Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para gerar insulina expressando 3D pancreatoids murino de progenitores pancreático flutuantes e10.5 dissociada e a mesênquima associada.
Abstract
O pâncreas é que um órgão complexo composto de muitos tipos de células diferentes que trabalham juntos para regular a digestão e homeostase de glicose do sangue. Estes tipos de células incluem células acinares secretoras de enzima, um sistema ductal arborized responsável para o transporte de enzimas para as intestino e produção de hormônio de células endócrinas.
Beta-células endócrinas são o tipo de célula única no organismo que produzem a insulina para baixar os níveis de glicose do sangue. Diabetes, uma doença caracterizada por uma perda ou a disfunção das células beta, está alcançando proporções epidêmicas. Assim, é essencial estabelecer protocolos para investigar o desenvolvimento de células beta que pode ser usado para fins de triagem para derivar a droga e a terapêutica baseada em célula. Enquanto a investigação experimental do desenvolvimento do mouse é essencial, na vivo estudos são trabalhosas e demoradas. Células cultivadas fornecem uma plataforma mais conveniente para a seleção; no entanto, eles são incapazes de manter a diversidade celular, organização arquitetônica e interacções celulares encontradas in vivo. Assim, é essencial para desenvolver novas ferramentas para investigar fisiologia e organogênese no pâncreas.
Células epiteliais pancreáticas desenvolveram em estreita associação com mesênquima desde o início da organogênese como células organizam e diferenciarem-se em órgão complexo, fisiologicamente competente adulto. A mesênquima pancreática fornece sinais importantes para o desenvolvimento do sistema endócrino, muitos dos quais não são bem compreendidos ainda, assim, difícil recapitular durante o cultivo em vitro . Aqui, descrevemos um protocolo para organoids de rato complexas tridimensionais, celular de cultura que retêm mesênquima, denominada pancreatoids. O broto pancreático murino de e10.5 é dissecado, dissociado e cultivado em um ambiente livre de andaime. Estas células de flutuação auto-montagem com mesênquima que envolvia o desenvolvimento pancreatoid e um número robusto de beta-células endócrinas, desenvolvendo juntamente com o acinares e as células do duto. Este sistema pode ser usado para estudar as interações de célula célula célula destino determinação, organização estrutural e morfogênese, durante a organogênese, ou para a droga, pequena molécula ou rastreio genético.
Introduction
Delinear os mecanismos do desenvolvimento normal e a fisiologia é fundamental para compreender a etiologia da doença e, finalmente, cultivar métodos de tratamento. Enquanto cultivo e diferenciação de células-tronco permite uma análise rápida e de alta produtividade de desenvolvimento, é limitada pelo corpo de conhecimentos sobre os mecanismos que regulam o destino de célula existente e artificialmente recapitula o desenvolvimento em um relativamente Estado homogêneo, bidimensional1,2. Não só está na vivo desenvolvimento afetado por influências extrínsecas, com diferentes tipos de células no nicho e meio fornecendo sinais parácrina e apoio organizacional para guiar a organogênese, mas a função destas células também se baseia em sua ambiente para orientação3,4,5. Dada a importância desses sinais externos, as limitações de protocolos de diferenciação e a natureza laboriosa de modelos de rato na vivo , novos sistemas são necessários para investigar experimentalmente fisiologia e processos básicos do desenvolvimento.
O surgimento de protocolos para gerar tridimensionais, complexo organoids fornece um sistema conveniente e congruente para estudar organogênese, fisiologia, eficácia de drogas e até mesmo patogênese. Que estabelece organoids murino para diferentes sistemas tais como o estômago6 e intestino7 expandimos nossa compreensão da organogênese, fornecendo uma ferramenta para estudar as complexidades do desenvolvimento com menos restrições do que in vivo e modelos em vitro . Devido a estes avanços nos organoides murino-formação e o advento de pluripotentes humanas tronco células intestinais humanas8, retina9, renal10,11, e organoids cerebral12 foram produzidos e isto repertório é limitado pelo conhecimento existente sobre mecanismos de desenvolvimento.
