Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at generere insulin udtrykker 3D murine pancreatoids fra frit svævende e10.5 adskilles i bugspytkirtlen ophav og den tilknyttede udkom.
Abstract
Bugspytkirtlen er et komplekst organ sammensat af mange forskellige celletyper, der arbejder sammen om at regulere blod glukose homøostase og fordøjelse. Disse celletyper omfatter enzym-secernerende acinar celler, et arborized duktalt system ansvarlig for transport af enzymer til de gut, og hormon-producerende endokrine celler.
Endokrine beta-celler er den eneste celle i kroppen, som producerer insulin til at sænke blodsukkerniveauet. Diabetes, en sygdom karakteriseret ved tab eller dysfunktion af beta-celler, er ved at nå epidemiske højder. Det er således afgørende for at fastlægge protokoller for at undersøge beta-celle udvikling, der kan bruges til screening for at udlede narkotika- og cellebaseret terapi. Mens den eksperimentelle undersøgelse af mus udvikling er væsentlige, er i vivo undersøgelser besværlig og tidskrævende. Dyrkede celler giver et mere praktisk platform for screening; men de er ude af stand til at opretholde den cellulære mangfoldighed, arkitektoniske organisation og cellulære vekselvirkninger fundet in vivo. Det er således vigtigt at udvikle nye værktøjer til at undersøge i bugspytkirtlen organogenesis og fysiologi.
Pancreas epitelceller udvikle i nære forhold til udkom fra starten af organogenesis som celler organisere og differentiere sig til den komplekse, fysiologisk kompetente voksne orgel. Pancreas udkom giver vigtige signaler for endokrine udvikling, hvoraf mange ikke er vel forstået endnu, således vanskeligt at sammenfatte under in vitro- kultur. Her, beskriver vi en protokol til kultur tre-dimensionelle cellulære komplekse mus organoids, der bevarer udkom, betegnes pancreatoids. E10.5 murine pancreas bud er dissekeret, adskilles og kulturperler i et stillads-frit miljø. Disse flydende cellerne samle selv med udkom omsluttende den udvikle pancreatoid og en robust antal endokrine beta-celler udvikle sammen med de acinar og kanalen celler. Dette system kan bruges til at studere de celle skæbne beslutsomhed, strukturelle organisation og morfogenese, celle-celle interaktioner under organogenesis, eller for narkotika, lille molekyle eller genetisk screening.
Introduction
Afgrænse mekanismerne i den normale udvikling og fysiologi er afgørende at forstå sygdom ætiologi og i sidste ende dyrke behandlingsmetoder. Samtidig dyrkning og differentiering stamceller giver hurtig og høj overførselshastighed analyse af udvikling, det er begrænset af det eksisterende organ viden med hensyn til mekanismer, der regulerer celle skæbne og kunstigt sammenfatter udviklingen i en relativt homogen, to-dimensionelle tilstand1,2. Ikke kun i vivo udvikling påvirket af ydre påvirkninger, med forskellige celletyper i niche og milieu leverer paracrine signaler og organisatorisk støtte til at guide organogenesis, men funktionen af disse celler også bygger på deres omgivelser for vejledning3,4,5. Betragtning af betydningen af disse eksterne stikord, begrænsninger af differentiering protokoller og den møjsommelige karakter af i vivo musemodeller, nye systemer er nødvendige for at eksperimentelt undersøge basale udviklingsprocesser og fysiologi.
Fremkomsten af protokoller til at generere tredimensionelle, komplekse organoids giver en bekvem og sammenfaldende system for at studere organogenesis, fysiologi, medicin effektivitet og endda patogenese. Oprettelse af murine organoids for forskellige systemer såsom mave6 og tarmen7 har udvidet vores forståelse af organogenesis, der giver et værktøj til at studere udviklingsmæssige kompleksiteter med færre begrænsninger end in vivo og in vitro- modeller. På grund af disse fremskridt i den murine organoid dannelse og fremkomsten af humane pluripotente stamceller celler, humane intestinal8, retinal9, renal10,11, og cerebral12 organoids er blevet produceret, og dette Repertoiret er kun begrænset af den eksisterende viden om mekanismerne for udvikling.
