Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van echografie-geleide injectie van neuroblastoom (NB) en de Ewing sarcoom (ES) cellen (gevestigde cellijnen en patiënt afkomstige tumorcellen) op biologisch relevante sites maken van betrouwbare preklinische modellen voor kanker onderzoek.
Preklinische testen van antikanker therapieën, is afhankelijk van relevante xenograft modellen die de aangeboren tendensen van kanker na te bootsen. Voordelen van standaard subcutane flank modellen zijn procedurele gemak en de mogelijkheid om monitor tumor progressie en reactie zonder invasieve imaging. Dergelijke modellen zijn vaak inconsistent in translationeel klinische proeven en hebben beperkte biologisch relevante kenmerken met lage neiging tot metastase, want er een gebrek aan een eigen communicatie is. Ter vergelijking: orthotopic xenograft modellen op sites van de oorspronkelijke tumor is gebleken nabootsen van de communicatie van de tumor en repliceren belangrijk ziektekenmerken zoals verre metastatische verspreiding. Deze modellen vereisen vaak vervelend chirurgische ingrepen met langdurig verdoving tijd en herstel. Om aan te pakken dit, hebben kanker onderzoekers onlangs gebruikt echografie-geleide injectie technieken om kanker xenograft modellen voor preklinische experimenten, die zorgt voor snelle en betrouwbare inrichting van weefsel geleide lymfkliertest modellen. Echografie visualisatie biedt ook een noninvasive methode voor het longitudinale beoordeling van tumor engraftment en groei. Hier beschrijven we de methode voor echografie-geleide injectie van kankercellen, gebruik makend van de bijnier voor NB en renale sub capsule voor ES. Deze minimaal invasieve benadering overwint vervelend open chirurgie implantatie van kankercellen in weefsel-specifieke locaties voor groei en metastase en voorbij morbide herstel periodes. We beschrijven het gebruik van zowel bestaande cellijnen als patiënt afgeleide cellijnen voor orthotopic injectie. Pre-en-klare commerciële kits zijn beschikbaar voor tumor dissociatie en luciferase tagging van cellen. Injectie van celsuspensie met behulp van beeld-begeleiding biedt een minimaal invasieve en reproduceerbare platform voor het maken van preklinische modellen. Deze methode wordt gebruikt om te maken van betrouwbare preklinische modellen voor andere vormen van kanker zoals lever, blaas en alvleesklier voorbeeldig voor haar onbenut potentieel voor talrijke kanker modellen.
Dierlijke xenograft modellen zijn essentiële instrumenten voor preklinische studies van nieuwe antikanker therapieën. Standaard lymfkliertest xenografts is afhankelijk van subcutane flank innesteling van cellen, een efficiënt en gemakkelijk toegankelijke site voorziet in toezicht op de tumorgroei. Het nadeel van subcutane modellen is hun gebrek aan tumor-specifieke biologische kenmerken, die hun potentieel beperken kunnen voor het metastaseren1. Dergelijke beperkingen zijn overwonnen door het gebruik van orthotopic xenografts in welke tumor cellen worden geaccepteerd op inheemse weefsel sites, gemetastaseerde potentieel2voorzien van een relevante communicatie. Orthotopic xenograft modellen originele biologische kenmerken behouden en betrouwbare modellen voorzien preklinische drug discovery3,4. De kankercellen gebruikt voor weefsel-geleide innesteling zijn bestaande cellijnen of patiënt-afgeleide cellen van de patiënt tumoren. Xenografts vastgesteld van kanker cellijnen kunnen hoge genetische afwijking van de primaire tumor ten opzichte van patiënten afgeleide xenografts5vertonen. Gezien dit, de oprichting van patiënt-afgeleide orthotopic xenografts de voorkeur standaard geworden voor het testen van nieuwe therapeutics in kanker drugontdekking.
In de pediatrische kanker neuroblastoom (NB), orthotopic xenograft modellen recapituleren primaire tumor biologie en metastase naar typische sites van NB verspreid6,7te ontwikkelen. NB ontwikkelt in de bijnier of langs de sympathieke keten van paravertebral. De meest voorkomende methoden van orthotopic implantatie vereisen open trans-abdominale chirurgische procedures. Deze methoden zijn vaak saai, hebben hoge dierlijke morbiditeit en complexe herstel periodes. Hoge resolutie echografie is onlangs gebruikt voor weefsel-geleide implantatie van tumorcellen in de ontwikkeling van verschillende lymfkliertest modellen voor kanker onderzoek8,9. De techniek is betrouwbare, reproduceerbare, efficiënt en veilig voor de vaststelling van relevante uitgezaaide tumor xenografts10,11.