De particular interesse é a geração de organoids do pâncreas, como pragas de uma miríade de doenças diferentes pancreático tipos de células, incluindo células acinares e dutos em insuficiência pancreática exócrina13, células acinares em pancreatite14, e células beta em diabetes15. Adquirir conhecimentos sobre o desenvolvimento destes tipos de células diferentes poderia auxiliar na compreensão de sua patologia e, também, agir como uma plataforma para triagem de drogas personalizadas ou transplante. Anteriormente, et al . Greggio desenvolveu um método para criar murino organoids pancreático que recapitular na vivo morfogênese e desenvolver estruturas organizadas, tridimensionais, complexas compostas por todas as grandes células epiteliais do pâncreas tipos de16,17. Este é um grande passo em frente no campo do pâncreas, especialmente como fazer células in vitro pode habilite investigação biológica do desenvolvimento de células beta. No entanto, uma escassez de células endócrinas formada neste protocolo, a menos que os organoids foram transplantadas no tecido, onde o nicho poderia interagir e fornecer pistas instrucional17. A mesênquima constitui a maior parte do nicho, envolvendo fortemente o epitélio em desenvolvimento desde as fases iniciais da organogênese para fases posteriores, incluindo delaminação endócrino e diferenciação3,4, 18. A interação entre a mesênquima o pâncreas em desenvolvimento é mais um exemplo de sinalização extrínseca e a importância da manutenção na vivo celular complexidade estudar organogênese.
Aqui, descrevemos como gerar tridimensional organoids do pâncreas, denominado pancreatoids, de e10.5 dissociada murino progenitoras pancreáticas. Estes pancreatoids reter mesênquima nativa, auto-montagem em condições de livre flutuação e gerar todos os tipos de grandes células pancreáticas, incluindo um número robusto de células endócrinas beta19. Esta abordagem é mais adequada para a análise do desenvolvimento do sistema endócrino, como protocolos anteriores faltam robusta diferenciação endócrina. No entanto, usando o protocolo para organoids do pâncreas como descrito por Greggio et al é mais adequado para análise de ramificação epiteliais do pâncreas e morfogênese, como ramificação é mais limitada em pancreatoids.
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Protocol
Todos os experimentos animais descritos neste método foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê da Baylor College of Medicine.
1. preparação do Mouse embrionárias dia 10.5 progenitores pancreático
Nota: Este protocolo não precisa ser seguido em condições estéreis até o passo 2, no entanto, é ideal para esterilizar instrumentos de dissecação e pulverizar com prévio de 70% de etanol para usar.
- Para configurar para dissecação, encha um balde de gelo e coloque um recipiente de salina tamponada fosfato (PBS) no gelo. Limpe duas pinças de ponta fina e tesoura de dissecação com etanol a 70%. Situado perto da área de dissecação, um recipiente pelo menos três borosilicato capilar tubos, uma pipeta de boca, um isqueiro e filtrada 1.000 pontas de pipetas µ l.
- Prepare pelo menos 1 mL de dispase frio 1,25 mg/mL, diluído em água esterilizada e coloque no segundo poço de 12 prato bem no gelo. Colocou a primeira, terceira e quarta PBS poços dos 12 placa bem. Coloque 1 mL de 0,05% de tripsina em um 1,5 mL tubo no gelo. Pré-aquecer uma incubadora de agitação para 37 oC.
- Eutanásia em e10.5 ratos grávidas cronometrado em conformidade com as diretrizes IACUC. Pulverize o abdômen com etanol a 70% para limpar a região antes de fazer uma incisão em forma de V no área genital do mouse usando a tesoura e pinça e continuá-lo até o diafragma.
Nota: A aparência de um tampão vaginal neste protocolo indica dia 0,5. Um ganho de peso de mais de 2G usando 5 - ratos de 6 semanas de idade, atua como medida secundária de impregnação de sucesso.- Excisar cuidadosamente o útero, fazendo uma incisão na porção lateral superior do útero, puxando o órgão para cima longe do mouse e após esta incisão até a região genital antes de repetir do lado oposto. Coloque-o em uma placa de Petri com a PBS fria de 10 cm.
Nota: É possível obter organoids de células e11.5 dissociado, no entanto, ao contrário do pancreatoids de e10.5, estes organoids ainda não são caracterizados e, portanto, não podem manter a capacidade de se diferenciarem em todas as três principais linhagens do pâncreas.