Af særlig interesse er generation af pancreas organoids, som et utal af sygdomme plager forskellige pancreas celletyper, herunder acinar celler og kanalerne i eksokrine pancreas insufficiens13, acinar celler i pancreatitis14, og beta celler i diabetes15. At få viden om udviklingen af disse forskellige celletyper kunne støtte i at forstå deres patologi og kan også fungere som en platform for personlig stof screening eller transplantation. Tidligere var udviklet Greggio et al. en metode til at oprette murine pancreas organoids, at sammenfatte i vivo morfogenese og udvikle organiseret, tre-dimensionelle, komplekse strukturer sammensat af alle større pancreas epitelcelle typer16,17. Dette er et stort skridt fremad i feltet i bugspytkirtlen, især som gør celler i vitro kan aktivere biologisk undersøgelse af beta-celle udvikling. Men en mangel på endokrine celler dannet i denne protokol medmindre organoids blev transplanteret ind i vævet, hvor niche kunne interagere og leverer instruktions stikord17. Udkom udgør den største del af niche, stærkt omsluttende udvikle epitel fra tidlige stadier af organogenesis til senere faser herunder endokrine delaminering og differentiering3,4, 18. Samspillet mellem udkom og udviklende bugspytkirtlen er endnu et eksempel af extrinsic signalering og betydningen af at opretholde i vivo cellulære kompleksitet at studere organogenesis.
Her, beskriver vi, hvordan du generere tredimensionelle pancreas organoids, betegnes pancreatoids, fra dissocierede e10.5 murine pancreas stamfaderen. Disse pancreatoids bevarer oprindelig udkom, selv samle i frit svævende betingelser og generere alle vigtig pancreas celletyper, herunder en robust antal endokrine betaceller19. Denne fremgangsmåde er bedst egnet til analyse af endokrine udvikling, da tidligere protokoller mangler robust endokrine differentiering. Men ved hjælp af protokollen for pancreas organoids som beskrevet af Greggio et al. er bedre egnet til analyse af pancreas epitelial forgrening og morfogenese, som forgrener sig er mere begrænset i pancreatoids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg, der er beskrevet i denne metode blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Baylor College of Medicine.
1. forberedelse af mus embryonale dag 10.5 i bugspytkirtlen stamfaderen
Bemærk: Denne protokol behøver ikke at være fulgt under sterile forhold indtil trin 2, men det er optimalt at sterilisere dissektion værktøjer og spray med 70% ethanol før brug.
- Du kan angive til dissektion, udfylde en isspand og placere en container af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) i isen. Rene to fine-tippet pincet og dissektion saks med 70% ethanol. En container med mindst tre borosilicate kapillær rør, en mund pipette, en lighter, i nærheden af dissektion område og filtreret 1.000 µL pipette tips.
- Forbered mindst 1 mL af 1,25 mg/mL koldt dispase fortyndes i steriliseret vand og sted i det andet godt en 12 godt plade på is. Sætte PBS i første, tredje og fjerde wells af 12 godt plade. Sted 1 mL 0,05% Trypsin i en 1,5 mL tube på is. Pre varme en rystende inkubator til 37 oC.
- Aflive e10.5 timed-gravide mus i overensstemmelse med IACUC retningslinjer. Spray maven med 70% ethanol til at rense området før at lave en V-formet snit på kønsdelene med musen ved hjælp af saks og pincet og fortsætte det op til mellemgulvet.
Bemærk: Udseendet af en vaginal plug i denne protokol angiver dag 0,5. Ved hjælp af 5 - 6 uger gamle mus, fungerer en vægtøgning på mere end 2 g som en sekundær foranstaltning af vellykket imprægnering.- Omhyggeligt Punktafgifter livmoderen ved at gøre et snit på den øverste laterale dele af livmoderen, trække orgel opad fra musen, og efter denne snit ned til genital regionen før gentages på den modsatte side. Placere det i en 10 cm petriskål med kolde PBS.
Bemærk: Det er muligt at hente organoids fra e11.5 adskilles celler, men i modsætning til e10.5 pancreatoids, disse organoids ikke er endnu kendetegnet og dermed kan ikke opretholde kapacitet til at differentiere i alle tre vigtig pancreas lineages.
- Omhyggeligt Punktafgifter livmoderen ved at gøre et snit på den øverste laterale dele af livmoderen, trække orgel opad fra musen, og efter denne snit ned til genital regionen før gentages på den modsatte side. Placere det i en 10 cm petriskål med kolde PBS.
- Under en lys dissektion mikroskop, placere petriskålen og forsigtigt åbne den uterine væv ved at placere to pincet mellem hver embryo og peeling væv fra blommesækken. Overføre embryoner af grådige blommesækken forsigtigt med pincet og sted i en 10 cm petriskål med frisk, koldt PBS. Placer petriskålen på is.
Bemærk: Det er vigtigt at heedfully fjerne embryoner, helst vedligeholdes i blommesækken, som insisterende fjernelse kan trække navlestrengen, rippe væv af fosteret og at kompromittere den strukturelle integritet. - Placer flere PBS dråber på 10 cm petriskål låg. Bruge disse dråber til at overføre embryonet under dissektion, da extraembryonic væv fjernes for at sikre synlighed. Overføre embryonet til et PBS drop og forsigtigt fjerne fra blommesækken med pincet, mens de resterende embryoner bo i PBS på is (fig. 1A). Fjerne hovedet inden du flytter embryonet til et nyt PBS drop ved hjælp af pincet til let scoop embryo op, for ikke at beskadige væv (figur 1B).
Bemærk: Vævet muligvis overføres oftere til frisk PBS dråber end beskrevet her, afhængigt af opaciteten af væsken.- I en ny PBS drop, fjerne forelimb knopper med pincet (figur 1B). Placer pincet i åbningen hvor lemmer bud var til stede og forsigtigt rive kun de mest eksterne væv anteriorly (figur 1B). Rotere embryo og gentager i den posteriore retning, stop ved hindlimb bud. På dette tidspunkt, bør mave-tarmkanalen være synlige (figur 1B).
- Den posteriore regionen i mave-tarmkanalen har en let bøjning (figur 1F). Indsæt pincet bag denne bøje i åbningen mellem mave-tarmkanalen og spinal region af kroppen væggen. Frigøre mavetarmkanalen, arbejder langsomt opad, indtil den mest forreste region er nået, hvor regionen hjerte forbinder (figur 1B-E).
Valgfrit: Fjerne primordiale hjertet og leveren knopper fra de ventrale regioner i mave-tarmkanalen, forlader kun kontinuerlig gut røret. De første par gange denne protokol er udført kan det være nemmere at lade hjertet og leveren som ventrale vartegn indtil morfologi af mave-tarmkanalen og den dorsale pancreas bud er mere velkendte (figur 1C og D ). - Overføre mave-tarmkanalen til frisk PBS slipværktøjet.
- Tage pincet og forsigtigt klemme vævet under den fremspringende bud og tarmen og lidt løft den ydre væv ud (fig. 1D-F).
Bemærk: Den dorsale pancreas bud ligger mellem mave og tarm (figur 1C-G). Pancreas opløbet under burde ligne en rund, knobby struktur (figur 1G). - Placer pincet hvor opløbet forbinder tarmen og knivspids opad for at løsne bud (figur 1G). Vask en gang i en ny PBS boble inden flytningen opløbet i den første brønd af 12 godt pladen i kolde PBS på is. Gentag, indtil alle knopper er indsamlet fra embryoner og placeret i den første godt af 12 godt plade.
- Placer den 12 godt parabol mikroskopet lys dissektion. Tæller antallet af pancreas knopper med held dissekeret senere beregne delingsforholdet.
- Sted en filtreret 1.000 µL pipette tip i munden pipette med et kapillarrør knyttet. Flammen sterilisere den kapillarrør og skabe en bøje i røret til brugervenlighed. Brug af kapillar overførsel knopper til den anden godt indeholdende kolde dispase løsning for 2 min før overførsel til den tredje godt med den rene PBS (figur 1G).
Bemærk: Mens overføre knopper fra dispase til PBS, undgå at berøre væv til spidsen af den kapillarrør. Hvis vævet bliver fast på spidsen af røret, pipetteres op og ned eller ryste i den rene PBS løsning indtil løsnes. - Afpipetteres knopper op og ned, og overføre til den fjerde godt med ren PBS. Endelig, ved hjælp af kapillar enhed transfer knopper til 1,5 mL tube med 0,05% Trypsin. Glasset anbringes i pre varmede 37 oC shaker og ryst på 1.500 rpm i 4 min.