De oprichting van pediatrische kanker xenografts door echografie-geleide doel orgel lokalisatie en naald implantatie van cellijnen en patiënt afkomstige tumorcellen is aangetoond dat11. De techniek werd gebruikt voor NB gericht op de lymfkliertest bijnier. Het Ewing sarcoom (ES) is voornamelijk een ossaal kanker, vaak gezien in de lange beenderen zoals dijbeen en het bekken beenderen12. Aanvraagrapporten hebben aangetoond dat om te bepalen of de groei van een overwegend werden kanker haalbaar in renal weefsel is, een renale sub kapselvorming locatie werd gekozen voor orthotopic implantatie13. Renale sub kapselvorming cel innesteling van tumorcellen is gebruikt als een veelbelovende model te bestuderen van spontane metastasen voor ES14.
Echografie-geleide innesteling van cellen NB en ES is een efficiënte en veilige methode om betrouwbare lymfkliertest xenografts voor preklinische studies in de Kankerbiologie. Cruciaal voor het succes van echografie-geleide weefsel-gerichte innesteling is de aanwezigheid en beschikbaarheid van geschoold personeel met deskundigheid in het anatomisch lokaliseren van het orgel van belang en stereotactische injectie van tumorcellen.
De dissociatie van tumor weefsel bleek te zijn een cruciale stap…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk kreeg steun van het Robert Wood Johnson Foundation/Amos medische faculteit ontwikkeling programma, Taubman Research Institute, en de sectie Pediatrische Heelkunde, The University of Michigan. De auteurs willen Kimber Converso-Baran en Dr. Marcus Jarboe bedanken voor de hulp met echografie injectie procedures en het imaging platform. We bedanken Paul Trombley voor zijn hulp met afbeeldingen van de figuur. Wij danken ook de afdeling Radiologie op de Universiteit van Michigan voor het gebruik van het Center for Molecular Imaging en de Tumor Imaging Core, die gedeeltelijk worden ondersteund door uitgebreide kanker centrum NIH, verlenen P30 CA046592. De Universiteit van Michigan fysiologie fenotypering Core die gedeeltelijk door de subsidiefinanciering uit het NIH (OD016502) en het Frankel cardiovasculair centrum wordt ondersteund. Cel lijn verificatie werd gedaan bij IDEXX RADIL Bioresearch faciliteiten, Columbia, MO. Wij danken Tammy Stoll, Dr. Rajen Mody en de Mott stevig Tumor oncologie-programma. Onze patiënten en families zijn dankbaar erkend voor hun inspiratie, moed en continue ondersteuning van ons onderzoek.
Mice | |||
NOD-SCID | Charles River | 394 | |
NSG | The Jackson Laboratory | 5557 | |
Cell Line | |||
NB | |||
IMR-32 | ATCC | CCL-127 | Established human neuroblastoma cell line |
SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | Established human neuroblastoma cell line |
SK-N-Be2 | ATCC | CRL-2271 | Established human neuroblastoma cell line |
ES | |||
TC32 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
A673 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
CHLA-25 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
A4573 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
Cell Line media | |||
RPMI | Life Technologies | 11875-093 | |
Matrigel | BD BioSciences | 354234 | |
Dissociation | |||
Dissection Tools | KentScientific | INSMOUSEKIT | |
Human Tumor Dissociation Kit | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
Cell Strainer | Corning | 431751 | |
Luciferase Tagging | |||
Lenti-GFP1 virus | University of Michigan, Vector Core | Luciferase Virus | |
Steady Glo-Luciferase Assay Kit | Promega | E2510 | |
Bioluminescence Imaging | |||
Ivis Spectrum Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
D-Luciferin | Promega | E160X | |
Anesthetic | |||
Inhaled Isoflurane | Piramal Critical Care Inc | 66794-0017-25 | |
Ultrasound Guided Injection | |||
Vevo 2100 High Resolution Imaging | Vevo | 2100 | |
Hamilton Syringes (27 gauge needle) | Hamilton | 80000 | |
22 Gauge Angiocatheter | BD Biosciences | 381423 | |
Optical ointment | Major Pharmaceuticals | 301909 | |
Nair | Church & Dwight Co | Hair Removal agent | |
Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel | Parker | Ultrasound gel | |
Histology | |||
CD99 | DAKO | M3601 | Primary Antibody |
Tyrosine Hydroxylase | Sigma-Aldrich | T2928 | Primary Antibody |
Secondary HRP-Polymer antibody | Biocare | BRR4056KG | |
Miscelleneous | |||
10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
1.5 mL Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
P1000 pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
P200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
P1000 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375E | |
P200 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
Portable pipette aid | Drummond | 4-000-101 | |
digital animal Weighing Scale | KentScientific | SCL-1015 | |
Calipers | Fisher Scientific | 06-664-16 | |
6well low attachment plates | Corning | 07-200-601 | |
10 cm Tissue Culture Treated Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |