追加する 5 分の 1 と 3 倍セル上の薄層を作成します。血清を含む培地の量 × 5 とトリプシンを中和し、セルをカウントに進みます。たとえば、5 ml のトリプシン 25 mL の培地を使用します。
- 1536 ウェル組織文化処理板に完全培地の 8 μ L の井戸あたり 500 セルの合計をシードするために4セル/mL の 10 x 62.5 に細胞液の濃度を調整します。
- 生物学的安全キャビネット、蠕動ポンプがベース システムと滅菌、小さなステンレス鋼先端のカセットを使用してセルをシードします。異なる細胞間フラッシュ滅菌 PBS と 70% × 1 カセットのチューブ 10 用エタノール s。
- また、滅菌、小さなステンレス鋼先端カセットと蠕動性ポンプまたはセルごとプレートの量に応じて、添付のシリンジ ポンプを使用してロボットの HEPA フィルター部屋内にある液体ハンドラーを使用してセルをシードします。必要な行。
- どちらか通気性粘着プレート シールを使用して手動でまたはプレート シーラーを使用してプレートをシールします。
- 10 rpm と 5% CO2と 95% 相対湿度と、化合物の添加前に 24 h の 37 ° C に設定回転インキュベーターにプレートを配置します。
3. 化合物添加
- 10 mM トップ濃度液体ハンドリング ロボットの 100% ジメチルスルホキシド (DMSO) における MAPK の阻害剤の 8 ポイント、3 倍連続希釈液を準備します。プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブは、完全な細胞アッセイのダイナミック レンジを決定する殺害のポジティブ コントロールとして使用されます。
- クイック スピンすべてアッセイ プレートおよび結露を収集する 100 x g で複合板。各板から粘着のシールを外して、8 の合計を追加する音響ディスペンサー セットアップ上プレート ウェルあたり 0.1 %dmso の最終濃度と 10 μ M の最上化合物線量を表す各化合物/希釈の nL。
- 化合物の添加が完了した後は、プレート上の蒸発を防ぎ、5 d、5% CO2と 95% 相対湿度の 37 ° C で回転の定温器にプレートを置きオーダーメイドのステンレス製細胞文化ふたを配置します。
4. 検出試薬の追加と生データの獲得
- あらかじめ暖かい室温で増殖、37 ° C の水浴アデニン三リン酸 (ATP) の変更と、つまり、変更を検出するためルシフェリンを含むセル換散試薬の適切なボリューム。蠕動ポンプを使用しても検出試薬の 3 μ L の合計を追加し、少なくとも 15 分間室温でプレートを孵化させなさい。
- プレート ルミノの発光をキャプチャします。
5 データ処理
- 計測器から生データを抽出し、ニュートラル制御として単独で DMSO を含むすべての井戸のなかにテスト化合物を含むすべてのフィールドを正規化します。この値は、各化合物のパーセントの成長阻害を算出します。Microsoft Excel で数式関数を使用が完了すると、 f (x) = {(サンプルの値の相対的な光の単位 (RLUs)/(平均 DMSO 値 RLUs) * 100)}。
- グラフのプログラムを使用して化合物の濃度に対して手順 5.1 から正規化されたデータの値をグラフ化して用量-反応曲線と抑制 IC50s を生成します。
注: ヘリオス、内部の NIBR ソフトウェア ツールを使用してデータ分析を行った。この関数を完了するには、ノンパラ メトリック曲線分析ツールを選択しました。
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Representative Results
2次元培養条件下でよく成長する知られている行は、ここで説明した方法を使用してテストされた確立されたがん細胞の様々 な。細胞株における MAPK 変異癌のさまざまなから代表的なイメージ (Calu-6:KRAS、NCI-H1299:NRAS、SK-メル-30:NRAS と教訓集-62:HRAS)図 1に示します。これらの画像は、その細胞株には、様々 な形態があるが、それぞれに形成された 3 D 構造 1536 ウェル アッセイ プレートを示しています。図 2は、ことを示します、大規模スクリーニングを行う際文化 3 D、2 D対で栽培間差分化合物の感度を観察できます。グラフの各ドットを表す 1 つの化合物の阻害濃度 50% セル殺害または両方の設定で化合物の IC50 応答があります。効果はさまざまなメディアによってもっぱらプロテストを示すため、Calu 6 セルは、2 D の組織培養プレートまたは添付ファイルを防ぐため 3 D Scivax バイオ プレートを使用して同じメディアで培養しました。感度の向上や 3 D の成長条件の下の IC50 は、同じメディアの 2 つの化合物の補足図 1に見られます。Calu 6 のような線は、SK-メル-30 のようなラインが 2 D と比較して 3 D で重要度の低い 3 D の条件の下で育てられたときの化合物への感受性の増加を示しています。表 1 には、この画面で使用されたすべてのセル行に関する追加の背景情報が含まれています。
