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Developmental Biology

Méthode de Culture organotypique pour étudier le développement des tissus embryonnaires de poulet

doi: 10.3791/57619 Published: August 25, 2018

Summary

Nous présentons ici un organotypique cultivant protocole pour cultiver des organes embryonnaires de poulet in vitro. En utilisant cette méthode, le développement des tissus embryonnaires de poulet peut être étudié, tout en conservant un haut degré de contrôle sur le milieu de culture.

Abstract

Le poulet embryonnaire est couramment utilisé comme un organisme modèle fiable pour le développement des vertébrés. Son accessibilité et son incubation courte période le rend idéal pour l’expérimentation. Actuellement, l’étude de ces voies de développement de l’embryon de poulet est réalisée en appliquant des inhibiteurs et des médicaments à des sites localisés et à de faibles concentrations en utilisant une variété de méthodes. Culture de tissus in vitro est une technique qui permet l’étude des tissus séparés de l’organisme hôte, tout en contournant en même temps beaucoup de limitations physiques présentes lorsque vous travaillez avec des embryons entiers, tels que la susceptibilité des embryons doses élevées de produits chimiques potentiellement mortels. Nous présentons ici un organotypique cultivant protocole pour cultiver le poulet embryonnaire demi tête in vitro, qui présente de nouvelles opportunités pour l’examen des processus de développement au-delà des méthodes actuellement établies.

Introduction

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L’embryonnaire poulet (Gallus gallus) est un organisme d’excellent modèle couramment utilisé dans le domaine de la biologie. Sa période d’incubation est d’environ 21 jours et beaucoup d’oeufs peut être incubés simultanément, rendant les expérimentation rapide et efficace. Peut-être plus important encore, l’embryon est également facilement manipulé, permettant l’étude approfondie des principaux processus de développement et des gènes et des protéines qui animent ces processus.

L’oeil de l’embryon de poulet est un organe complexe qui se développe par l’interaction d’un certain nombre de différents tissus semblables à beaucoup d’autres systèmes de corps. Cette méthode permet l’étude de l’évolution de ces tissus, en particulier à un stade avancé de développement. Par exemple, la rétine multicouche peut être particulièrement intéressante pour ceux qui étudient le développement du système nerveux. Des méthodes alternatives qui permettent l’étude des autres tissus de l’oeil comme la cornée, le corps vitréennes, la lentille, la sclérotique et les paupières sont bénéfiques pour les chercheurs. L’oeil embryonnaire de poulet contient également une série d’os plats, les osselets sclérales, qui peuvent servir de modèle pour l’étude des os intramembranaires induction et l’ossification en vertébrés1.

Actuellement, il existe un certain nombre de méthodes utilisées pour étudier le développement embryonnaire. Microinjections d’anticorps inhibiteurs ou autres molécules inhibitrices de la2,3, implanté chirurgicalement des microbilles imbibé d’inhibiteur4et électroporation5 sont toutes des méthodes pouvant servir à des gènes régulent ou protéines d’intérêt dans un embryon. Des méthodes similaires sont utilisés pour réguler positivement les protéines. Ces méthodes ne sont pas sans leurs limites. Par exemple, lors de l’utilisation de produits chimiques pour modifier le développement embryonnaire, l’effet létal sur l’embryon doit être évalué, et cela limite l’utilisation des méthodes susmentionnées pour les sites localisés d’application à des doses suffisamment bas pour assurer la survie de la embryon.

Culture de tissus in vitro a été utilisée dans un large éventail d’organismes pour étudier le développement et peut être utilisé pour contourner les limitations susmentionnées. Par exemple, les fémurs6et plume bourgeons7,8branches9 du poulet ont tous étudiés à l’aide de tissus cultivant des méthodes, comme ont les testicules des souris10 et les racines et les tiges des plantes11. Ces méthodes accordent aux scientifiques un degré élevé de contrôle sur le développement des tissus, comme la possibilité de varier la température et de modifier la disponibilité des nutriments. L’isolement des tissus de l’embryon entier rend également beaucoup moins sensibles à l’effet létal des produits chimiques, permettant ainsi à des études de manipulation à l’échelle mondiale à des concentrations plus élevées. Un autre avantage notable de la mise en culture in vitro est la préservation de l’environnement cellulaire du tissu ; l’arrangement des tissus reste relativement inchangée, ce qui permet d’étudier les interactions entre les différents tissus types9. Ainsi, in vitro culture ouvre portes supplémentaires expérimentale approches non disponible dans des modèles in vivo ou in ovo .

Actuellement, il est particulièrement difficile d’étudier l’évolution de le œil de poulet embryonnaire à l’aide de produits chimiques. Un certain nombre de membranes extra-embryonnaires couvre l’embryon, rendant difficile l’application de microbilles ou produits chimiques ; l’embryon est également très active dans l’oeuf comme elle vieillit, ce qui complique une méthode déjà difficile. Ce protocole permet un accès facile à le œil et des tissus entourant, en éliminant ces obstacles, tout en offrant de nouvelles possibilités d’examiner les processus de développement intérieur de le œil. Ce protocole a été créé pour étudier l’induction des osselets sclérales intérieur de l’oeil embryonnaire.

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Protocol

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Remarque : Pour les stades de l’embryon, utiliser le Hamburger et Hamilton12 (HH) mise en scène de table.

1. embryon Incubation

  1. Incuber les œufs de poule fécondés dans un incubateur stérile, contrôle de la température à 37 ° C ± 1 ° C et environ 40 % d’humidité.
  2. Tournez les oeufs 1 x par jour et laisser incuber à HH34 (fécondation après 8 jours).

2. préparation et stérilisation du matériel

  1. Pour 12 embryons, autoclave 2 L d’eau distillée, 1 L de solution saline à poussin 0,85 %, 12 pipettes en verre, 1 boîte de mouchoir en papier, 24 2,5 cm x 2,5 cm carrés de papier-filtre semi poreux et carrés de 24 2,5 cm x 2,5 cm de fil d’acier de maille avec les bords courbés vers le bas. Pour stériliser le matériel, autoclave à 121 ° C pendant au moins 15 min.
    Remarque : L’autoclavage des matériaux peut se faire à l’avance.
  2. Stériliser l’incubateur avec l’éthanol à 70 % en l’essuyant les côtés et étagères porte. Placer 2 récipients en plastique contenant autoclavés distillée à l’intérieur de l’incubateur à conserver l’humidité. Préchauffer l’incubateur de culture à 37 ° C ± 1 ° C et environ 40 % d’humidité. S’assurer que l’incubateur est complètement noir ; Si la porte est transparente, couvrez-la de papier d’aluminium.
  3. Réchauffer au préalable les 100 mL de milieu nutritif et 1 mL de pénicilline en les plaçant dans l’incubateur de culture.
  4. Couvrir l’espace de travail avec du papier essuie-tout et stériliser le banc en vaporisant avec l’éthanol à 70 %. Stériliser 2 paires de pinces, ciseaux de dissection, une lame de rasoir et une cuillère en plastique avec l’éthanol à 70 % de la même manière.
  5. Plats de Pétri stérile 100 mm lieu 12 et 24 boîtes de Pétri stériles 35 mm sur le banc pour utilisation. S’assurer que les plats restent dans un sachet stérile jusqu'à utilisation.

3. préparation de l’embryon

NOTE : Partir de là, porter un masque de protection poussière pour éviter de contaminer les cultures. Une infection bactérienne ou fongique va ruiner la culture, et il y a un risque de s’étendre rapidement à toutes les cultures dans l’incubateur.

  1. Crack ouvrir le œuf et transférer l’embryon à un 100 mm boîte de Pétri contenant du sérum physiologique poussin à 0,85 %. Stade de l’embryon selon les caractéristiques anatomiques décrites dans le Hamburger et Hamilton, mise en scène de directives12 et confirmer l’embryon est à HH34.
  2. Couper le cou et puis coupent la tête de l’embryon à la ligne médiane à l’aide d’une lame de rasoir stérilisée. À l’aide d’une pince stérile, enlever le cerveau. Le bec laisse intacte.

4. culture Setup

  1. 2 place de la Pétri de 35 mm à l’intérieur d’une boîte de Pétri 100 mm.
  2. Placer un treillis en acier à l’intérieur de chaque boîte de Pétri 35 mm.
  3. À l’aide de pinces, transférer 1 des têtes coupées à un morceau de papier filtre semi poreux de 2,5 cm x 2,5 cm avec le œil vers le haut. S’assurer que le tissu est sécurisé et ne glisse pas éteint en l’inclinant légèrement.
  4. À l’aide de pinces, placer soigneusement les tissus de le œil et le filtre en papier sur le dessus de la maille de fil d’acier en 1 des boîtes de Pétri le 35 mm, créant une scène surélevée avec les tissus de le œil sur le dessus.
  5. Répétez les étapes 4.3 et 4.4 avec l’autre moitié de tête.
  6. À l’aide d’une pipette de verre stérile, ajouter avec précaution le milieu nutritif directement dans chaque boîte de Pétri 35 mm jusqu'à ce qu’il atteigne le niveau du papier-filtre. Ne pas immerger la moitié de la tête dans le milieu nutritif.
  7. Ajouter 50 µL de 10 000 U/mL de pénicilline-streptomycine dans le milieu nutritif dans chaque boîte de Pétri.
  8. Plier un morceau de papier de soie dans un petit carré et le placer à l’intérieur de la boîte de Pétri de 100 mm. Humidifier avec de l’eau distillée autoclavé.
  9. Placez la boîte de Pétri dans l’incubateur stérile, sombre à 37 ° C ± 1 ° C et environ 40 % d’humidité pendant 4 jours.
  10. Répétez les étapes 3 et 4 pour chaque embryon.
    Remarque : Le nombre d’embryons nécessaire dépendra de l’expérience spécifique ; Nous décrivons ici le protocole pour 12 embryons.

5. culture entretien

  1. Une fois par jour, remplir les contenants de plastique dans l’incubateur avec l’eau distillée froide, stérilisés à l’autoclave.
  2. Tous les jours, vérifier toutes les cultures pour des infections bactériennes ou fongiques. Cultures qui se sont désintégrées ou dans lequel le milieu a changé de couleur sont infectés. Jeter toutes les cultures qui sont infectés.

6. fixation

  1. Après mise en culture, sortir tous les plats de l’incubateur.
  2. À l’aide d’une paire de pinces, retirez délicatement le œil du papier filtre, prenant soin de ne pas pour déchirer le tissu.
  3. Fixer le tissu oculaire dans 4 % de paraformaldéhyde dans 1 x tampon phosphate salin pendant la nuit à 4 ° C ou 10 % de formol tamponné neutre durant la nuit à température ambiante.
  4. Stocker les tissus à 4 ° C en 1 x solution saline tamponnée au phosphate.

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Representative Results

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En utilisant cette méthode, un oeil embryonnaire de poulet peut être cultivé de jour 8 de son développement (HH34) in vitro pendant 4 jours. Quatre jours de in ovo développement correspond à HH38.

Cette méthode de culture soutient le développement des bourgeons de plumes autour de le œil et des paupières (Figure 1 b). Ces bourgeons de plumes ne sont pas présents dans ovo à HH34 avant la mise en culture (Figure 1 a), ce qui indique que le développement des bourgeons plume est initié au cours de la période de culture, car il est en ovo13 (Figure 1). Les paupières et la membrane nictitante se développer pour couvrir l’oeil au cours de la culture (Figure 1 b). Les paupières apparaissent plus matures après le in vitro culture qu’au début de la mise en culture à HH34 (Figure 1 a) mais ils sont moins développé que celui à HH38 (Figure 1). Ces données montrent que les aspects clés du développement embryonnaire sont pris en charge, mais avec un petit retard.

Après mise en culture, nous avons disséqué la portion antérieure de le œil pour montrer les papilles conjonctivales (un anneau transitoire de protubérances épithéliales de 13-14), qui agissent comme un repère indiquant que les événements du développement sont pris en charge dans la culture. En règle générale, ces papilles sont entièrement formés par HH34 (Figure 1) et dégénéré au fil du temps car ils induisent des condensations de skeletogenic dans le mésenchyme sous-jacent ; ils disparaissent par HH381 (Figure 1F). Nos données montrent que cette dégénérescence produit in vitro (Figure 1E) et qu’elle est précédée d’un aplatissement des papilles suivant le modèle en ovo de développement. Non souillées enregistré de condensations, cependant, ne sont pas visibles dans les échantillons en vitro , contrairement à HH38 (Figure 1F). Nous avons utilisé la coloration, la phosphatase alcaline qui permet de détecter l’activité ostéoblastique précoce pour évaluer plus précisément l’induction de ces condensations14; Ce processus se produit aux côtés de la dégénérescence de la papilles conjonctivales dans ovo. L’induction des condensations skeletogenic, qui commence à HH34 (Figure 1), se livre en vitro comme en témoigne la phosphatase alcaline, coloration (Figure 1 H). Ces condensations, cependant, sont pas aussi grande qu’ils sont à HH3814 (Figure 1I), à nouveau indiquant qu’il y a un petit retard dans la mise au point. Nous estimons que les 4 jours de culture représentent environ 2 jours du développement embryonnaire ; d'où un retard d’environ 50 %. Collectivement, ces résultats démontrent que l’induction et le développement des os intramembranaires, les condensations sclérales, est pris en charge in vitro et que les processus de développement tels que la croissance de la paupière et la formation des bourgeons plume procéder vitro.