- Excisar cuidadosamente o útero, fazendo uma incisão na porção lateral superior do útero, puxando o órgão para cima longe do mouse e após esta incisão até a região genital antes de repetir do lado oposto. Coloque-o em uma placa de Petri com a PBS fria de 10 cm.
- Sob um microscópio de luz dissecação, coloque o prato de Petri e abra cuidadosamente o tecido uterino colocando duas pinças entre cada embrião e descascando o tecido do saco vitelino. Transferência de embriões segurando o saco vitelino suavemente com fórceps e coloque em um prato de Petri com fresco, de 10 cm frio PBS. Coloque o prato de Petri no gelo.
Nota: É importante remover heedfully embriões, de preferência mantidos dentro do saco vitelino, como remoção vigorosa pode puxar o cordão umbilical, rasgando o tecido do embrião e comprometer a integridade estrutural. - Coloque várias gotas de PBS sobre uma tampa de caixa de Petri de 10 cm. Use essas gotículas para transferir o embrião durante a dissecção, como tecidos extraembryonic são removidos para garantir visibilidade. Transferir um embrião para uma gota de PBS e delicadamente Retire o saco vitelino usando fórceps, enquanto os restantes embriões permanecem em PBS no gelo (Figura 1A). Remova a cabeça antes de mover o embrião para uma nova queda de PBS usando fórceps para colher levemente o embrião, para não danificar o tecido (Figura 1B).
Nota: O tecido pode precisar ser transferido mais frequentemente para gotículas de PBS frescas do indicado aqui, dependendo da opacidade do líquido.- Em uma gota de PBS nova, remova os botões do membro anterior usando fórceps (Figura 1B). Coloque a pinça na abertura onde o broto do membro estava presente e delicadamente desfazer apenas o tecido mais externo anteriormente (Figura 1B). Rode o embrião e repita na direção posterior, parando no broto do membro posterior. Neste ponto, o trato gastrointestinal deve ser visível (Figura 1B).
- A região posterior do tracto gastrointestinal tem uma ligeira curva (Figura 1F). Inserir o fórceps para trás esta curva na abertura entre o trato gastrointestinal e região da coluna vertebral da parede da corpo. Desanexe o trato gastrointestinal, trabalhando lentamente para cima até atingir a região mais anterior onde a região cardíaca conecta (Figura 1B-E).
OPCIONAL: Remova o coração primordial e os gomos de fígado da região ventral do tracto gastrointestinal, deixando apenas o tubo contínuo do intestino. Nas primeiras vezes este protocolo é executado pode ser mais fácil deixar o coração e o fígado como Marcos ventrais até a morfologia do trato gastrointestinal e o broto pancreático dorsal estão mais familiarizados (Figura 1C e D ). - Transferi o trato gastrointestinal para a gota fresca de PBS.
- Pegue a pinça e aperte suavemente o tecido sob o botão saliente e intestino e levantar ligeiramente o tecido exterior fora (Figura 1D-F).
Nota: O broto pancreático dorsal está localizado entre o estômago e intestino (Figura 1C-G). O broto pancreático abaixo deve parecer uma estrutura redonda, manchinha (Figura 1G). - Coloque a pinça onde o broto se conecta ao intestino e aperto para cima para soltar o botão (Figura 1G). Lave uma vez em uma bolha de PBS nova antes de transferir o broto no primeiro poço da placa de 12 bem no frio PBS no gelo. Repita até que todos os botões são coletados de embriões e colocados no primeiro poço da placa de 12 bem.
- Coloque o prato bem 12 sob o microscópio de luz dissecação. Conte o número de brotos pancreáticos dissecados com sucesso para depois calcular a taxa de divisão.
- Lugar uma ponta de pipeta de µ l 1.000 filtrado dentro da pipeta de boca com um tubo capilar conectado. Chama esterilizar o tubo capilar e criar uma curva no tubo para a facilidade de uso. Use o capilar para transferir os botões para a segunda solução dispase frio bem contendo por 2 min antes de transferir para o terceiro poço com o PBS limpa (Figura 1G).
