Summary
Dans un grand éventail d’indications de la maladie, les modèles plus physiologiquement pertinents soient développés et mis en œuvre dans les programmes de recherche. Le nouveau système de modèle décrit ici montre comment tridimensionnelle tumeur sphéroïdes peuvent être cultivées et diffusés dans un système d’axée sur la plaque du haut débit 1536 puits pour chercher de nouveaux médicaments anticancéreux.
Abstract
Les cellules cancéreuses ont systématiquement été cultivés en deux dimensions (2D) sur une surface en plastique. Cette technique, cependant, n’a pas le vrai environnement une tumeur masse affleure à in vivo. Tumeurs solides poussent non pas comme une feuille jointe au plastique, mais plutôt comme un ensemble de cellules clonales dans un en trois dimensions (3D) espace interagissant avec leurs voisins et avec des propriétés spatiales distinctes telles que l’interruption de la polarité cellulaire normale. Ces interactions provoquent des cellules cultivées en 3D à acquérir des caractéristiques morphologiques et cellulaires qui sont plus pertinentes pour les tumeurs in vivo . En outre, une tumeur masse est en contact direct avec les autres types de cellules comme les cellules stromales et immunitaires, ainsi que la matrice extracellulaire de tous les autres types de cellules. La matrice déposée est constituée de macromolécules biologiques, comme le collagène et la fibronectine.
Dans le but d’augmenter la traduction des résultats de la recherche en cancérologie de banc au chevet du patient, de nombreux groupes ont commencé à enquêter sur l’utilisation de systèmes de modèles 3D dans leurs stratégies de développement de médicaments. Ces systèmes sont censés être plus physiologiquement pertinentes car elles tentent de récapituler l’environnement complexe et hétérogène d’une tumeur. Ces systèmes, cependant, peuvent être assez complexes, et, bien que favorable à la croissance de formats de 96 puits et d’autres maintenant même en 384, ils offrent peu de choix pour la croissance à grande échelle et de dépistage. Cette observée écart a conduit à l’élaboration des méthodes décrites ici en détail de sphéroïdes de tumeur de la culture dans une capacité de haut débit en plaques 1536 puits. Ces méthodes représentent un compromis aux systèmes de matrice-basé très complexes, difficiles à l’écran et des essais 2D classiques. Une variété de lignées de cellules cancéreuses hébergeant des mutations génétiques différentes sont retenus et menée, en examinant l’efficacité composée en utilisant une bibliothèque organisée des composés ciblant la voie Mitogen-Activated protéine Kinase ou MAPK. Les réponses de culture sphéroïde sont ensuite comparées à la réponse des cellules cultivées en 2D, et activités différentielles sont signalées. Ces méthodes fournissent un protocole unique pour tester l’activité composée dans un cadre 3D haut débit.
Introduction
Au cours de la dernière décennie, de plus en plus des études ont mis en place l’utilisation de modèles de culture de cellules 3D de comprendre les concepts qui ne sont pas entièrement récapitulées en cultivant des cellules en 2D sur plastique. Exemples de ces concepts incluent les alternances dans les cellules épithéliales normales polarité1 où l’orientation spatiale de couches basales et apicales des cellules sont perdus, ainsi que le rôle de la matrice extracellulaire dans la régulation de la survie et le sort de la cellule. Recherche en oncologie, en particulier, utilise des modèles 3D pour comprendre la biologie fondamentale des cellules cancéreuses et les différences entre 2D et 3D cell culture systèmes3,4. Le développement des techniques de culture cellulaire plus sophistiqués et leur adaptation supplémentaire aux formats multipuits a permis à la recherche de nouveaux médicaments dans paramètres 3D. Contrairement aux cellules cultivées dans des conditions 2D, des modèles 3D de la gamme de tumeurs dans la complexité de systèmes cellulaires en couches5 de type single-cell sphères de différentes tailles, complexe multi-cell-type sphères6,7, 8. la découverte de nouveaux composés ou un agent biologique qui puissamment induire la mort cellulaire dans ces systèmes de modèle 3D est, par conséquent, d’un grand intérêt dans les campagnes de développement de médicaments. Points de terminaison de ces tests sont souvent identiques à celles exercées dans les cultures 2D pour évaluer les changements dans la prolifération cellulaire, mais lorsque menées dans un cadre plus physiologiquement pertinent, ils peuvent révéler le véritable niveau de dépendance du gène cible ou en voie interrogé.