Figure 1
Figure 1 . Caractéristiques morphologiques des in vitro cultivées des yeux, des yeux HH34 et yeux HH38. A - F sont incolores et G - j’ai sont colorés pour l’enzyme phosphatase alcaline (PA) distinguer les ostéoblastes actifs dans les condensations sclérales. A, Det G Voir l’yeux au début de la période de culture au HH34. B, Eet H montrent les yeux après 4 jours de mise en culture in vitro . C, Fet j’ai montrent les yeux après 4 jours d’in ovo cultivant, à HH38. Tous les regards sont vue latérale. (A) la conjonctive papilles sont visibles dans un anneau autour de la cornée. L’astérisque indique papille #12, l’une pour la forme. La flèche indique le bord de la paupière dans la région nasale de le œil. (B) les papilles conjonctivales ont aplati et commencé à dégénérer. La flèche indique un bourgeon croissante de la plume. (C) la conjonctive papilles ont complètement dégénéré et sont couverts par les paupières et la membrane nictitante. La flèche ouverte indique le bord de la paupière dans la région nasale de le œil. La flèche pleine indique un bourgeon croissante de la plume. (D) A disséqué portion antérieure de le œil HH34. L’astérisque indique papille #12. (E) A disséqué la partie antérieure d’un HH34 + 4 oeil in vitro montrant papilles aplaties. Les papilles dans la région temporale (flèche pleine) ont commencé à dégénérer ; Ce sont les papilles plus anciennes dans le ring. (F) A disséqué partie antérieure d’un oeil de HH38 avec les paupières et les membranes nictitantes enlevés, montrant que toutes les papilles ont dégénéré. Les lignes tiretées décrivent la position de deux condensations non-colorées adjacentes. (G) A HH34 yeux colorés pour AP montrant des condensations de très petites skeletogenic indicative du début de l’induction. HH34 A (H) + 4 yeux colorés pour AP liste élargie, condensations skeletogenic de plus en plus. (I) A HH38 yeux colorés pour AP montrant des condensations de grandes skeletogenic. Toutes les barres d’échelle sont mm 1. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

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Ce protocole utilise des tissus établie des techniques de culture pour atteindre la croissance d’un oeil de poulet embryonnaire jour 8 (HH34) in vitro pendant 4 jours. Cette méthode de mise en réseau-culture a été initialement décrite par Trowell15. Nous avons optimisé un protocole de Pinto et Hall 1991 étude16 utilisant une membrane semi poreuse avec le réseau pour étudier les signaux inductifs entre les couches de tissus séparés des yeux embryonnaires de poulet15. En utilisant cette méthode, Roach cultivées âgé de 14 jour poulet fémur6. Cette méthode est également révélée efficace en cultivant la souris tissus6,17. L’utilisation du papier filtre est essentielle à la réussite du protocole car il aide les tissus à relever les éléments nutritifs du milieu efficacement sans saturer ou plongeant le tissu.

Milieu nutritif à un pH adéquat est essentiel pour une croissance optimale. Le support doit être à ou proche du pH physiologique et l’utilisation de rouge de phénol dans le milieu comme un indicateur fournit un avantage car les changements de pH peuvent être facilement détectés. Sans sérum peut être utilisé, et changer les médias tous les jours n’est pas nécessaire et n’affecte pas les résultats. Le protocole a été développé à l’aide d’un support disponible dans le commerce (voir Table des matières), qui contient des niveaux élevés d’acides aminés et de glucose ; aucun autre supplémentation des médias n’est nécessaire. La plupart des occurrences de la croissance des tissus pauvres utilisant ce protocole s’est produite lorsque le milieux nutritifs était soit à un mauvais pH ou contaminés.

