Summary
Über eine Vielzahl von Anzeichen der Krankheit werden mehr physiologisch relevanten Modelle entwickelt und implementiert in Drug Discovery-Programme. Das neue Modellsystem hier beschriebenen zeigt wie dreidimensionale Tumor Sphäroide kultiviert und in ein Hochdurchsatz-1536-Well-Platte-basiertes System zur Suche neuer Krebsmedikamente abgeschirmt werden können.
Abstract
Krebszellen haben routinemäßig zweidimensional (2D) auf einer Kunststoffoberfläche kultiviert worden. Diese Technik, allerdings fehlt die echte Umgebung eines Tumors Masse in Vivoausgesetzt ist. Solide Tumoren wachsen nicht wie ein Blatt aus Kunststoff befestigt, sondern vielmehr als eine Sammlung von klonalen Zellen in eine dreidimensionale (3D) Platz Interaktion mit ihren Nachbarn und mit verschiedenen räumlichen Eigenschaften, wie z. B. die Unterbrechung des normalen zellulären Polarität. Diese Wechselwirkungen verursachen 3D-kultivierte Zellen, morphologische und zelluläre Eigenschaften zu erwerben, die für in Vivo Tumoren relevant ist. Darüber hinaus ein Tumor Masse steht in direktem Kontakt mit anderen Zelltypen wie Stromazellen und immun-Zellen sowie die extrazelluläre Matrix aus anderen Zelltypen. Die Matrix hinterlegt besteht aus Makromolekülen wie Kollagen und Fibronektin.
In einem Versuch, die Übersetzung von Forschungsergebnissen in der Onkologie von Bank zu Bett zu erhöhen haben viele Gruppen begonnen, die Verwendung von 3D Modellsysteme in ihre Droge Entwicklungsstrategien zu untersuchen. Diese Systeme werden gedacht, um mehr physiologisch relevant sein, weil sie versuchen, die komplexe und heterogene Umgebung eines Tumors zu rekapitulieren. Diese Systeme können jedoch sehr komplex sein, und zwar offen für Wachstum in 96-Well-Formate, und einige jetzt auch in 384, sie bieten nur wenige Möglichkeiten für groß angelegte Wachstum und Screening. Dies beobachtete Lücke führte zu die Entwicklung von Methoden, die hier im Detail zu Kultur Tumor Sphäroide in einer Hochdurchsatz-Kapazität im Jahre 1536-Well Platten beschrieben. Diese Methoden stellen einen Kompromiss um die hochkomplexen Matrix-basierte Systeme, die schwer zu Bildschirm und herkömmlichen 2D Assays sind. Eine Vielzahl von Krebszelllinien beherbergen verschiedene genetische Mutationen werden erfolgreich gezeigt, zusammengesetzte Wirksamkeit von kuratierten Bibliotheksbenützung Verbindungen gezielt die Mitogen-Activated Protein Kinase oder MAPK Weg zu untersuchen. Sphäroid Kultur Antworten sind dann im Vergleich zu der Reaktion der Zellen gezüchtet in 2D, und unterschiedliche Aktivitäten berichtet. Diese Methoden bieten ein einzigartiges Protokoll für zusammengesetzte Aktivität in einer Hochdurchsatz-3D-Umgebung testen.
Introduction
In den letzten zehn Jahren haben immer mehr Studien die Verwendung von 3D zellmodelle Kultur, Konzepte zu verstehen, die nicht vollständig zusammengefaßt sind, durch den Anbau von Zellen in 2D auf Kunststoff umgesetzt. Beispiele für diese Konzepte sind der Wechsel in normalen Epithelzelle Polarität1 wo die räumliche Orientierung der apikale und basale Schichten von Zellen sind verloren, als auch die Rolle der extrazellulären Matrix bei der Regulierung der Überlebens- und Zelle Schicksal. Onkologie-Forschung hat insbesondere 3D-Modelle verwendet, um die grundlegende Biologie von Krebszellen und die Unterschiede zwischen 2D und 3D Zelle Kultur Systeme3,4zu verstehen. Die Entwicklung der anspruchsvollere Zelle Kulturtechniken und ihre weitere Anpassung an Multi-gut Formate hat die Suche nach neuen Medikamenten in 3D Einstellungen ermöglicht. Im Gegensatz zu Zellen 2D Bedingungen, 3D-Modelle von Tumoren Palette in ihrer Komplexität von zellulären Schichtsysteme5 Single-Cell-Typ Kugeln in verschiedenen Größen, angebaut auf komplexe multi-Zell-Typ Kugeln6,7, 8. die Entdeckung von neuartigen Verbindungen oder Biologics, die potent Zelltod in diesen Systemen 3D-Modell induzieren ist daher von großem Interesse in Drogen-Entwicklung-Kampagnen. Endpunkte dieser Assays sind oft identisch mit denen in 2D Kulturen, Änderungen in der Zellproliferation beurteilen durchgeführt, sondern in einer mehr physiologisch relevanten Umgebung durchgeführt, können sie das wahre Niveau der Abhängigkeit des Zielgens oder Weg zu offenbaren verhört.