Tel que présenté ci-dessus, une variété de systèmes modèles ont été développés pour étudier les réponses de drogue dans des systèmes de culture 3D, mais la plupart utilise deux microplaques 96 ou 384 puits et n’est pas facilement adaptable aux formats haut débit (HTS) de dépistage souvent utilisés dans les campagnes de dépistage de découverte de médicaments. Ces systèmes comprennent l’utilisation d’accrocher technologies gouttelette, cultures de sphéroïde, pulsant de cellules avec des particules magnétiques pour induire la lévitation et les cultures, incorporant des gels naturels ou synthétiques comme le collagène, Matrigel ou polyéthylène glycol (PEG)2 . Nous présentons ici les méthodes détaillées d’une technique déjà développée pour produire des cultures de sphéroïde 3D provenant de lignées cellulaires établies du cancer dans un format de plaque 1536 puits. Dans le présent protocole, un milieu très défini est utilisé qui empêche la fixation des lignées de cellules adhérentes normalement9. Ce système a des limites (par exemple, il ne peut pas récapituler complètement un système complexe modèle de cancer), mais néanmoins, ces tests permettent un criblage à haut débit de grandes collections de petites molécules et des comparaisons en travers de la réaction aux médicaments entre 2D et 3D des cultures contre une variété de lignées cellulaires et composés.
Les lignées de cellules sélectionnées afin de démontrer les méthodes dans cet article toutes les mutations dans les gènes associés à la signalisation de voie, une voie qui est hautement dysrégulation dans le cancer, MAPK harbor et pour les thérapies dont beaucoup sont disponibles. Beaucoup de lignes ont activation d’oncogènes mutations du virus Kirsten Rat Sarcoma, également dénommé KRAS, le RAS de neuroblastome ou ARN, l’oncogène virus de sarcome de Rat Harvey ou HRAS et les kinases associées rapidement accéléré fibrosarcomes, également connu sous le nom Fra. La littérature récente suggère que les inhibiteurs des différents nœuds de cette voie sont particulièrement bien plus efficaces pour un sous-ensemble des lignées cellulaires lorsqu’il est cultivé sous des conditions 3D9,10. Une étude a révélé que lorsque les cellules cancéreuses avec RAS active ont été cultivées en 3D, ils ont démontré une sensibilité accrue aux inhibiteurs de la MAPK et en outre, que cette approche pourrait identifier les voies et ciblé des inhibiteurs qui pourraient manquer dans le 2D traditionnelle réglage. L’objectif de cette étude est de présenter les méthodes utilisées pour la culture de ces lignées cellulaires, et plus, pour démontrer la différence de réponses à ces inhibiteurs que l'on peut observer seulement en utilisant 3D cell systèmes de culture.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mise en culture des sphéroïdes tumeur 1536 puits 3D
- Préparer une tige moyenne frais 3D tumeur sphéroïde (milieu cellulaire + remplacement de sérum knockout + insuline-transferrine-sélénium) en ajoutant les réactifs suivants dans 500 mL de milieu d’Eagles modifié de Dulbecco (DMEM/F12) : 1 x pénicilline/streptomycine, 10 ng/mL de l’homme facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF), 20 ng/mL d’humain facteur croissance épidermique (EGF), 0,4 % d’albumine sérique bovine (BSA) (Fraction V), 1 x insuline-transferrine-sélénium et le remplacement de sérum 1 % knockout (KO) (ne pas de gel-dégel).
- Filtre-stériliser le milieu ensemble avec les suppléments grâce à un système de filtre bouteille-top 0,4 µm.
- Détacher les lignées de cellules cancéreuses, qui ont augmenté selon des conditions de culture courante recommandée, des flacons de culture cellulaire traditionnelle en les lavant 3 x avec phosphate 1 x tampon salin (PBS) et en ajoutant une quantité appropriée de 0,25 % de trypsine (1 mL par 5 cm2) pendant 5 min créer une fine couche sur les cellules. Neutraliser la trypsine avec 5 fois le montant du milieu contenant du sérum et continuer à compter les cellules non vides. Par exemple, utilisez 25 mL de milieu pour 5 mL de la trypsine.
- Ajuster la concentration de la solution de la cellule à 62,5 x 104 cellules/mL pour un total de 500 cellules / puits dans 8 µL de milieu de sphéroïde de graines dans les plaques 1536 puits de tissu-culture-traitée.
- Dans une armoire de sécurité biologique, les cellules à l’aide d’une cassette en acier inoxydable-pointe stérilisée, petite avec un système de pompe péristaltique dotés de graines. Entre différentes lignées cellulaires, rincer la tubulure de la cassette avec 1 x PBS et 70 % éthanol pendant 10 s.
- Par ailleurs, les semences les cellules à l’aide d’un gestionnaire liquid situé à l’intérieur d’une pièce de filtre HEPA en utilisant soit une cassette en acier inoxydable-pointe stérilisée, petite et une pompe péristaltique ou une pompe à seringue jointe, selon le nombre de plaques par une lignée de cellules nécessaires.
- Sceller les plaques en utilisant un joint de plaque adhésive respirante soit manuellement ou à l’aide d’un adhésif.
- Placer les plaques dans un incubateur à rotation fixée à 10 tr/min et 37 ° C, avec 5 % de dioxyde de carbone (CO2) et 95 % d’humidité relative. Laissez les sphéroïdes à se former pendant 3 jours.
2. mise en culture de lignées cancéreuses 1536 puits 2D
NOTE : Les lignes de cancer 2D 1536 puits doivent être cultivées 24h avant l’ajout du composé aux plaques 3D.
- Préparer un support de cellule de cancer 2D en ajoutant les réactifs suivants à 500 mL d’un milieu de culture approprié pour les lignes sélectionnées : 1 x sérum bovin fœtal (SVF) pénicilline/streptomycine et 10 %.
- Filtre-stériliser le milieu ensemble avec les suppléments grâce à un système de filtre bouteille-top 0,4 µm.
- Détacher les lignées de cellules cancéreuses, qui ont augmenté selon des conditions de culture courante recommandée, des flacons de culture cellulaire traditionnelle en les lavant 3 x avec 1 x PBS et en ajoutant une quantité appropriée de 0,25 % de trypsine (1 mL par 5 cm2) pendant 5 min à créer une couche mince sur les cellules. Neutraliser la trypsine avec 5 fois le montant du milieu contenant du sérum et continuer à compter les cellules non vides. Par exemple, utilisez 25 mL de milieu pour 5 mL de la trypsine.
- Ajuster la concentration de la solution de la cellule à 62,5 x 104 cellules/mL pour un total de 500 cellules / puits dans 8 µL de milieu complet de graines dans les plaques 1536 puits tissu-culture-traitées.
- Dans une armoire de sécurité biologique, les cellules à l’aide d’une cassette en acier inoxydable-pointe stérilisée, petite avec un système de pompe péristaltique dotés de graines. Entre les différentes lignées cellulaires, rincer la tubulure de la cassette avec 1 x PBS stérile et de 70 % éthanol pendant 10 s.
- Par ailleurs, amorcer les cellules à l’aide d’un gestionnaire liquid situé à l’intérieur d’une pièce de filtre HEPA robotique utilisant une cassette en acier inoxydable-pointe stérilisée, petite et une pompe péristaltique ou le pousse-seringue jointe, selon le volume des plaques par cellule ligne nécessaire.