代表的な用量-反応曲線の例としては、図 3に視覚化されます。この図は、2 つの化合物は、RAF265 の差動効果を示して (図 3 a) と RAF709 (図 3 b)、これは RAF キナーゼの活性を阻害します。両方の化合物は 3 D でより強力な Calu - 6、非小細胞肺癌は、条件行 KRAS タンパクの活性化突然変異遺伝子 Q61K。同時に両方の化合物は、3 D 回転楕円体と KRA の G13D の活性化変異を含む HCT116 コロン癌ラインから二次元文化に同様に強力なです。高められた感度の影響により媒介されることを示すための 3 Dと2 D と Calu 6 セル別のメディア条件によって単に成長の条件に両方の条件の下で政府短期証券を使用して成長しました。2 D と 3 D の両方の条件が政府短期証券を使用して補足図 1で見た、3次元培養はまだ低い IC50 を作り出す化合物への感受性の増加を示します。
最後に、3 D のアッセイも逆説的な成長の活性化のために、RAF 二量体と二量体非依存性経路の高活性の RAS 突然変異系統での不完全な阻害がある場合に発生する知られている現象の観察を許可活性化 BRAF V600E 変異11,12が見つかりました。この活性化は、図 4に見られるマキセン 62 の 3 D 条件下で BRAF 阻害剤 Dabrafenib による治療、HRAS 突然変異の小さい細胞の肺がん細胞とも非定型 BRAF 変異膵細胞により 3 行。成長は薬剤の低濃度の活性化し、成長は高濃度薬剤 (図 4 b) の抑圧だけ。この活性化は、KRAS 変異体ライン Calu 6 では見られなかった意外、V600E 変異体ライン A375 で期待されるべきではないです。我々 は、Calu 6 他の 3次元成長モデル (データは示されていない) を使用の逆説的な活性化を観察しました。
図 1: 3 D の 1536 ウェル プレートで成長している癌細胞の代表的なイメージです。細胞は、1536 ウェル プレート試薬ディスペンサーと小型カセットを使用して 3 d の合計のメッキだった。4 X レンズを用いた倒立顕微鏡明視野画像を示す MAPK 変異細胞株 Calu の様々 な 3 D 形態-6:KRAS、NCI-H1299:NRAS、SK-メル-30:NRAS と教訓集-62:HRAS。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: セルの行、2 D対3 D 複合性を比較する散布します。回転楕円体は、3 d 用に生成された以前は、化合物の有効性を決定する前に、追加の 5 d の化合物と扱われました。各サークルは、ユニークな複合応答を表します。細胞増殖の変化は溶菌細胞増殖試薬を使用して検出され、IC50s は、内部ソフトウェアのヘリオスと呼ばれる 4 パラメータ ・ ロジスティック回帰分析を使用して算出しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 用量反応曲線の比較 2 D対3 D 化合物性。用量反応曲線は、DMSO コントロールと比較して化合物の有効性を実証します。KRAS 変異 Calu 6 と 2 つの RAF 阻害剤、RAF265、RAF709、HCT116 細胞の曲線がここに表示されます、DMSO と比較して細胞成長 (成長阻害率) の変化の割合として井戸を制御します。赤で 2 D の条件の下で育てられたセルの人口が表示され、3 D 回転楕円体として栽培したものは、青。データの周囲の実線は、各データの 95% 信頼区間を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 特定の 3 D 文化が逆説的な成長活性化の現象をキャプチャします。用量反応曲線は、DMSO コントロールと比較して化合物の効果 (成長阻害率) を示しています。KRAS 変異 Calu 6、BRAF V600E 変異 A375、HRAS 突然変異マキセン-62、および Dabrafenib が表示されますここで逆説的な活性剤で治療、非定型の BRAF 変異により 3 セルの曲線。赤で 2 D の条件の下で育てられたセルの人口が表示され、3 D 回転楕円体として栽培したものは、青。データの周囲の実線は、各データの 95% 信頼区間を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1: 用量反応曲線、2 D対3 D 化合物の効力感メディアを含む政府短期証券を比較します。用量反応曲線は、DMSO コントロールと比較して化合物の有効性を実証します。2 つの RAF 阻害剤, RAF265、RAF709、治療 KRAS 変異 Calu 6 セルの曲線がここに表示されます、DMSO と比較して細胞成長 (成長阻害率) の変化の割合として井戸を制御します。赤で 2 D の条件の下で育てられたセルの人口が表示され、3 D 回転楕円体として栽培したものは、青。両方の条件は、政府短期証券を含むメディアを使用します。誤差範囲は、個々 の 2 のデータ セットから標準偏差を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| セルの行名 | リネージュ | BRAF | RAS |