Da oben eingeführt, wurde eine Vielzahl von Modellsystemen entwickelt, um die Droge Reaktionen in 3D Culture Systeme zu studieren, aber die meisten verwenden entweder 96 oder 384-Well Mikrotiterplatten und sind nicht leicht anpassbar an häufig verwendeten im Hochdurchsatz-screening (HTS) Formate Drogen-Entdeckung-Screening-Kampagnen. Solche Systeme umfassen die Verwendung von hängenden Tropfen Technologien, Sphäroid Kulturen, pulsierende Zellen mit magnetischen Partikeln induzieren Levitation und Kulturen unter Einbeziehung natürlicher oder synthetischer Gele wie Kollagen, Matrigel oder Polyethylenglykol (PEG)2 . Hier präsentieren wir Ihnen die detaillierte Methoden einer zuvor entwickelten Technik, 3D Sphäroid Kulturen von etablierten Zelllinien in einem Format von 1536-Well-Platte zu produzieren. In diesem Protokoll wird ein hoch definierte Medium die verhindert, die Befestigung der normalerweise adhärente Zellen Linien9 dassverwendet. Dieses System hat Grenzen (d. h., es kann nicht vollständig rekapitulieren, ein komplexes Modellsystem von Krebs), aber dennoch, diese Tests ermöglichen eine Hochdurchsatz-Screening von großen Sammlungen von kleinen Molekülen und quer Vergleiche der Medikamente zwischen 2D und 3D Kulturen gegen eine Vielzahl von Zell-Linien und Verbindungen.
Die Zell-Linien ausgewählt, um den Methoden in diesem Artikel zeigen alle Hafen Mutationen in Genen, die im Zusammenhang mit der MAPK Signalweg, einen Pfad hoch Dysregulated bei Krebs ist und für welche viele Therapeutika stehen zur Verfügung. Viele der Linien verfügen über Aktivierung von Onkogenen Mutationen in der Kirsten Ratte Sarkom-Virus auch genannt KRAS, Neuroblastom RAS oder NRB Harvey Ratte Sarkom Virus Onkogen oder HRAS und der damit verbundenen Kinasen rasant beschleunigt Fibrosarcomas, auch bekannt als RAFs. Neuere Literatur legt nahe, dass die Inhibitoren der verschiedenen Knoten dieses Pfades eindeutig wirksamer in eine Teilmenge der Zell-Linien beim Anbau unter 3D Bedingungen9,10 sind. Eine Studie hat herausgefunden, dass wenn Krebszellen mit aktiven RAS in 3D gezüchtet wurden, sie eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber MAPK-Inhibitoren zeigten, und ferner, dass dieser Ansatz konnte Wege identifizieren und gezielt Inhibitoren, die in der traditionellen 2D verpasst Einstellung. Das Ziel dieser Studie ist es, die Methoden verwendet, um diese Zelllinien Kultur zu präsentieren, und weiter, um das Differential zu demonstrieren Reaktionen auf diese Inhibitoren, die Sie beachten können, nur bei Verwendung von 3D zellsystemen Kultur.
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Protocol
(1) Kultivierung von 1536-Well 3D Tumor Sphäroide
- Bereiten Sie einen frischen 3D Tumor Sphäroid mittlerer Stiel (Zelle Medium + ko-Serum Ersatz + Insulin-Transferrin-Selen) indem Sie die folgenden Reagenzien zu 500 mL Dulbeccos geändert Eagles Medium (DMEM/F12): 1 X Penicillin/Streptomycin, 10 ng/mL des menschlichen grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), 20 ng/mL des menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), 0,4 % Rinderserumalbumin (BSA) (Teil V), 1 x Insulin-Transferrin-Selen und 1 % Knockout (KO) Serum Ersatz (nicht Frost-Tau-wechseln).
- Sterilisieren Sie Filter-das gesamte Medium mit den Ergänzungen durch ein 0,4 µm-Flaschenverschluss Filter-System.
- Lösen Sie die Krebs-Zelllinien, die nach empfohlenen Routine Kulturbedingungen, aus den traditionellen Zellkultur Kolben durch Waschen sie gewachsen sind 3 X mit 1 X Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und einen angemessenen Betrag von 0,25 % Trypsin (1 mL hinzufügen pro 5 cm2) für 5 min, eine dünne Schicht über die Zellen zu erstellen. Neutralisieren Sie die Trypsin mit 5 x die Menge des Mediums, enthält das Serum zu und fahren Sie mit der Zellen zählen. Z. B. 25 mL Medium für 5 mL Trypsin.
- Passen Sie die Konzentration der Zelle zu 62,5 x 104 Zellen/mL Lösung um insgesamt 500 Zellen pro Bohrloch in 8 µL Sphäroid Medium in der 1536-Well-Platten Gewebe-Kultur-behandelten Samen.
- Samen Sie in einer biologischen Sicherheitsschrank die Zellen mit einer sterilisierten, kleine Edelstahl-Stahl-Kreissägeblätter Kassette mit einer peristaltischen Pumpe-basierendes System. Zwischen verschiedenen Zelllinien, spülen Sie den Schlauch von der Kassette mit 1 x PBS und 70 % Ethanol für 10 s.
- Alternativ, Samen der Zellen unter Verwendung eines liquiden Handlers befindet sich innerhalb eines HEPA-Filtern Raumes mit einer sterilisierten, kleine Edelstahl-Stahl-Kreissägeblätter Kassette und einer peristaltischen Pumpe oder eine angehängte Spritzenpumpe, abhängig von der Anzahl der Platten pro Zelle Zeile benötigt.
- Versiegeln Sie die Platten mit einer atmungsaktiven Haftplatte Dichtung entweder manuell oder mit Platte Siegler.
- Legen Sie die Platten in einem drehenden Inkubator gesetzt bei 10 min und 37 ° C mit 5 % Kohlendioxid (CO2) und 95 % Relative Luftfeuchtigkeit. Lassen Sie die Sphäroide Formular für 3-d.
2. Kultivierung von 1536-Well 2D Krebs Linien
Hinweis: Die 1536-Well-2D Krebs-Linien sollten 24 h vor der Zugabe der Verbindung zu den 3D Platten kultiviert werden.
- 2D Krebs Zelle Medium vorzubereiten, indem Sie die folgenden Reagenzien zu 500 mL einer geeigneten Wachstumsmedium für die ausgewählten Positionen: 1 x Penicillin/Streptomycin und 10 % fetalen bovine Serum (FBS).
- Sterilisieren Sie Filter-das gesamte Medium mit den Ergänzungen durch ein 0,4 µm-Flaschenverschluss Filter-System.
- Lösen Sie die Krebs-Zelllinien, die nach empfohlenen Routine Kulturbedingungen, aus den traditionellen Zellkultur Kolben durch Waschen sie gewachsen sind 3 X mit 1 x PBS und einen angemessenen Betrag von 0,25 % Trypsin (1 mL pro 5 cm2) für 5 min zum Hinzufügen Erstellen Sie eine dünne Schicht über die Zellen. Neutralisieren Sie die Trypsin mit 5 x die Menge des Mediums, enthält das Serum zu und fahren Sie mit der Zellen zählen. Z. B. 25 mL Medium für 5 mL Trypsin.
- Passen Sie die Konzentration der Zelle zu 62,5 x 104 Zellen/mL Lösung um insgesamt 500 Zellen pro Bohrloch in 8 µL kompletten Medium in Gewebe-Kultur-behandelten 1536-Well-Platten Samen.
- Samen Sie in einer biologischen Sicherheitsschrank die Zellen mit einer sterilisierten, kleine Edelstahl-Stahl-Kreissägeblätter Kassette mit einer peristaltischen Pumpe-basierendes System. Zwischen den verschiedenen Zelllinien, spülen Sie den Schlauch von der Kassette mit 1 x sterile PBS und 70 % Ethanol für 10 s.
- Alternativ, Samen der Zellen unter Verwendung eines flüssigen Handlers befindet sich in einem HEPA-Filtern Robotik-Raum mit einer sterilisierten, kleine Edelstahl-Stahl-Kreissägeblätter Kassette und einer peristaltischen Pumpe oder die angehängte Spritzenpumpe, abhängig vom Umfang der Platten pro Zelle Zeile benötigt.
- Versiegeln Sie die Platten mit einer atmungsaktiven Haftplatte Dichtung entweder manuell oder mit Platte Siegler.
- Legen Sie die Platten in einem drehenden Inkubator auf 10 u/min und 37 ° C für 24 h vor dem zusammengesetzten Zusatz, mit 5 % CO2 % bis 95 % Relative Luftfeuchtigkeit eingestellt.
(3) zusammengesetzte Zusatz
- Bereiten Sie 8-Punkt, 3-fach serielle Verdünnungen von MAPK Inhibitoren in 100 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) sich auf ein Liquid-Handling-Roboter mit einer 10 mM höchste Konzentration. Die Proteasom-Inhibitor Bortezomib dient als Positivkontrolle für eine komplette Zelle töten, um den dynamischen Bereich des Tests zu bestimmen.
- Quick-Spin All assay und zusammengesetzte Platten 100 X g Kondenswasser sammeln. Entfernen Sie die selbstklebende Dichtung aus jeder Platte und legen Sie einen Teller auf ein akustisches Dispenser Setup Hinzufügen von insgesamt 8 nL von jeder Verbindung/Verdünnung repräsentieren eine Endkonzentration von 0,1 % DMSO pro Bohrloch und eine Top Verbindung Dosis von 10 µM.
- Nach der Zugabe der Verbindung abgeschlossen ist, Deckel nach Maß, Edelstahl-Zelle Kultur verhindert Verdunstung auf dem Teller und legen Sie die Platte in eine Spinnerei Inkubator bei 37 ° C für 5 d, mit 5 % CO2 % bis 95 % Relative Luftfeuchtigkeit.
4. Erkennung Reagens Hinzufügung und der Erwerb von Raw-Daten
- Wärmen Sie eine angemessene Lautstärke eine Zelle-Lyse-Reagenz mit Luciferin um Änderungen in Adenin Adenosintriphosphat (ATP) und damit auch Änderungen in der Zellproliferation bei Raumtemperatur oder in einem 37 ° C Wasserbad zu erkennen vor. Fügen Sie insgesamt 3 µL des Reagenz Erkennung in jede Vertiefung mittels einer peristaltischen Pumpe und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für mindestens 15 min.
- Erfassen Sie die Lumineszenz auf einer Platte Luminometer.
5. Datenverarbeitung
- Die raw-Daten aus dem Gerät zu extrahieren und alle Felder mit Testverbindungen auf den Durchschnitt aller Brunnen mit DMSO als neutrale Kontrolle allein zu normalisieren. Berechnen Sie aus diesem Wert die prozentuale Wachstumshemmung von jeder Verbindung. Dies erfolgt über die Formel Funktion in Microsoft Excel wo f (X) = {(probieren Sie relative leichte Werteinheiten (RLUs) / (Mittelwert DMSO RLUs) * 100)}.
- Generieren Sie die Dosis-Wirkungs-Kurven und hemmenden IC50s durch grafische Darstellung der Werte der normalisierten Daten aus Schritt 5.1 gegen die compoundkonzentration mit einem Grafik-Programm.
Hinweis: Wir analysieren die Daten mithilfe von Helios, eine interne NIBR-Software-Werkzeug. Um diese Funktion zu vervollständigen, haben wir das Analysewerkzeug Nichtparametrische Kurve ausgewählt.