- Sceller les plaques en utilisant un joint de plaque adhésive respirante soit manuellement ou à l’aide d’un adhésif.
- Placer les plaques dans un incubateur à rotation fixée à 10 tr/min et 37 ° C pendant 24 h avant l’addition de composé, avec 5 % CO2 et 95 % d’humidité relative.
3. composé d’Addition
- Préparer des dilutions de 8 points, 3 fois la série des inhibiteurs de la MAPK à 100 % le diméthylsulfoxyde (DMSO) sur un robot de gestion liquide avec une concentration supérieure de 10 mM. L’inhibiteur du protéasome bortézomib est utilisé comme témoin positif pour une cellule complète tuant pour déterminer la plage dynamique du dosage.
- Rapide-spin tout dosage plaques et composé à 100 g pour recueillir toute condensation. Retirer le joint adhésif de chaque plaque et placer une plaque sur une installation de distributeur acoustique pour ajouter un total de 8 nL de chaque composé/dilution, ce qui représente une concentration finale de 0,1 % DMSO / puits et une dose supérieure composée de 10 µM.
- Après que l’ajout du composé est terminée, placer un couvercle de culture cellulaire sur mesure, en acier inoxydable qui empêche l’évaporation sur la plaque et place la plaque dans un incubateur de filature à 37 ° C pendant 5 jours, avec 5 % CO2 et 95 % d’humidité relative.
4. Ajout de réactif détection et l’acquisition des données brutes
- Préchauffer un volume suffisant d’un réactif de lyse cellulaire contenant la luciférine pour détecter les variations triphosphate de l’adénine (ATP) et, par conséquent, la prolifération des cellules à température ambiante ou dans un bain-marie à 37 ° C. Ajouter un total de 3 µL de réactif de détection à chaque puits à l’aide d’une pompe péristaltique et incuber la plaque à température ambiante pendant au moins 15 min.
- Capturer la luminescence sur un luminomètre plaque.
5. traitement des données
- Extraire les données brutes de l’instrument et normaliser tous les champs contenant des composés d’essai à la moyenne de tous les puits contenant DMSO seul comme le contrôle neutre. Calculer à partir de cette valeur, l’inhibition de la croissance pour cent de chaque composé. C’est terminé à l’aide de la formule fonction dans Microsoft Excel où f (x) = {(échantillon valeur relative unités légères (RLUs) / (valeur de DMSO RLUs en moyenne) * 100)}.
- Générer les courbes dose-réponse et l’inhibiteur IC50s en traçant la courbe des valeurs des données normalisées de l’étape 5.1 contre la concentration de composés à l’aide d’un programme graphique.
NOTE : Nous avons analysé les données à l’aide de Helios, un outil de logiciel NIBR interne. Pour compléter cette fonction, nous avons sélectionné l’outil d’analyse de courbe non-paramétrique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Une variété de cellule de cancer établis lignées qui poussent bien dans des conditions de culture 2D ont été testées en utilisant les méthodes décrites ici. Des images représentatives d’une variété de cancer mutant MAPK lignées cellulaires (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS et KNS-62:HRAS) sont visibles dans la Figure 1. Ces images montrent que bien que les lignées cellulaires ont des morphologies différentes, chacun formé des structures 3D des plaques 1536 puits assay. La figure 2 montre que, lorsqu’il est utilisé pour le dépistage à grande échelle, différence de sensibilité composé entre cultures en 2D par rapport à ceux en 3D peut être observé. Chaque point sur le graphique représente la concentration inhibitrice du un composé où il y a une mise à mort cellulaire de 50 % ou réponse IC50 du composé dans les deux contextes. Afin de démontrer que l’effet n’est pas véhiculé uniquement par les différents médias, Calu-6 cellules ont été cultivés dans le même média à l’aide de plaques de tissu-cultivées 2D ou 3D plaques de biofilm Scivax qui empêchent la fixation. La sensibilité accrue ou CI50 inférieur pour la condition de croissance 3D est vu dans la Figure 1 pour deux composés dans le même support. Lignes comme Calu-6 montrent une sensibilité accrue aux composés lorsqu’il est cultivé dans des conditions 3D, tandis que les lignes comme SK-MEL-30 sont moins sensibles en 3D par rapport à la 2D. Tableau 1 comprend des informations générales supplémentaires sur toutes les lignées de cellules qui ont été utilisés dans cet écran.