| A-375 | 悪性黒色腫 | V600E | WT |
| により 3 | 膵臓 | V487 P492 > A | WT |
| Calu6 | 非小細胞肺癌 | WT | KRAS Q61K |
| HCT 116 | 大腸 | WT | KRAS G13C |
| IPC-298 | 悪性黒色腫 | WT | NRAS 登録で Q61L |
| 教訓集 62 | 扁平上皮肺癌 | WT | HRA Q61L |
| NCI H1299 | 肺 | WT | NRAS 登録で G12D |
| PANC-1 | 膵臓 | WT | KRAS G12D |
| SKMEL 30 | 悪性黒色腫 | WT | NRAS 登録で Q61K |
表 1: セルの行情報。
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Discussion
紹介した方法は、大規模化合物スクリーニングのための 1536 ウェル プレートで腫瘍を回転楕円体を生成する方法の詳細なプロトコルを示します。これらのメソッドは当初腫瘍回転楕円体が遺伝的依存関係および化合物の感度13,について質問をする 6 ウェルや 96 ウェルのプレートの低スループット試金で育った国立がん研究所での仕事から合わせられました。14,15します。 このプロトコルの重要な機能は、回転楕円体は、1536 プレートを使用して定義されている伝統的な 2 d の組織培養細胞から形成されている SCM + KO + ITS と呼ばれるメディアです。セルのシードは、一度 3 d 回転楕円体形成の期間にわたって任意の蒸発を防ぐために通気性のある接着プレート シールでシールされます。回転楕円体は、このアプローチの16を使用して時間の長い期間も培養することができます。球形成の 3 d は、化合物が 5 d の試金の溶解による増殖試薬で細胞の成長に変更する前に追加されます。コントロール井戸と 2 D対で培養された細胞間 IC50s の計算の正規化後 3 D、化合物処理細胞の変化はコントロール処理細胞と比較されます。
1536 ウェル プレートは通常組織治療板とないハイドロゲル被覆またはセル撥プレート、このプロトコルの制限は、このプロトコルの実行が成功を重要な要因である培地の使用。KO 血清交換当初正常に 3 D17の萌芽期の幹細胞の成長を支援する能力のためにテストされた、このプロトコルで多く腫瘍回転楕円体線13,15、の成長のために適応されています。18,19しますには、2 d の成長細胞スフェロイド対3 d のメディア条件が異なる、我々 以前を示している薬剤感受性の差異が成長形式によって仲介されることに注意してくださいではなく。単にメディア組成9の違い。
トラブルシューティングの手順として、このプロトコルの成功のためには、一連のアッセイ開発実験は大型スクリーンで積み込む前に各セルラインを最適化する最初運ばれているをお勧めします。この例では、すべての試金される細胞ラインは最初ウェルあたり 500 セルの同じ開始密度での播種することができるかどうかを決定する評価されます。彼らは、DMSO 専用板標準偏差 (SD) と分散 (CVs) 成長期の持続期間のための係数を調べることで測定しました。でもこのアッセイの開発の場所で、特定の行が他のものより速く成長した、播種密度とこれらのより挑戦的なラインの実験の期間をさらに最適化に有益だったと思います。最後に、ここで示したデータは普遍的な現象ではなく、傾向がある、特定の非小細胞肺癌のような細胞ライン Calu-6 化合物の 2 D で栽培したものと比較して 3 D で MAPK 経路をターゲットに一意により敏感になることを示します。追加の実験は、進行中である生物学的メカニズムがこの印象的な感度の違いを調節するのに貢献する可能性がありますを決定します。
超高温超電導の設定で画面を回転楕円体により、創薬プロセスの早い段階で使用する 3 D の文化とが 3 D の設定でアクティブのみ新規の化学物質の識別を有効にすることがあります。非常に多く臨床候補とはいえ成長阻害体外と回帰体内を示す患者での有効性の不足のため市場に届かない、チームが尋問を開始試金の 3 D を実装するかどうか可能性があります。検出処理中にこのギャップを埋めます。異なるプレートの種類の数は、384 ウェルまたは 96 ウェルのメソッドを使用して 3 D で培養細胞に存在します。ここでは、個々 の回転楕円体の複数の巣を作り出す 1536 ウェル方法を提示しています。将来は、滴をぶら下げとして細胞を育てることができる 1536 ウェル プレートやハイドロゲル/マトリゲルでコーティングされている、丸底のプレートなど開発下にある新しいテクノロジを使用して同様の画面にこれらの調査結果を比較することウェルあたり 1 つの球の形成にできるようになります。これらの条件ももっと生理学的に関連し、スクリーニングに使用する培養条件の複雑さの追加レイヤーを導入すると、ベンチからベッドサイドの小説への変換の増加率を表すことができる可能性があります。療法。これらの技術は、低酸素または拡散のグラデーションより大きい回転楕円体を使用する必要を含む科学的な質問を可能になります。