- Vortex for ca. 10 s derefter straks placere røret i en centrifuge og spin i 5 min på 200 g. fjerne alle men cirka 50 µL af løsning forsigtigt at ikke forstyrre de centrifugeret celler (figur 1G).
- Sted en filtreret 1.000 µL pipette tip i munden pipette med et kapillarrør knyttet. Flammen sterilisere den kapillarrør og skabe en bøje i røret til brugervenlighed. Brug af kapillar overførsel knopper til den anden godt indeholdende kolde dispase løsning for 2 min før overførsel til den tredje godt med den rene PBS (figur 1G).
2. dyrkning dissocierede stamfaderen til at danne Pancreatoids
Bemærk: Følgende bør udføres i en steril atmosfære i en standard vævskultur hætte, ved hjælp af standard sterile procedurer.
- For hvert bud, der opsamlet, tilføje 400 µL organogenesis media16,17 (tabel 1) til de centrifugeret celler. Puls vortex tre gange og pladen 100 µL pr. brønd af et lavt vedhæftet 96 plade godt, opdele knopper i forholdet 1:4 (figur 1G).
- Check under mikroskop til at visualisere dissocieres celler frit flydende (figur 1H). Placere kultur fadet i en 37 oC kuvøse med 5% CO2 på en rocker på medium hastighed.
- Overvåge status for pancreatoids dagligt. Erstat med 100 µL af frisk medierne hver 3 dag, omhyggeligt pipettering medier under mikroskopisk kontrol i hood at fjerne samtidig bevare pancreatoid i brønden. Frisk 100 µL af medier kan alternativt, føjes til en ny brønd og pancreatoid overføres ved hjælp af den borosilicate kapillarrør knyttet til munden pipette og 1000 µL filtreret pipette tip.
3. behandling Pancreatoids for immunfluorescent Imaging
- Hvis du vil behandle pancreatoids for immunfluorescent billeder, først forberede 4% PARAFORMALDEHYD/PBS, pH7.4 (PFA) løsning. Sted 50 µL af 4% PFA i wells af en 96 godt plade.
- Ved hjælp af borosilicate kapillarrør og munden pipette med 1.000 µL filtrerede pipette tip, overføre pancreatoids fra næringssubstratet tager så lidt medier som muligt i den friske brønd med 4% PFA. Sæt på Vippeknappen ved stuetemperatur i 15 min.
- Overfør pancreatoids fra 4% PFA i en brønd med 100 µL af frisk PBS, rock ved stuetemperatur for 5-10 min. Gentag i alt tre friske PBS vasker.
Bemærk: Protokollen kan blive standset her, med pancreatoids gemt i 100 µL af PBS på 4 oC for op til en uge.
- For wholemount billeddannelse (anbefales, hvis antistoffer er passende, alternative tilgang i afsnit 3.3. og mikroskopi i 3.4.), overføre fra PBS til 50 µL 5% æsel serum i 1 x PBS med 0,1% nonionisk detergent (PBST) til blok. Rock overnatning på 4 oC eller alternativt i 4 timer ved stuetemperatur.
- Overføre pancreatoids til en ny brønd, der indeholder primære antistoffer fortyndet i 50 µL af 5% æsel serum i 1 x PBST. Optimalt, rock i 24 timer ved 4 oC (mindst 12 h men op til 36 h).
Bemærk: Antistoffer der er anført i Tabel af materialer mod Chga (1: 100), DBA (1: 400), Vim (1: 400) og Pdx1 (1: 100) er velegnet til wholemount farvning; andre antistoffer kan kræve optimering. - Overføre pancreatoids til en brønd, der indeholder 100 µL af frisk PBST at vaske og rock i 30 min. ved stuetemperatur. Gentag dette trin for i alt tre friske PBST vasker.
- Overføre pancreatoids til en ny brønd indeholdende sekundære antistoffer fortyndet i 50 µL af 5% æsel serum i 1 x PBST. Beskytter pladen mod lys og plads i 4 oC, vuggende for optimalt 24 h (mindst 12 h men op til 36 h).
Bemærk: Alle sekundære antistoffer, der er anført i Tabel af materialer og DAPI nukleare kontrastfarve er egnet til wholemount farvning. - Overføre pancreatoids til en ny brønd, som indeholder 100 µL 1 x PBST og rock ved stuetemperatur i 30 min. Gentag i alt af tre vasker i 1 x PBST. I den tredje og sidste vask, tilføje 300 nM DAPI.