Exemples de courbes dose-réponse représentatifs sont visualisées à la Figure 3. Ce chiffre démontre l’efficacité différentielle de deux composés, RAF265 (Figure 3 a) et RAF709 (Figure 3 b), qui inhibent l’activité des kinases de la RAF. Les deux composés sont plus puissants en 3D des conditions Calu-6, qui est un cancer du poumon non à petites cellules ligne renfermant Q61K, une mutation activatrice de la protéine KRAS. Dans le même temps, les deux composés sont de même puissants chez les sphéroïdes 3D et 2D cultures depuis la ligne de cancer du côlon HCT116, qui contient la mutation G13D activation de KRAS. Pour démontrer que l’effet de l’augmentation de la sensibilité est médié par la condition de croissance de 3D contre 2D et pas simplement par les conditions de différents médias, Calu-6 cellules ont été cultivés à l’aide de FBS dans les deux conditions. Comme on le voit dans la Figure 1, lorsque les conditions en 2D ou en 3D utilisent FBS, la culture 3D montre toujours une sensibilité accrue aux composés produisant une IC50 inférieur.
Enfin, l’analyse 3D a également permis une observation du phénomène d’activation paradoxale de la croissance, qui est connu pour se produire quand il y a une inhibition incomplète des dimères de RAF dans fortement activées lignées mutantes de RAS et non dans la voie indépendante de dimère activation dans BRAF V600E mutations11,12. Cette activation est illustrée à la Figure 4, par traitement avec l’inhibiteur BRAF Dabrafenib conditions 3D en KNS-62, un petit muté HRAS lignée de cancer de poumon de cellules et aussi dans la cellule pancréatique mutante BRAF atypique ligne BxPC-3. La croissance est activée à faible concentration de la drogue, et la croissance est réprimée seulement à des concentrations élevées de la drogue (Figure 4 b). Cette activation a été étonnamment pas vu dans la lignée mutante KRAS Calu-6 et n’est ne pas à prévoir dans la lignée mutante BRAF V600E A375 Office. Nous avons observé une activation paradoxale de la Calu-6 à l’aide d’autres modèles de croissance 3D (données non présentées).