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Representative Results
Eine Vielzahl von etablierten Krebszelle, die Linien bekannt, auch unter 2D Kulturbedingungen wachsen mit den beschriebenen Methoden hier getestet wurden. Repräsentative Bilder aus einer Vielzahl von MAPK mutierten Krebs Zell-Linien (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS und KNS-62:HRAS) sind in Abbildung 1zu sehen. Diese Bilder zeigen, dass zwar die Zelllinien verschiedenen Morphologien, jeweils 3D-Strukturen in den Assay 1536-Well-Platten gebildet. Abbildung 2 zeigt, dass kann bei groß angelegten Screenings, differenzielle zusammengesetzte Empfindlichkeit zwischen den Kulturen angebaut in 2D oder in 3D beobachtet werden. Jeder Punkt auf dem Diagramm stellt eine Verbindung hemmende Konzentration besteht eine 50 % Zelle Tötung oder die Verbindung IC50 Reaktion in beiden Einstellungen. Um zu demonstrieren, dass die Wirkung nicht allein durch die verschiedenen Medien vermittelt wird, wurden Calu-6 Zellen kultiviert, in den gleichen Medien mit Gewebe-kultivierte 2D-Plattenelementen oder 3D Scivax Biofilm-Platten, die Anlage zu verhindern. Die erhöhte Empfindlichkeit oder niedriger IC50 für den 3D Wachstum Zustand sieht in ergänzenden Abbildung1 für zwei Verbindungen in den gleichen Medien. Zeilen wie Calu-6 zeigen eine erhöhte Empfindlichkeit zu den Verbindungen, wenn 3D Bedingungen gewachsen, während Linien wie SK-MEL-30 in 3D 2D gegenüber weniger empfindlich sind. Tabelle 1 enthält zusätzliche Hintergrundinformationen über die Zell-Linien, die verwendet wurden in diesem Bildschirm.
Beispiele für repräsentative Dosis-Wirkungs-Kurven sind in Abbildung 3dargestellt. Diese Abbildung zeigt die differentielle Wirksamkeit von zwei Verbindungen, RAF265 (Abbildung 3A) und RAF709 (Abb. 3 b), hemmen die Aktivität der RAF-Kinasen. Beide Verbindungen sind stärker in 3D Bedingungen in Calu-6, die eine nicht-kleinzelligem Lungenkrebs ist Linie beherbergen Q61K, eine aktivierende Mutation des KRAS-Proteins. Zur gleichen Zeit sind beide Verbindungen ähnlich potent in 3D Sphäroide und 2D Kulturen aus der HCT116 Doppelpunkt Krebs Linie, die die G13D-aktivierende Mutation im KRAS enthält. Um nachzuweisen, dass die Wirkung der erhöhten Empfindlichkeit von vermittelt wird der Wachstum Zustand der 3D und 2D und nicht einfach durch die verschiedenen Medien Bedingungen, Calu-6 Zellen wurden angebaut mit FBS unter beiden Bedingungen. Wie in ergänzende Abbildung1, wenn sowohl 2D als auch 3D Bedingungen FBS verwenden, zeigt 3D Culture noch eine erhöhte Empfindlichkeit zu den Verbindungen produzieren eine niedrigere IC50.
Zu guter Letzt erlaubt der 3D Test auch eine Beobachtung des Phänomens der paradoxen Wachstum Aktivierung, die bekanntermaßen auftreten, wenn eine unvollständige Hemmung der RAF-dimeren in stark aktiviertes RAS Mutante Linien und nicht in dem Dimer-unabhängigen Weg Aktivierung in V600E BRAF-Mutationen-11,12gefunden. Diese Aktivierung ist in Abbildung 4sehen bei der Behandlung mit dem BRAF-Inhibitor Dabrafenib 3D Bedingungen im KNS-62, ein HRAS mutiert kleine Lunge Krebs Zelllinie, und auch in der atypischen BRAF mutierten Pankreas Zelle Zeile BxPC-3. Das Wachstum ist in geringen Konzentrationen des Medikaments aktiviert, und das Wachstum ist nur bei hohen Konzentrationen des Medikaments (Abbildung 4 b) unterdrückt. Diese Aktivierung war überraschenderweise nicht in KRAS mutierte Linie Calu-6 gesehen und ist nicht in die V600E BRAF-mutierten Linie A375 erwartet werden. Wir haben eine paradoxe Aktivierung von Calu-6 mit anderen 3D Wachstumsmodelle (Daten nicht gezeigt) beobachtet.