Nota: Ao transferir os botões do dispase a PBS, evite tocar o tecido para a ponta do tubo capilar. Se o tecido fica preso na ponta do tubo, Pipetar para cima e para baixo ou apertar na solução PBS limpa até afrouxado. - Pipetar os botões cima e para baixo e transferir para o quarto bem com PBS limpo. Finalmente, usando a transferência de dispositivo capilar os botões para o tubo de 1,5 mL com 0,05% tripsina. Colocar o tubo no 37 oC pré-aquecido shaker e agitar a 1.500 rpm por 4 min.
- Vórtice por aproximadamente 10 s imediatamente coloque o tubo em uma centrífuga e rotação durante 5 min à 200 g. remover tudo mas cerca de 50 µ l de solução com cautela para não perturbar as células centrifugadas (Figura 1G).
- Lugar uma ponta de pipeta de µ l 1.000 filtrado dentro da pipeta de boca com um tubo capilar conectado. Chama esterilizar o tubo capilar e criar uma curva no tubo para a facilidade de uso. Use o capilar para transferir os botões para a segunda solução dispase frio bem contendo por 2 min antes de transferir para o terceiro poço com o PBS limpa (Figura 1G).
2. cultivo dissociadas progenitores para formar Pancreatoids
Nota: O seguinte deve ser executada em um ambiente estéril em uma capa padrão de cultura de tecidos, usando os procedimentos padrão de estéril.
- Para cada broto coletado, adicione 400 µ l organogênese mídia16,17 (tabela 1) para as células centrifugadas. Vórtice de pulso três vezes e o placa 100 µ l por alvéolo de uma fixação baixo 96 placa bem, dividindo os botões em uma proporção de 1:4 (Figura 1G).
- Verifique sob o microscópio Visualizar dissociado células livremente flutuante (Figura 1-H). Coloque o prato de cultura numa incubadora 37 oC com 5% CO2 em uma cadeira de balanço na velocidade média.
- Monitore o progresso da pancreatoids diariamente. Substitua com 100 µ l de fresca mídia cada 3 dias, pipetagem cuidadosamente sob controle microscópico de capuz para remover deixando pancreatoid no poço. Alternativamente, fresco 100 µ l de mídia podem ser adicionados a um novo poço e pancreatoid transferidos usando o tubo capilar de borosilicato anexado a pipeta de boca e 1000 µ l filtrado a ponta da pipeta.
3. Pancreatoids de processamento de imagem de imunofluorescência
- Para processar pancreatoids para imagens de imunofluorescência, primeiro prepare 4% paraformaldeído/PBS, solução de pH7.4 (PFA). Colocar 50 µ l de PFA em poços de um 96 bem placa de 4%.
- Usando os tubos capilares de borosilicato e pipeta de boca com a ponta da pipeta filtrada 1.000 µ l, transferir pancreatoids de meio de cultura, levando a mídia tão pouco quanto possível dentro do poço fresco com 4% PFA. Definir o basculante em temperatura ambiente por 15 min.
- Transferência de pancreatoids de 4% rock de PFA em um poço com 100 µ l de PBS fresco, à temperatura de 5-10 min. Repeat para um total de três lavagens de PBS frescas.
Nota: O protocolo pode ser pausado, com pancreatoids armazenados em 100 µ l de PBS no 4 oC por até uma semana.
- Para a imagem latente de wholemount (recomendado se os anticorpos são adequada, alternativa de abordagem na seção 3.3. e microscopia em 3.4.), transferir de PBS em 50 µ l de soro de burro de 5% em PBS 1x com 0.1% de detergente não iônico (PBST) ao bloco. Rock a noite no 4 oC ou, alternativamente, por 4 horas à temperatura ambiente.
- Transferência de pancreatoids para um novo poço contendo anticorpos primários diluídos em 50 µ l de soro 5% burro em 1 x PBST. Idealmente, rocha por 24 h a 4 oC (pelo menos 12 h mas até 36 h).
Nota: Anticorpos listados na Tabela de materiais contra Chga (1: 100), DBA (1: 400), Vim (1: 400) e Pdx1 (1: 100) são adequados para a coloração de wholemount; outros anticorpos podem exigir a otimização. - Transferência de pancreatoids para um poço contendo 100 µ l de PBST fresca para lavar e rock para 30 min à temperatura ambiente. Repita esta etapa para um total de três lavagens PBST frescos.
- Transferência de pancreatoids para um novo poço contendo anticorpos secundários diluídos em 50 µ l de soro 5% burro em 1 x PBST. Proteger a placa de luz e coloque em 4 oC, balançando para otimamente 24h (pelo menos 12 h mas até 36 h).