Figure 1 : les images représentant des cellules cancéreuses en 3D plaques 1536 puits. Les cellules ont été cultivées pour un total de 3 d en plaques 1536 puits à l’aide d’un distributeur de réactif et une petite cassette. Bright-champ images, acquises sur un microscope inversé en utilisant une lentille X 4, démontrent les différentes morphologies 3D dans les lignées de cellules mutantes de MAPK Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS et KNS-62:HRAS. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : un nuage de points comparant la 2D - versus le 3D-composé efficacité dans des lignées cellulaires. Sphéroïdes, qui ont été précédemment générés pendant 3 jours, étaient alors traités avec des composés pour un 5D supplémentaire avant l’efficacité du composé a été déterminée. Chaque cercle représente une réponse unique composée. Changements dans la prolifération cellulaire ont été détectés à l’aide d’un réactif de prolifération cellulaire lytique et IC50s ont été calculés à l’aide d’une analyse de régression logistique de quatre paramètres avec le logiciel interne appelé Helios. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : courbes Dose-réponse comparant 2D et 3D-composé auto-efficacité. Les courbes dose-réponse démontrent l’efficacité composée par rapport aux contrôles du DMSO. Les courbes du mutant KRAS Calu-6 et les cellules HCT116 traitées avec deux inhibiteurs de la RAF, RAF265 et RAF709, sont affichés ici en pourcentage à la variation de la croissance cellulaire (inhibition de la croissance %) par rapport au DMSO contrôler le puits. Une population de cellules qui ont été cultivées dans des conditions 2D apparaît en rouge, et ceux qui sont cultivés comme des sphéroïdes 3D sont en bleu. Les lignes pleines autour les données indiquent les intervalles de confiance de 95 % pour chaque ensemble de données. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : certaines cultures 3D capturent les phénomènes d’activation de la croissance paradoxale. Les courbes dose-réponse démontrent l’efficacité du composé (inhibition de la croissance %) par rapport aux contrôles du DMSO. Les courbes de la mutant KRAS Calu-6, BRAF V600E mutant A375 Office, HRAS mutant KNS-62 et l’atypique BRAF mutant BxPC-3 cellules traitées avec un activateur paradoxal Dabrafenib sont affichés ici. Une population de cellules qui ont été cultivées dans des conditions 2D apparaît en rouge, et ceux qui sont cultivés comme des sphéroïdes 3D sont en bleu. Les lignes pleines autour les données indiquent les intervalles de confiance de 95 % pour chaque ensemble de données. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire Figure 1 : courbes Dose-réponse comparant la 2D - versus le 3D-composé efficacité dans FBS contenant des médias. Les courbes dose-réponse démontrent l’efficacité composée par rapport aux contrôles du DMSO. Les courbes des KRAS mutant Calu-6 les cellules traitées avec deux inhibiteurs de la RAF, RAF265 et RAF709, sont affichés ici en pourcentage à la variation de la croissance cellulaire (inhibition de la croissance %) par rapport au DMSO contrôler le puits. Une population de cellules qui ont été cultivées dans des conditions 2D apparaît en rouge, et ceux qui sont cultivés comme des sphéroïdes 3D sont en bleu. Les deux conditions utilisation milieux contenant du FBS. Les barres d’erreur représentent les écarts de 2 ensembles de données individuelles. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Nom de ligne de cellule | Lignée | BRAF | RAS |
| A-375 | Mélanome malin | V600E | WT |
| BxPC-3 | Pancréatique | V487-P492 > A | WT |
| Calu6 | Cancer du poumon non à petites cellules | WT | KRAS Q61K |
| HCT 116 | Colorectal | WT | KRAS G13C |
| IPC-298 | Mélanome malin | WT | ARN Q61L |
| KNS-62 | Carcinome pulmonaire | WT | HRAS Q61L |
| NCI-H1299 | Poumon | WT | ARN G12D |
| PANC-1 | Pancréatique | WT | KRAS G12D |
| SKMEL-30 | Mélanome malin | WT | ARN Q61K |
Tableau 1 : Renseignements sur ligne cellulaire.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les méthodes présentées ici montrent un protocole détaillé sur la façon de produire des sphéroïdes de tumeur en plaques 1536 puits pour projections composées à grande échelle. Ces méthodes ont été initialement adaptés au travail à l’Institut National du Cancer où sphéroïdes de tumeur ont été cultivées dans des essais de faible débit dans des plaques 6 puits et 96 puits à poser des questions sur la génétiques dépendances et sensibilité composé13, 14 , 15. une caractéristique unique et critique du présent protocole est que les sphéroïdes sont formés de cellules de tissu-cultivées 2D traditionnelles en 1536-plaques en utilisant défini médias dénommés SCM + KO + STI. Une fois que les cellules sont ensemencées en, ils sont scellés avec des joints de plaque adhésive respirante pour éviter toute évaporation pendant toute la durée de la formation de sphéroïde 3 d. Sphéroïdes peuvent aussi être cultivées pour longues périodes de temps en utilisant cette approche16. Après 3 jours de formation sphère, composés sont ajoutés pendant 5 jours avant l’analyse les changements dans la croissance avec un réactif lytique basée sur la prolifération cellulaire. Après normalisation pour les puits de contrôle et le calcul des IC50s entre les cellules cultivées en 2D vs 3D, les changements dans les cellules traitées composé sont comparés aux cellules témoins traités.