Abbildung 1: Repräsentative Bilder von Krebszellen wachsen in 3D 1536-Well-Platten. Zellen wurden für eine Gesamtmenge von 3-d in 1536-Well-Platten mit einem Reagenz-Dispenser und einer kleinen Kassette vernickelt. Bright-Feld Bilder, erworben auf einem inversen Mikroskop mit einem 4 X Objektiv, zeigen die verschiedenen 3D Morphologien in der MAPK mutierten Zelllinien Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS und KNS-62:HRAS. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: ein Vergleich der 2D versus 3D-Compound Selbstwirksamkeit in Zelllinien Streudiagramm. Sphäroide, die zuvor für 3-d erzeugt wurden, wurden dann mit Verbindungen für eine zusätzliche 5D behandelt, bevor die Verbindung Wirksamkeit festgestellt wurde. Jeder Kreis stellt eine einzigartige Verbindung Antwort. Es wurden Änderungen in der Zellproliferation festgestellt mit lytischen Zelle Verbreitung Reagens und IC50s wurden mit einem vier-Parameter logistische Regressionsanalyse mit der internen Software namens Helios berechnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Dosis-Wirkungs-Kurven Vergleichen 2D versus 3D-Compound Selbstwirksamkeit. Die Dosis-Wirkungs-Kurven zeigen die zusammengesetzte Wirksamkeit im Vergleich zu den Kontrollen DMSO. Die Kurven der KRAS Mutant Calu-6 und HCT116 Zellen mit zwei RAF-Hemmer, RAF265 und RAF709, behandelt werden hier angezeigt als Prozentsatz der Veränderung Zellwachstum (Wachstumshemmung %) im Vergleich zu den DMSO Brunnen zu kontrollieren. Eine Population von Zellen, die unter 2D Bedingungen angebaut wurden, wird in rot angezeigt, und das als 3D Sphäroide gewachsen sind in blau. Die durchgezogenen Linien um die Daten angeben, die 95 %-Konfidenzintervalle für jeden Datensatz. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: bestimmte 3D Kulturen erfassen die Phänomene der paradoxen Wachstum Aktivierung. Die Dosis-Wirkungs-Kurven zeigen die zusammengesetzte Wirksamkeit (Wachstumshemmung %) im Vergleich zu den Kontrollen DMSO. Die Kurven der KRAS-Mutant Calu-6, BRAF V600E Mutant A375, HRAS Mutant KNS-62 und der atypischen BRAF BxPC-3 Mutantenzellen behandelt mit einer paradoxen Aktivator Dabrafenib werden hier angezeigt. Eine Population von Zellen, die unter 2D Bedingungen angebaut wurden, wird in rot angezeigt, und das als 3D Sphäroide gewachsen sind in blau. Die durchgezogenen Linien um die Daten angeben, die 95 %-Konfidenzintervalle für jeden Datensatz. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Abbildung1: Dosis-Wirkungs-Kurven der 2D versus 3D-Compound Selbstwirksamkeit in FBS mit Medien zu vergleichen. Die Dosis-Wirkungs-Kurven zeigen die zusammengesetzte Wirksamkeit im Vergleich zu den Kontrollen DMSO. Die Kurven der KRAS mutierten Calu-6 Zellen mit zwei RAF-Hemmer, RAF265 und RAF709, behandelt werden hier angezeigt als Prozentsatz der Veränderung Zellwachstum (Wachstumshemmung %) im Vergleich zu den DMSO Brunnen zu kontrollieren. Eine Population von Zellen, die unter 2D Bedingungen angebaut wurden, wird in rot angezeigt, und das als 3D Sphäroide gewachsen sind in blau. Beide Bedingungen verwenden FBS-haltigen Medien. Die Fehlerbalken darzustellen Standardabweichungen aus 2 einzelnen Datensätzen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Zellnamen Linie | Abstammung | BRAF | RAS |
| A-375 | Melanom | V600E | WT |
| BxPC-3 | Pankreas | V487-P492 > A | WT |
| Calu6 | Nicht-kleinzelligem Lungenkrebs | WT | KRAS-Q61K |
| HCT-116 | Darmkrebs | WT | KRAS-G13C |
| IPC-298 | Melanom | WT | NRB Q61L |
| KNS-62 | Plattenepithelkarzinom Lunge | WT | HRAS Q61L |
| NCI-H1299 | Lunge | WT | NRB G12D |
| BOWLE-1 | Pankreas | WT | KRAS-G12D |
| SKMEL-30 | Melanom | WT | NRB Q61K |
Tabelle 1: Zell-Linie-Informationen.