Nota: Todos os anticorpos secundários constantes da Tabela de materiais e DAPI contrastante nuclear são adequados para a coloração de wholemount. - Transferência de pancreatoids para um novo poço contendo 100 µ l de 1x PBST e rocha em temperatura ambiente por 30 min. repetir para um total de três lavagens em 1 x PBST. Na terceira e última lavagem, adicionar 300 nM DAPI.
- Finalmente, coloque 100 µ l de limpo PBS e loja em 4 oC, protegido da luz por até uma semana antes de imagens por microscopia confocal, embora os melhores resultados vêm de imagem imediatamente depois da coloração. Para evitar o movimento de pancreatoids durante a imagem latente, mas evitar a secar, coloque cada pancreatoid uma gota de 20 µ l de PBS. Se pancreatoids não permanecem ainda, reduza o volume de PBS.
- Transferência de pancreatoids para um novo poço contendo anticorpos primários diluídos em 50 µ l de soro 5% burro em 1 x PBST. Idealmente, rocha por 24 h a 4 oC (pelo menos 12 h mas até 36 h).
- Para seções congeladas, transferir pancreatoids de PBS para a solução de sacarose 30% durante a noite em 4 óC.
- Adicione mídia incorporação numa bolha sob um microscópio de dissecação. Usando fórceps sob controle microscópico, embeba pancreatoids empurrando suavemente através da incorporação de mídia várias vezes para remover sacarose residual antes de transferir para um bloco de tecido com mídia de encastre congelado.
- Coloque o bloco de tecido em gelo seco até congelado e seção no criostato em 8 µm.
Nota: As seções podem ser armazenadas no óC-80 ou immunostained imediatamente. - Permitem que as seções de-80 oC para descongelar à temperatura ambiente por cerca de 5 min até secar. Desenhar uma barreira hidrofóbica usando a caneta de pap hidrofóbica ao redor do tecido e o bloco usando 5% de soro de burro diluído em 1 x PBST por 30 min à temperatura ambiente.
- Remova a mídia e substitua imediatamente com os anticorpos primários diluídos em soro de burro 5% diluído em 1 x PBST pernoite no 4 oC.
- Remover a solução primária e lavar tecidos três vezes com 1 x PBST por 10 min cada. Em seguida, adicionar solução de anticorpo secundário diluída em soro de burro 5% diluído em 1 x PBST por 1h à temperatura ambiente e proteger os slides da luz.
- Remover a solução secundária e lavar três vezes de slides em 1 x PBST por 10 min cada. Na lavagem final, adicionar 300 nM DAPI.
- Remova a mídia e adicionar mídia de montagem e uma lamela. Loja slides longe da luz em 4 oC até que esteja pronto para a imagem.
4. isolamento do RNA das Pancreatoids para análise de transcrição
- Colete pancreatoids usando borosilicato capilar ligado a uma pipeta de boca com uma ponta de pipeta de µ l 1.000 filtrada para esterilidade e lugar em 500 µ l de solução de tiocianato-fenol-clorofórmio guanidínio ácido em um tubo de 1,5 mL. Armazenar no-80 oC ou proceder de imediato ao isolamento de RNA.
- Para isolamento de RNA, descongelar as amostras no gelo se necessário e adicione 100 µ l de clorofórmio. Vórtice bem e lugar no 4 oC por 15 min. pré-cool uma centrífuga de 4 oC.
- Colocar os tubos em centrífuga e rotação por 20 min em 12.000 g em 4 oC.
- Retire cuidadosamente os tubos para não perturbar a separação das camadas. Usando uma pipeta de 200 µ l, recolher a solução aquosa clara e coloque em um novo tubo de 1,5 mL, deixando para trás uma pequena quantidade para buffer da camada branca da proteína e camada de DNA rosa. Não toque a ponta da pipeta para nada neste processo e não tocar as paredes do tubo de 1,5 mL.
- Adicione 500 µ l de isopropanol 100% para o novo tubo contendo a fase aquosa e o vórtice. Deixe descansar em temperatura ambiente por 20 min, mais tempo no gelo, ou para a precipitação máxima deixe durante a noite-20 oC.