- Endelig, sted i 100 µL af ren PBS og butik på 4 oC beskyttet mod lys for op til en uge før imaging af Konfokal mikroskopi, selv om bedste resultater kommer fra imaging straks efter farvning. For at forhindre bevægelse af pancreatoids under imaging, men forhindre udtørring placere hvert pancreatoid i et 20 µL slipværktøj af PBS. Hvis pancreatoids ikke forbliver stadig, reducere PBS volumen.
- Overføre pancreatoids til en ny brønd, der indeholder primære antistoffer fortyndet i 50 µL af 5% æsel serum i 1 x PBST. Optimalt, rock i 24 timer ved 4 oC (mindst 12 h men op til 36 h).
- For frosne dele, overføre pancreatoids fra PBS til 30% rørsukkeropløsning overnatning på 4 oC.
- Tilføje indlejring medier i en boble under et mikroskop for dissektion. Brug af pincet under mikroskopisk kontrol, blød pancreatoids ved forsigtigt at skubbe gennem indlejring medierne flere gange at fjerne resterende saccharose før du overfører til et væv blok med frosne indlejring medier.
- Placer væv blok på tøris indtil frosset og afsnit på kryostater på 8 µm.
Bemærk: Sektioner kan opbevares ved-80 oC eller immunostained straks. - Tillad afsnit fra-80 oC at tø op ved stuetemperatur i ca 5 min. indtil tør. Tegne en hydrofobe barriere ved hjælp af den hydrofobe pap pen omkring væv og blokken ved hjælp af 5% æsel serum fortyndet i 1 x PBST i 30 min. ved stuetemperatur.
- Fjern medie og Udskift straks med primære antistoffer fortyndet i 5% æsel serum fortyndet i 1 x PBST overnatning på 4 oC.
- Fjerne den primære løsning og vaske væv tre gange med 1 x PBST i 10 min. Efter dette, Tilføj sekundær antistof løsning fortyndet i 5% æsel serum fortyndet i 1 x PBST i 1 time ved stuetemperatur og beskytte dias fra lys.
- Fjerne den sekundære løsning og vaske dias tre gange i 1 x PBST i 10 min. I den sidste vask, tilføje 300 nM DAPI.
- Fjerne medier og tilføje montering medier og en coverslip. Butik glider væk fra lys i 4 oC indtil klar til billede.
4. isolering af RNA fra Pancreatoids til udskrift analyse
- Saml pancreatoids ved hjælp af borosilicate kapillær knyttet til munden pipette med en filtreret 1.000 µL pipette tip til steriliteten, og i 500 µL af syre guanidinium kaliumthiocyanat-phenol-chloroform løsning i en 1,5 mL tube. Opbevar ved-80 oC eller gå straks til RNA isolering.
- For RNA isolering, tø prøver på is, hvis det er nødvendigt og tilføje 100 µL chloroform. Vortex godt og sted i 4 oC i 15 min. cool før en centrifuge til 4 oC.
- Sted rør i centrifuge og spin i 20 min. på 12.000 g på 4 oC.
- Fjern forsigtigt rør vil ikke forstyrre adskillelse af lag. Bruger en 200 µL pipette, indsamle de klar vandig opløsning og placere i en ny 1,5 mL tube, efterlod en lille mængde til buffer fra hvid protein lag og pink DNA lag. Rør ikke ved spidsen af pipetten til noget i denne proces og ikke røre væggene i 1,5 mL tube.
- Tilføje 500 µL af 100% isopropanol til det nye rør, der indeholder vandige lag og vortex. Lad sidde ved stuetemperatur i 20 min., længere på isen, eller for maksimal nedbør henstår natten over ved-20 oC.
- Der centrifugeres ved 12.000 g i 15 min. ved 4 oC at sammenpresse RNA. Fjerne isopropanol uden at forstyrre pelleten.
NOTE: Da pancreatoids er små, er det sandsynligt, pellet ikke vil være synlig. - Tilsæt koldt, 75% ethanol og vend røret flere gange. I centrifugen og spin på 9.000 x g i 10 min. ved 4 oC. Fjern ethanol og spin for 2 min på 9.000 x g.