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Discussion
Die hier vorgestellten Methoden zeigen ein detailliertes Protokoll wie Tumor Sphäroide in 1536-Well-Platten für groß angelegte Verbindung Vorführungen zu produzieren. Diese Methoden wurden zunächst von der Arbeit am National Cancer Institute wo Tumor Sphäroide in niedrigen Durchsatz Assays in 6-Well und 96-Well Platten Fragen zu genetischen Abhängigkeiten und zusammengesetzte Empfindlichkeit13, angebaut wurden angepasst 14 , 15. eine kritische und einzigartiges Feature dieses Protokolls ist, dass die Sphäroide aus traditionellen 2D Gewebe kultivierten Zellen in 1536-Platten mit definierten gebildet werden Medien als SCM + KO + ITS bezeichnet. Sobald die Zellen in ausgesät werden, werden sie mit atmungsaktiven Haftplatte Dichtungen um die Verdunstung über die Dauer von 3-d-Sphäroid-Bildung zu verhindern versiegelt. Sphäroide können auch für längere Zeit mit diesem Ansatz16kultiviert werden. Nach 3-d Bereich Bildung sind Verbindungen für 5D vor dem Prüfen der Veränderungen im Zellwachstum mit einem lytische basierende Verbreitung Reagenz hinzugefügt. Nach der Normalisierung der Kontroll-Vertiefungen und Berechnung des IC50s zwischen den Zellen kultiviert in 2D vs. 3D, die Veränderungen in der Compound-behandelten Zellen sind gegenüber der Kontrolle-behandelten Zellen.
Seit 1536-Well-Platten sind regelmäßige Gewebe imprägnierte Platten und nicht Hydrogel-beschichtete oder Zelle abweisend Platten, eine Einschränkung dieses Protokolls ist die Verwendung des Mediums definiert, die ein entscheidender Faktor für die erfolgreiche Durchführung dieses Protokolls ist. Der KO-Serum-Ersatz wurde für seine Fähigkeit, erfolgreich in das Wachstum von embryonalen Stammzellen in 3D17 Hilfe zunächst getestet und in diesem Protokoll ist angepasst worden, für das Wachstum von vielen Tumor Sphäroid Linien13,15, 18 , 19. zu beachten ist, dass, obwohl die Medien-Bedingungen für das Wachstum der 2D versus 3D Sphäroide Zellen unterschiedlich sind, wir bereits haben gezeigt, dass die unterschiedlichen Auswirkungen der Droge Empfindlichkeit durch das Wachstum Format vermittelt werden und nicht einfach die Unterschiede in der Medien-Zusammensetzung-9.
Für den Erfolg dieses Protokolls als Schritt zur Problembehandlung, wird vorgeschlagen, dass eine Reihe von Assay Entwicklung Experimenten werden zuerst durchgeführt, um jede Zelllinie vor dem Einschiffen auf einem großen Bildschirm zu optimieren. In diesem Beispiel wurden alle die Zelllinien untersucht zuerst ausgewertet, um festzustellen, ob sie an der gleichen Ausgangspunkt Dichte von 500 Zellen pro Well ausgesät werden konnte. Sie wurden dann mit DMSO nur Platten, Standardabweichungen (SD) und Koeffizienten der Varianz (CVs) für die Dauer der Wachstumsperiode untersuchen geprüft. Auch bei diesem Assay-Entwicklung im Ort bestimmte Linien wuchs schneller als andere, und es wäre vorteilhaft für die Aussaat dichten und die Dauer des Experiments dieser anspruchsvollen Linien weiter zu optimieren. Schließlich, hier präsentierten Daten zeigen, dass es eine Tendenz, eher als ein universelles Phänomen, für bestimmte Zell-Linien wie die NSCLC Linie Calu-6 um eindeutig empfindlicher auf Verbindungen, die Ausrichtung des MAPK Weges in 3D im Vergleich zu denen in 2D gewachsen zu sein. Weitere Experimente sind im Gange, um festzustellen, welche biologische Mechanismen beitragen könnten, um die Regulierung dieser auffälligen Unterschied in der Empfindlichkeit.