- Centrifugar a 12.000 g durante 15 min à 4 óC a pelota do RNA. Remova o isopropanol sem perturbar o sedimento.
Nota: Como pancreatoids são pequenas, é provável que o sedimento não será visível. - Frio, adicionar etanol 75% e inverter o tubo várias vezes. Coloque na centrífuga e girar a 9.000 x g durante 10 minutos a 4 oC. Remove o etanol e rodada por 2 min a 9.000 x g.
- Use uma pipeta de 200 µ l para remover qualquer restante etanol no tubo, sem contato com a pelota reside na região. Deixe a tampa aberta do tubo para 5-10 min à temperatura ambiente para garantir a evaporação do etanol residual.
- Resuspenda o pellet em vortexing em 20 µ l de água limpa e livre de nuclease.
Opcional: Calor do RNA em 65 oC por 3 min e imediatamente voltar para o gelo. RNA pode ser armazenado no-80 oC ou usado imediatamente para a transcrição reversa e qPCR.
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Representative Results
Dissecção cuidadosa de embriões do rato em e10.5 do corno uterino deve produzir embriões não danificados em PBS para mais dissecação (Figura 1A). O trato gastrointestinal pode ser eficientemente removido do embrião (Figura 1B), permitindo que o discernimento do bud pancreatic dorsal na junção do intestino e estômago (Figura 1C-F). O broto pancreático e10.5 anteriormente tem sido caracterizado; progenitores devem expressar Pdx1, Sox9, Ptf1a e Hes120,21,22,23. Na sequência de etapas de processamento do tecido, dissociadas pancreáticas células individuais ou pequenos grupos de células podem ser visualizados por microscopia de luz (Figura 1G-H).
Na mídia de organogênese, estas células flutuantes, livre de andaime auto-montagem e organizam em pancreatoids tridimensional que crescem e persistir pelo menos dez dias em cultura(Figura 2). Os pancreatoids tem semelhanças morfológicas para o pâncreas na vivo , com ramificação morfogênese ocorrendo. Usando ratos transgénicos, diferentes tipos de células ou processos podem ser monitorados em tempo real. Por exemplo, usando Ins1-eGFP24 ratos para marcar a formação de células endócrinas beta, pancreatoids pode ser fotografada em diariamente para visualizar o desenvolvimento de células beta (Figura 2B). Mais, alterando as condições de cultura, adicionando pequenas moléculas, drogas ou manipular o genoma, não só a determinação do destino de célula pode ser avaliada, mas mudanças na estrutura e morfologia também podem ser investigadas. Aqui nós mostramos a aplicação da proteína quinase C ativador phorbol myristate 12 13-acetato (PMA) em concentrações elevadas (160 nM), que altera a morfologia do desenvolvimento de pancreatoids, levando a vagamente associada a células epiteliais e aumentou a ramificação 19 (Figura 2C).
Para avaliar a associação de tecido pancreático mesênquima com células epiteliais no pâncreas, immunostaining pode ser realizado para marcadores de cada tecido. Immunostaining de marcador de duto,25,DBA26, com um marcador endócrino, Chga27e núcleos marcados por DAPI revelar linhagem multi formação em pancreatoids(Figura 3). Um marcador de mesênquima, vimentina, co manchada com um marcador de progenitoras pancreáticas (a partir de e 9.0 para aproximadamente e15.5) Pdx1, mostra que o mesênquima envolve a pancreatoid (Figura 3B). Immunostaining também pode ser usado para examinar a morfologia, com estruturas de ramificação reveladoras Pdx1, bem como marcadores diferentes tipos de células de interesse. Na Figura 3C, visualizamos o desenvolvimento de células beta por mancha para o marcador epitelial Pdx1 e o marcador de célula beta ins Using qPCR análise, transcrições dos progenitores e diferenciação de células um ser avaliados, tais como genes progenitor Pdx1 e Hes1 e marcadores diferenciados, Prss1, Prss3, Hnf6, Isl1, Nkx6-1 e Ins1 (Figura 4).