- Bruge 200 µL pipette til at fjerne enhver resterende ethanol i røret, uden at kontakte regionen pellet er placeret i. Lad fælles landbrugspolitik åben på rør for 5-10 min ved stuetemperatur til at sikre en fordampning af resterende ethanol.
- Resuspend pellet i af vortexing i 20 µL af rene, nukleasen-frit vand.
Valgfrit: Varme RNA på 65 oC i 3 min og straks vende tilbage til isen. RNA kan opbevares ved-80 oC eller umiddelbart anvendes til reverse transkription og qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Omhyggelig dissektion af musen embryoner på e10.5 fra den uterine horn bør give ubeskadigede embryoner i PBS for yderligere dissektion (fig. 1A). Mave-tarmkanalen kan fjernes effektivt fra Foster (figur 1B), tillader dømmekraft i den dorsale pancreas knop ved krydset af tarmen og maven (figur 1C-F). E10.5 i bugspytkirtlen bud har tidligere været præget; ophavene skal give udtryk for Pdx1, Sox9, Ptf1a, og Hes120,21,22,23. Efter væv behandlingstrin, adskilles i bugspytkirtlen enkelt celler eller små grupper af celler kan visualiseres ved lysmikroskopi (figur 1G-H).
I organogenesis medier, disse frit svævende, stillads-gratis celler selv samle og organisere i tre-dimensionelle pancreatoids, der vokser og vedvarer mindst ti dage i kultur (fig. 2A). Pancreatoids har morfologiske ligheder i vivo bugspytkirtlen med forgrenede morfogenese forekommende. Ved hjælp af Transgene mus, kan forskellige celletyper eller processer overvåges i realtid. For eksempel kan ved hjælp af Ins1-eGFP24 mus til at markere dannelsen af endokrine beta celler, pancreatoids være afbildet i dagligt at visualisere beta celle udvikling (figur 2B). Yderligere, ved at ændre dyrkningsbetingelser, tilføje små molekyler, lægemidler eller manipulering af genomet, ikke kun kan vurderes i celle skæbne bestemmelse men ændringer i struktur og morfologi kan også undersøges. Her viser vi anvendelsen af protein kinase C activator phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) ved høje koncentrationer (160 nM), som ændrer morfologi for at udvikle pancreatoids, fører til løst forbundet epitelceller og øget forgrening 19 (figur 2C).
For at vurdere sammenslutningen af pancreas udkom væv med pancreas epitelceller, kan immunfarvning udføres for markører for hver væv. Immunfarvning af gaffatape markør, DBA25,26, med en endokrine markør, Chga27, og kerner præget af DAPI afsløre multi lineage dannelse i pancreatoids (fig. 3A). Udkom markør, Vimentin, co farves med en markør, pancreas stamfader (fra e9.0 til ca e15.5) Pdx1, viser at udkom indhyller pancreatoid (fig. 3B). Immunfarvning kan også bruges til at undersøge morfologi, med Pdx1 afslørende forgrening strukturer, såvel som forskellige markører for celletyper af interesse. I figur 3C, vi visualisere beta celle udvikling af farvning for epitelial markør Pdx1 og beta cell markør Ins. Brug qPCR analyse, afskrifter af stamfaderen og differentiere celler en vurderes som stamfader gener Pdx1 og Hes1, og differentieret markører Prss1, Prss3, Hnf6, Isl1, Nkx6-1, og Ins1 (figur 4).