Die Fähigkeit, Bildschirm Sphäroide in einem Ultra-HTS-Rahmen ermöglicht 3D Kulturen schon früh in der Arzneimittelforschung eingesetzt werden und kann ermöglicht die Identifizierung der neuartige chemische Angelegenheit, die nur in einer 3D Umgebung aktiv ist. Könnten mit so vielen klinischen Kandidaten den Markt aufgrund mangelnder Wirksamkeit bei Patienten, nie zu erreichen, wenn auch Wachstum Hemmung in Vitro und Regression in Vivodemonstrieren, Teams hinterfragen begonnen haben, ob 3D Umsetzung assays Diese Lücke bereits während der Discovery-Prozess. Es gibt eine Reihe von verschiedene plattenarten an Zellkulturen in 3D Wenn Sie 96-Well oder 384-Well-Methoden verwenden. Hier haben wir 1536-Well-Methoden vorgestellt, die mehrere Brennpunkte der einzelnen Sphäroide produzieren. In Zukunft könnte diese Erkenntnisse mit ähnlichen Bildschirme mit neuen Technologien, die sind in der Entwicklung wie 1536-Well-Platten die Zellen wie hängende Tropfen wachsen könnte oder Platten die sind beschichtet mit Hydrogel/Matrigel und Rundboden sind verglichen werden, die für die Bildung einer Kugel pro Bohrloch erlauben würde. Diese Bedingungen würden zusätzliche Ebenen der Komplexität, die Kulturbedingungen verwendet für das Screening, so dass sie sogar mehr physiologisch relevanten eingeführt und könnte möglicherweise eine erhöhte Rate von Übersetzung aus dem Bank ins Bett für Roman darstellen Therapien. Diese Technologien könnten auch wissenschaftliche Fragen, die eine Hypoxie oder Diffusion Gradienten, die erfordern den Einsatz von größeren Sphäroide.
Die Methoden hier vorgestellten Fokus auf screening diese Sphäroide gegen ein kleines Molekül-Bibliothek von Verbindungen. In Zukunft könnte diese Methoden erweitern, zum Bildschirm für neuartige Biologics und Biotherapeutika wie Bi-spezifische Antikörper oder Antikörper-Wirkstoff-Konjugate, wo 3D Kulturen mehr physiologisch relevanten Antikörperantigen Interaktionen zur Verfügung stellen kann. Darüber hinaus kann die Verwendung von 3D Sphäroide entscheidend für die Entwicklung von krankheitsrelevanten Assays für Verständnis Ziele und Interventionen in der aufstrebenden Immuno-Onkologie Platz21sein.
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Disclosures
Die Autoren sind Mitarbeiter von Novartis, und einige Mitarbeiter sind auch Aktionäre.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Marc Ferrer am National Center für translationale Wissenschaften voran, National Institutes of Health für seine Unterstützung und Führung auf die Erstentwicklung von diesen Tests zu bestätigen. Darüber hinaus möchten wir Alyson Freeman, Mariela Jaskelioff Michael Acker, Jacob Haling und Vesselina Cooke für ihre wissenschaftliche Beiträge und Diskussion als Teammitglieder Projekt danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | ATCC | 30-2006 | Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors. |
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | Lonza | 12-604F | Purchased as a prepared solution. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Lonza | 12-115Q | Purchased as a prepared solution. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Hyclone | SH30042.01 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Purchased as a prepared solution. |
| 10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | Resuspend in sterile water. |
| 20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644 | Resuspend in sterile water. |
| 0.4% Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418 | Resuspend in sterile PBS and filter. |
| 1x Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Gibco | 51500056 | |
| 1% KnockOut (KO) Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | Add fresh right before use. |
| 100% Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7573 | Purchased as a prepared solution. |
| Consumables | |||
| Small Combi Cassette | ThermoFisher | 24073295 | |
| Small Multiflow Cassette | BioTek | 294085 | |
| 1536-well sterile TC plates (white) | Corning | 3727 | |
| 1536-well sterile TC plates (black) | Corning | 3893 | |
| Scivax Plates | MBL International | NCP-LH384-10 | |
| Equipment | |||
| Adhesives seals | ThermoFisher | AB0718 | |
| Spinning Incubator | LiCONiC | ||
| Stainless Steel Lids | The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF) | ||
| ATS Acoustic Dispensor | EDS Biosystems | ||
| Echo Acoustic Dispensor | Labcyte | ||
| Luminometer | Envision-Perkin Elmer | ||
| Peristaltic Pump- Multidrop Combi | ThermoFisher | ||
| Liquid Handler-Multiflow FX | BioTek |
References
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