Depuis le puits de 1536 plaques sont des plaques de tissus traités régulières et plaques non hydrogel-revêtus ou cellule-produit répulsif, une limitation de ce protocole est l’utilisation du milieu défini, qui est un facteur essentiel à la bonne exécution du présent protocole. Le remplacement de sérum KO a été initialement testé pour sa capacité de contribuer avec succès dans la croissance des cellules souches embryonnaires en 3D17 et dans le présent protocole a été adapté pour la croissance de nombreuses tumeurs sphéroïde lignes13,15, 18 , 19. à noter est que, même si les conditions du milieu sont différentes pour la croissance de la 2D des cellules par rapport à la 3D sphéroïdes, nous avons déjà démontré que les effets différentiels de sensibilité aux médicaments sont médiés par le format de croissance et pas simplement les différences de composition de médias9.
Pour assurer le succès de ce protocole, comme une étape de dépannage, il est suggéré qu’une série d’expériences de développement de test sont tout d’abord réalisé pour optimiser chaque lignée cellulaire avant de se lancer sur un écran à grande échelle. Dans cet exemple, toutes les lignées de cellules analysées ont été tout d’abord évalués afin de déterminer si elles pourraient être injectées à la même densité de départ de 500 cellules par puits. Puis, ils ont été dosés avec des plaques de DMSO uniquement d’examiner les déviations standard (SD) et les coefficients de variation (CV) pour la durée de la période de croissance. Même avec cette évolution de dosage en place, certaines lignes ont augmenté plus rapidement que d’autres, et il aurait été utile optimiser les densités de semis et de la durée de l’expérience de ces lignes de plus en plus difficiles. Enfin, les données présentées ici montrent qu’il existe une tendance, plutôt que d’un phénomène universel, pour certaines lignées cellulaires comme le NSCLC ligne Calu-6 pour être particulièrement bien plus sensibles aux composés ciblant la voie de MAPK en 3D par rapport à celles cultivées en 2D. D’autres expériences sont en cours pour déterminer quels mécanismes biologiques pourraient contribuer à réguler cette différence frappante de sensibilité.
La capacité de sphéroïdes écran dans un décor ultra-HTS permet des cultures 3D à utiliser très tôt dans le processus de découverte de médicaments et peut permettre d’identifier de nouveaux matière chimique qui n’est active que dans un environnement 3D. Avec tant de candidats cliniques jamais atteindre le marché en raison d’un manque d’efficacité chez les patients, bien que démontrant la croissance inhibition in vitro et régression en vivo, équipes ont commencé à interroger si les essais de mise en œuvre de la 3D pourrait combler cette lacune plus tôt pendant le processus de découverte. Il existe plusieurs types de plaques différentes aux cellules de culture en 3D lors de l’utilisation de méthodes de 96 puits ou 384 puits. Ici, nous avons présenté les méthodes 1536 puits produisant de multiples foyers de sphéroïdes individuels. À l’avenir, ces résultats pouvaient être comparés aux écrans similaires à l’aide de nouvelles technologies qui sont en cours d’élaboration tels que plaques 1536 puits qui pourraient croître des cellules comme suspendus gouttes ou plaques qui sont recouvertes d’hydrogel/Matrigel et qui sont à fond rond, qui permettrait la formation d’une sphère par puits. Ces conditions introduiraient des couches supplémentaires de complexité pour les conditions de culture utilisés pour le dépistage, ce qui les rend encore plus physiologiquement pertinents et pourraient représenter un taux accru de traduction de banc au chevet roman thérapies. Ces technologies permettrait aussi aux questions scientifiques faisant intervenir des gradients hypoxie ou de diffusion, qui nécessitent l’utilisation de plus gros sphéroïdes.