Figur 1: skitse af dissektion, dissociation, og klædningen af e10.5 i bugspytkirtlen stamfaderen for pancreatoid generation. (A) brightfield billedet af e10.5 embryo. (B) skematiske af dissektion procedure, starter øverst til venstre. Røde stiplede linjer angiver regioner til at skære, mens den grønne region er mave-tarmkanalen. Først fjernes hovedet efterfulgt af fjernelse af forelimb knopper og åbningen af siden af organismen. (C) mave-tarmkanalen er omhyggeligt fjernet, med hjertet og leveren knopper fremspringende fra den ventrale region i tarmkanalen. Maven, dorsale pancreas bud og tarmen kan visualiseres, som vist i brightfield billedet. (D) fjernelse af hjertet og leveren knopper. Skematisk er til venstre og brightfield billedet til højre. (E) Pinching af vævet omkring den dorsale pancreas bud at eksponere bud til dissektion. Skematisk er til venstre og brightfield billedet til højre. (F) mavetarmkanalen med den dorsale pancreas bud under brightfield mikroskopi. I billedet til venstre er bøje i tarmen synlig, hvor pincet kan placeres når afmonterer mave-tarmkanalen fra spinal-regionen. Til højre viser høj forstørrelse brightfield billede både dorsal og ventral pancreas knopper. (G) fjernelse af den dorsale pancreas bud og forarbejdning af væv inden dissociation, ophvirvling i organogenesis medier, plating. (H) brightfield billede viser dissocierede celler umiddelbart efter plating. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Overvågning pancreatoids over tid. (A) Brightfield billeder af pancreatoids på dag 1, dag 2 og dag 3. Skalere barer = 100 um. (B) Manipulation af kultur betingelser at undersøge i bugspytkirtlen morfogenese. Her, fører tilføjelsen af høje niveauer af PMA til løsnede epitelial struktur og øget forgrening, som visualiseret ved brightfield mikroskopi på dag 1 og 2. Skalere barer = 100 µm. (C) Ins1-eGFP musen pancreatoids på dag 4, dag 5, dag 6, dag 7 og dag 9, med udviklingen af beta-celler angivet af eGFP i grøn. Skalere barer = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Immunfarvning af pancreatoids. (A) immunfarvning pancreatoid på dag 5 at markere kanalerne af DBA i rød, endokrine celler ved Chga i grøn og kerner præget af DAPI i blå. (B) immunfarvning pancreatoid på dag 7 at markere udkom af Vimentin i rød og pancreas stamfaderen af Pdx1 i grøn. (B) immunfarvning pancreatoid på dag 7 at markere beta celler af Insulin i rød og pancreas stamfaderen af Pdx1 i grøn. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Udskrift analyse. Kvantitativ PCR i dag 7 pancreatoids for markører af stamfaderen og differentiering celler. Sammenligning med i vivo murine væv er vist i Scavuzzo et al. (2017). resultaterne er normaliseret til Gapdh. N = 2, skala barer er SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Komponent | Forkortelse | Endelig koncentration |
| Penicillin-Streptomycin | P/S | 1% |
| FBS-gratis medier supplement | 10% | |
| Beta-Mercaptoethanol | bME | 0,1 mM |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetat | PMA | 16 nM |
| Y-27632 eller ROCK hæmmer | RI | 10 uM |
| Epidermal vækstfaktor | EGF | 25 ng/mL |
| R-Spondin1 | - | 500 ng/mL |
| Sure Fibroblast vækstfaktor, Fibroblast vækstfaktor 1 | aFGF, FGF1 | 25 ug/mL |
| Heparin natriumsalt | Heparin | 2 U/mL |
| Fibroblast vækstfaktor 10 | FGF10 | 100 ng/mL |
| Dulbeccos modificerede Eagle Medium/næringsstof blanding F-12 | DMEM/F12 | til 5 mL |
Tabel 1. Organogenesis media.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Progression af celle kultur modeller er afgørende for korrekt modeludvikling, producere klinisk relevante celletyper, test narkotika effektivitet eller endda transplantation til patienter. Dog kunstigt recapitulating udviklingen i en parabol udfordrende, som vi er stadig langt fra at forstå mekanismerne organogenesis og fysiologi in vivo. In vitro- celler er således ineffektivt genereret, ikke fuldt funktionelle, kan ikke opretholdes i længere tid, eller havnen andre afvigelser fra sammenlignelige celler i kroppen. Dette er fordi mange forskellige celletyper interagere mens komplekse morfogenetiske ændringer sker for at påvirke udviklingen og fysiologi. Få en forståelse af hvordan udviklingen forløber ved at kombinere bekvemmelighed af in vitro- ville systemer samtidig bevare kompleksitet i vivo udvikling give et værdifuldt redskab for den biomedicinske forskning.
Udviklingen af organoids er en lovende avenue mod modellering kompleksiteten af udvikling. I denne protokol redegøre vi for hvordan man laver i bugspytkirtlen organoids, såkaldte pancreatoids, som bevarer oprindelig udkom og håndfast generere endokrine celler, omend pancreatoids ikke udviser glukose lydhørhed. Dette værktøj kan bruges til at undersøge mekanismerne for udvikling samt funktionalitet i en kultur-systemet, der fastholder heterogenitet af væv fundet i vivo. Yderligere, kan dette bruges til genetiske skærme eller skærmen små molekyler eller narkotika. Dette er især interessant, som test kandidat narkotika i relativt homogen celle kultur systemer kan omgå virkningerne af disse forbindelser på andre nærtbeslægtede celletyper.