Figura 1: esquema de dissecação, dissociação e chapeamento de e10.5 progenitoras pancreáticas para a geração de pancreatoid. (A) a imagem de brightfield do embrião de e10.5. (B) o esquema do processo de dissecação, começando no canto superior esquerdo. O vermelho, as linhas tracejadas indicam regiões de corte, enquanto a região verde é o trato gastrointestinal. Primeiro, a cabeça é removida seguido da remoção dos brotos do membro anterior e a abertura do lado do organismo. (C) o trato gastrointestinal é cuidadosamente removido, com os coração e o fígado gomos salientes da região ventral do tracto. O estômago, intestino e broto pancreático dorsal podem ser visualizados, como mostrado na imagem brightfield. (D) remoção do coração e fígadas gustativas. Esquema está à esquerda e a imagem de brightfield é à direita. (E) Pinching do tecido ao redor o broto pancreático dorsal para expor o broto para dissecação. Esquema está à esquerda e a imagem de brightfield é à direita. (F) o trato gastrointestinal com o broto pancreático dorsal sob microscopia brightfield. Na imagem à esquerda, a curva no intestino é visível, onde fórceps pode ser colocado quando desanexando do trato gastrointestinal da região da coluna vertebral. À direita, a imagem de brightfield alta ampliação mostra ambos os botões do pâncreas dorsais e ventrais. (G) remoção do broto pancreático dorsal e processamento do tecido antes de dissociação, ressuspensão em mídia de organogênese e chapeamento. (H) a imagem brightfield mostra células dissociadas imediatamente após o chapeamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Pancreatoids de monitoramento ao longo do tempo. (A) Brightfield imagens de pancreatoids no dia 1, dia 2 e dia 3. Barras de escala = 100.... (B) manipulação das condições de cultura para investigar a morfogênese do pâncreas. Aqui, a adição de altos níveis de PMA leva a estrutura epitelial afrouxada e aumento de ramificação, como visualizado pela microscopia brightfield no dia 1 e 2. Barras de escala = 100 µm. (C) Ins1-eGFP rato pancreatoids no dia 4, dia 5, dia 6, dia 7 e dia 9, com o desenvolvimento de células beta indicado pelo eGFP em verde. Barras de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Imunocoloração de pancreatoids. (A) pancreatoid de imunocoloração no dia 5 para marcar dutos pelo DBA em células vermelhas, endócrino por Chga em verde e núcleos marcados por DAPI em azul. (B) Immunostaining pancreatoid no dia 7, para marcar o mesênquima por vimentina no vermelhos e no pâncreas progenitores por Pdx1 em verde. (B) Immunostaining pancreatoid no dia 7 para marcar células beta por insulina em vermelhos e pancreáticos progenitores por Pdx1 em verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Análise de transcrição. PCR quantitativo de pancreatoids dia 7 para marcadores de progenitores e diferenciação de células. Comparação na vivo murino tecido é mostrada em Scavuzzo et al (2017). os resultados são normalizados para Gapdh. N = 2, barras de escala são SEM. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Componente de | Abreviatura | Concentração final |
| Penicilina-estreptomicina | P/S | 1% |
| Suplemento de media FBS-free | 10% | |
| Beta-Mercaptoetanol | bME | 0,1 mM |
| Phorbol Myristate 12 13-acetato | PMA | 16 nM |
| Inibidor de Y-27632 ou ROCK | RI | 10... |
| Fator de crescimento epidérmico | FEG | 25 ng/mL |
| R-Spondin1 | - | 500 ng/mL |
| fator de crescimento fibroblástico ácido, fator de crescimento 1 | aFGF, FGF1 | 25 ug/mL |
| Sal de sódio de heparina | Heparina | 2 U/mL |
| Fator de crescimento fibroblástico 10 | FGF10 | 100 ng/mL |
| Dulbecco modificado águia médio/nutriente mistura F-12 | DMEM/F12 | a 5 mL |
Tabela 1. Mídia de organogênese.
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Discussion
A progressão dos modelos de cultura de células é fundamental para corretamente o desenvolvimento de modelos, produzir tipos de células clinicamente relevantes, teste de eficácia de drogas ou até mesmo transplante para pacientes. No entanto, artificialmente recapitulando o desenvolvimento em um prato é um desafio que estamos ainda longe de compreender os mecanismos da organogênese e fisiologia in vivo. Assim, em vitro células são ineficientemente gerado, não totalmente funcional, incapaz de ser mantido por longos períodos de tempo, ou outras anormalidades de células comparáveis no corpo do porto. Isso ocorre porque muitos diferentes tipos de células interagem enquanto complexas alterações morfogenéticas ocorrem para influenciar o desenvolvimento e a fisiologia. Ganhando um entendimento de como o desenvolvimento prossegue, combinando a conveniência do in vitro sistemas mantendo a complexidade do desenvolvimento na vivo iria dar uma valiosa ferramenta para a investigação biomédica.