ここで紹介した方法は小分子化合物ライブラリに対してこれらの球体をスクリーニングに焦点を当てる。将来は、これらのメソッドは、生物製剤と伸びて双特異抗体や抗体と薬物の抱合体、3 D 文化がもっと生理学的に関連する抗体-抗原の相互作用を提供可能性がありますなど、画面を展開が可能します。さらに、3 D 回転楕円体の使用は、理解ターゲットおよび新興の免疫腫瘍スペース21の介入の病気関連アッセイの開発に重要な可能性があります。
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Disclosures
著者は、ノバルティス社の社員、何人かの従業員も株主です。
Acknowledgments
著者は、彼のサポートとこれらのアッセイの初期の開発に関するガイダンスを進めるトランスレーショナル科学、健康の国民の協会の国立センターでマルク ・ フェレールを認めると思います。さらに、彼らの科学知識とプロジェクト チームのメンバーとの議論のためアリソン ・ フリーマン、マリエラ Jaskelioff、マイケル ・ アッカー、ヤコブ Haling、Vesselina ・ クックに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | ATCC | 30-2006 | Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors. |
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | Lonza | 12-604F | Purchased as a prepared solution. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Lonza | 12-115Q | Purchased as a prepared solution. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Hyclone | SH30042.01 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Purchased as a prepared solution. |
| 10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | Resuspend in sterile water. |
| 20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644 | Resuspend in sterile water. |
| 0.4% Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418 | Resuspend in sterile PBS and filter. |
| 1x Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Gibco | 51500056 | |
| 1% KnockOut (KO) Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | Add fresh right before use. |
| 100% Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7573 | Purchased as a prepared solution. |
| Consumables | |||
| Small Combi Cassette | ThermoFisher | 24073295 | |
| Small Multiflow Cassette | BioTek | 294085 | |
| 1536-well sterile TC plates (white) | Corning | 3727 | |
| 1536-well sterile TC plates (black) | Corning | 3893 | |
| Scivax Plates | MBL International | NCP-LH384-10 | |
| Equipment | |||
| Adhesives seals | ThermoFisher | AB0718 | |
| Spinning Incubator | LiCONiC | ||
| Stainless Steel Lids | The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF) | ||
| ATS Acoustic Dispensor | EDS Biosystems | ||
| Echo Acoustic Dispensor | Labcyte | ||
| Luminometer | Envision-Perkin Elmer | ||
| Peristaltic Pump- Multidrop Combi | ThermoFisher | ||
| Liquid Handler-Multiflow FX | BioTek |
References
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