Der er flere kritiske trin under denne protokol. Første, en omhyggelig fjernelse af embryoner fra livmoderen er vigtigt som trække embryonerne kraftigt kan rippe maveregionen og gør det vanskeligt at skelne mavetarmkanalen for at få den i bugspytkirtlen bud (trin 1.3). Andet, ren dissektion af pancreas bud fra mave-tarmkanalen er kritisk, som tage overskydende væv kan føre til differentiering af andre celletyper (trin 1.4.4). For at gøre dette, er det vigtigt at klemme under pancreas opløbet og løfte det overliggende væv inden isolere pancreas opløbet. Endelig, når man flytter knopper fra dispase tilbage i PBS til vask, er det nødvendigt at bruge en borosilicate kapillarrør og ikke lade væv røre ved kanten af røret åbning, ellers vævet vil holde sig til spidsen af tube (trin 1.5.1). For at undgå dette, skal du starte munden pipettering løsning før bevæger sig mod den knop, giver bud at gå ind i røret og ikke på ydersiden.
Denne metode tillader dannelsen af endokrine celler i et 3D pancreatoid, men den epitel forgrening er mere begrænset end andre eksisterende protokoller16,17. Yderligere, mens insulin-producerende endokrine celler form, de ikke udviser glukose lydhørhed. Derfor vil yderligere undersøgelse af modningen af disse celler give værdifulde oplysninger både i generation af funktionelle pancreatoids samt inden for beta celle generation i almindelighed.
Generation af pancreatoids at udvikle endokrine celler, og i fremtiden at opnå glukose lydhørhed, har potentielle konsekvenser for behandlingen af diabetes. Diabetes er en oplagt kandidat til regenerativ terapi, som i bugspytkirtlen beta celler er tabt eller dysfunktionelle og erstatter disse celler kan potentielt lindre sygdom komplikationer. Fremskridt i differentiere hPSCs i beta celler, men i diabetes, der er ofte dysfunktioner til andre celletyper i bugspytkirtlen sammen med beta celler, herunder alfa celler eller acinar celler28,29, 30,31,32. Således, genererer nye pancreas væv til transplantation kan fuldt ud erstatte den plagede væv. Med den yderligere undersøgelse af murine pancreatoid dannelse og funktion, kan den udviklingsmæssige bane efterlignes for at generere menneskelige pancreatoids ud af hPSCs. Disse menneskers pancreatoids kan bruges til personlig medicin til skærmen for lydhørhed over for narkotika i en patient-specifikke kontekst, og regenerativ terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Jolanta Chmielowiec for nyttige diskussionen om protokollen og manuskriptet. Vi takker også Benjamin Arenkiel for adgang til Konfokal mikroskop. Dette arbejde blev støttet af NIH (P30-DK079638 til M.B.) og T32HL092332-13 M.A.S. og M.B., McNair medicinsk Foundation (til M.B.) og konfokal kernen på BCM intellektuelle og udviklingsforstyrrelser Research Center (NIH U54 HD083092 fra Eunice Kennedy Shriver National Institute for børns sundhed og menneskelige udvikling).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
References
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bioessays. 39 (4), (2017).
- Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
- Landsman, L., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).
- Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Xia, Y., et al. The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells. Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Loftus, S. K., et al. Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency. PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).
- Kleeff, J., et al. Chronic pancreatitis. Nat Rev Dis Primers. 3, 17060 (2017).
- Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
- Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors. Journal of Visualized Experiments. (89), 51725 (2014).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).
- Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
- Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells. Scientific Reports. 7 (1), 10810 (2017).
- Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).
- Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells. Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).
- Seymour, P. A., et al. SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).
- Kawaguchi, Y., et al. The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney. Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).
- Reichert, M., et al. Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells. Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).
- Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives. Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).
- Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes. Diabetes and Metabolism. 34, Suppl 2 49-55 (2008).
- Del Prato, S., Marchetti, P. Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).
- Piciucchi, M., et al. Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment. International Journal of Endocrinology. 2015, 595649 (2015).
- Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes. Current Diabetes Reports. 15 (10), 79 (2015).
- Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin. Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).