O desenvolvimento de organoids é uma avenida promissora para as complexidades do desenvolvimento de modelagem. Neste protocolo, descrevem como fazer organoids do pâncreas, denominado pancreatoids, que retêm o mesênquima nativa e robustamente gerar células endócrinas, embora pancreatoids não apresentam capacidade de resposta de glicose. Esta ferramenta pode ser usada para investigar mecanismos de desenvolvimento, bem como a funcionalidade de um sistema de cultura que mantém a heterogeneidade do tecido encontrado na vivo. Além disso, isso pode ser usado para telas de genéticas ou de pequenas moléculas de tela ou drogas. Isto é particularmente interessante, como drogas de candidato testes em sistemas de cultura de células relativamente homogênea podem contornar os efeitos destes compostos em outros tipos de células intimamente relacionados.
Existem várias etapas críticas durante este protocolo. Em primeiro lugar, a remoção cuidadosa de embriões do útero é importante como retirando os embriões com força pode rasgar a região abdominal e torná-lo difícil de discernir o trato gastrointestinal para obter o broto pancreático (etapa 1.3). Em segundo lugar, limpa dissecação do bud pancreatic do tracto gastrointestinal é crítica, como tirar o excesso de tecido pode levar a diferenciação de outros tipos de células (etapa 1.4.4). Para fazer isso, é importante beliscar abaixo o broto pancreático e levante o tecido de sobreposição antes isolando o broto pancreático. Finalmente, ao mover os botões da dispase volta para a PBS para lavar, é imperativo usar um tubo capilar de borosilicato e não deixar o tecido tocar a borda da abertura do tubo, caso contrário, o tecido vai ficar com a ponta do tubo (etapa 1.5.1). Para evitar isso, começa a solução de pipetagem de boca antes de se mudar para o broto, permitindo que o botão de ir para dentro do tubo, e não do lado de fora.
Este método permite a formação de células endócrinas em um 3D pancreatoid, no entanto, a ramificação epitelial é mais limitada do que outros existentes protocolos16,17. Além disso, enquanto células endócrinas produtoras de insulina de forma, eles não apresentam resposta de glicose. Assim, ainda mais investigação sobre a maturação dessas células fornecerá informações valiosas, tanto na geração de pancreatoids funcional, bem como ao campo da geração de células beta em geral.
A geração de pancreatoids que desenvolver células endócrinas, e, no futuro, que obter a resposta de glicose, tem implicações potenciais para o tratamento da diabetes. O diabetes é um candidato principal para terapia regenerativa, como células beta pancreáticas são perdidos ou disfuncional e substituir estas células potencialmente pode aliviar complicações da doença. Foram feitos progressos em diferenciar hPSCs em células beta, no entanto, no diabetes, há frequentemente disfunções para outros tipos de células no pâncreas juntamente com as células beta, incluindo as células alfa ou células acinares28,29, 30,31,32. Assim, gerar novo tecido pancreático para transplante pode substituir integralmente o tecido aflito. Com a investigação adicional de murino pancreatoid Constituição e de funcionamento, a trajetória do desenvolvimento pode ser imitada para gerar humano pancreatoids fora hPSCs. Estes pancreatoids humanas pode ser usados para a medicina personalizada para tela para capacidade de resposta às drogas em um contexto específico do paciente e para terapia regenerativa.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos Jolanta Chmielowiec útil discussão sobre o protocolo e o manuscrito. Agradecemos também Benjamin Arenkiel para acesso ao microscópio confocal. Este trabalho foi financiado pelo NIH (P30-DK079638 para M.B.) e T32HL092332-13-M.A.S e M.B., Fundação médica McNair (para M.B.) e o núcleo confocal no BCM intelectual e inabilidades desenvolventes Research Center (NIH U54 HD083092 da Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional da criança saúde e desenvolvimento humano).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
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