Le œil peut survivre et se développer pendant jusqu'à 4 jours in vitro, à partir d’embryonnaire jour 8, lorsque le protocole est réalisé dans des conditions optimales. Une des limites du présent protocole est que les chances de survie est affectée au-delà de 4 jours de culture. Ainsi, les processus de développement qui s’étendent sur une période plus longue exigera des modifications au protocole. Une autre limitation du protocole est l’absence d’un débit sanguin actif et la vascularisation. Les vaisseaux sanguins sont importants pour de nombreux processus du développement, non seulement pour l’apport de nutriments vers les tissus9, qui est réalisée in vitro par capillarité à travers le filtre de papier sur lequel repose le tissu.

Ce protocole peut être utilisé pour étudier le développement d’organes entières ou de gros morceaux de tissus in vitro. Organes de vertébrés sont extrêmement complexes et leur développement est régi par plusieurs patrons spatio-temporels distincts. L’étude de ces voies de développement s’appuie sur la capacité de manipuler les signaux qui régulent leur. Les méthodes actuelles de limitent cette manipulation relativement petites zones localisées et à des concentrations suffisamment faibles pour éviter la létalité embryonnaire. Par exemple, la méthode ex ovo de culture de l’embryon de poulet entier dans la culture18 ou la méthode à fenêtre oeufs19 afin d’effectuer des manipulations sont limités, que l’embryon soit ensemble doit être traité, qui peuvent causer la létalité, ou seulement une petite zone localisée est traitée. L’avantage du protocole présenté ici est que l’effet de ces signaux peut être étudiée sur les organes entières ou de grandes quantités de tissus, sans affecter la viabilité embryonnaire. Ce protocole ne nécessite pas toute supplémentation en dioxyde de carbone comme précédents protocoles15. Le retard dans le développement que nous avons observé est un avantage dans ce processus de développement rapides peuvent être étudiés.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs voudrais remercier Gregory Haller (Mount Saint Vincent University) pour son travail préliminaire à l’élaboration du protocole. Les auteurs tiens également à remercier Nicholas Jones (Mount Saint Vincent University) pour son expertise technique et d’assistance avec le tournage et la production de la portion audio/visuel du manuscrit. Daniel Andrews a été appuyée par le financement de l’Université Mount Saint Vincent et les Sciences naturelles et génie conseil recherche du Canada (CRSNG) le via une bourse de recherche de premier cycle. Tamara A. Franz-Odendaal est soutenue par une subvention à la découverte du CRSNG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm cell culture petri dishes Corning 353001 easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic
100 mm cell culture petri dishes Corning 353003 tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic
paper tissue Kimtech 34155 Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton
wire mesh n/a n/a stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm)
disposable glass pipettes VWR 14673-010 Borosilicate glass disposable 5 3/4"
nutrient medium Gibco 12591-038 Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB)
penicillin-streptomycin Sigma-Aldrich P4458 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised
filter paper Whatman 1454 090 semi-porous filter paper 90mm
fertilized chicken eggs Dalhousie University Agricultural College n/a can be obtained from local farms
sodium chloride (NaCl) EMD SX0420-3 sodium chloride crystals, reagent grade
1 L glass bottle VWR 89000-240 1 L pyrex autoclavable glass bottle
ethanol Fisher Scientific BP82011 70% molecular biology grade
tupperware containers n/a n/a store-bought and sterilized with EtOH
disposable razor blades VWR 55411-050 single edge industrial razor blades (surgical carbon steel)
plastic spoons n/a n/a store-bought and sterilized with EtOH
dust mask 3M n/a 3M 8500 Comfort Mask
paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 paraformaldehyde, reagent grade, crystalline
neutral-buffered formalin Fisher Scientific 72210 10% neutral buffered formalin
phosphate buffered saline (PBS) n/a n/a 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4)
15 ml falcon tubes VWR 21008-216 presterilized centrifuge tubes
forceps FST n/a fine forceps
chick saline  n/a n/a  0.85% NaCl
tinfoil n/a n/a store-bought
paper towel n/a n/a store-bought

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References

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Méthode de Culture organotypique pour étudier le développement des tissus embryonnaires de poulet
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Cite this Article

Andrews, D. D. T., Franz-Odendaal, T. A. Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues. J. Vis. Exp. (138), e57619, doi:10.3791/57619 (2018).More

Andrews, D. D. T., Franz-Odendaal, T. A. Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues. J. Vis. Exp. (138), e57619, doi:10.3791/57619 (2018).

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