Les méthodes présentées ici mettre l’accent sur le dépistage de ces sphéroïdes contre une banque de petites molécules de composés. Ces méthodes pourraient s’étendre à l’avenir, pour dépister les nouveaux produits biologiques et biothérapeutiques tels que des anticorps spécifiques bi ou conjugués anticorps-médicament, où les cultures 3D peuvent fournir les interactions anticorps-antigène plus physiologiquement pertinents. En outre, l’utilisation des sphéroïdes 3D peut être essentielle pour développer la maladie les dosages pour des objectifs de compréhension et d’interventions dans les émergents immuno-oncologie espace21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs sont des employés de Novartis, et certains employés sont également actionnaires.
Acknowledgments
Les auteurs aimerait Marc Ferrer au Centre National pour faire progresser les Sciences translationnelle, National Institutes of Health pour son soutien et ses conseils sur le développement initial de ces tests. En outre, nous tenons à remercier Alyson Freeman, Mariela Jaskelioff, Michael Acker, Jacob Haling et Vesselina Cooke pour leur apport scientifique et de la discussion que les membres de l’équipe du projet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | ATCC | 30-2006 | Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors. |
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | Lonza | 12-604F | Purchased as a prepared solution. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Lonza | 12-115Q | Purchased as a prepared solution. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Hyclone | SH30042.01 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Purchased as a prepared solution. |
| 10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | Resuspend in sterile water. |
| 20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644 | Resuspend in sterile water. |
| 0.4% Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418 | Resuspend in sterile PBS and filter. |
| 1x Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Gibco | 51500056 | |
| 1% KnockOut (KO) Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | Add fresh right before use. |
| 100% Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7573 | Purchased as a prepared solution. |
| Consumables | |||
| Small Combi Cassette | ThermoFisher | 24073295 | |
| Small Multiflow Cassette | BioTek | 294085 | |
| 1536-well sterile TC plates (white) | Corning | 3727 | |
| 1536-well sterile TC plates (black) | Corning | 3893 | |
| Scivax Plates | MBL International | NCP-LH384-10 | |
| Equipment | |||
| Adhesives seals | ThermoFisher | AB0718 | |
| Spinning Incubator | LiCONiC | ||
| Stainless Steel Lids | The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF) | ||
| ATS Acoustic Dispensor | EDS Biosystems | ||
| Echo Acoustic Dispensor | Labcyte | ||
| Luminometer | Envision-Perkin Elmer | ||
| Peristaltic Pump- Multidrop Combi | ThermoFisher | ||
| Liquid Handler-Multiflow FX | BioTek |
References
- Lee, M., Vasioukhin, V. Cell polarity and cancer--cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor. Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69, 42-51 (2014).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 332 (3), 821-828 (2010).
- Li, L., Lu, Y. Optimizing a 3D Culture System to Study the Interaction between Epithelial Breast Cancer and Its Surrounding Fibroblasts. Journal of Cancer. 2, 458-466 (2011).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. 3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies. Journal of Cell Communication and Signaling. 5 (3), 239-248 (2011).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
- Mathews Griner, L. A., et al. Large-scale pharmacological profiling of 3D tumor models of cancer cells. Cell Death & Disease. 7 (12), e2492 (2016).
- Polo, M. L., et al. Responsiveness to PI3K and MEK inhibitors in breast cancer. Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice. PLoS One. 5 (5), e10786 (2010).
- Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
- Bhargava, A., et al. Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Elife. 5, e09976 (2016).
- Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells. Molecular Cancer. 9, 267 (2010).
- Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer. Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).
- Mathews, L. A., et al. Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells. Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).
- Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
- Sun, L., et al. Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells. Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).
- Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
- Mathews Griner, L. A., et al. High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).
- Herter, S., et al. A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).
