Genom-dækkende overvågning af transskription fejl i Eukaryote organismer
Summary
Denne protokol giver forskere et nyt værktøj til at overvåge troskab af transkription i flere modelorganismer.
Abstract
Nøjagtig transskription er nødvendig for den trofaste udtryk for genetisk information. Overraskende selv, lidt er kendt om de mekanismer, der styrer troskab i transskription. For at udfylde dette hul i den videnskabelige viden, optimeret vi for nylig cirkel-sekventering assay til påvisning transskription fejl i hele transkriptom af Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasterog Caenorhabditis elegans. Denne protokol vil give forskere med en kraftfuld ny værktøj for at kortlægge landskabet af transskription fejl i eukaryote celler, således at de mekanismer, der styrer troskab i transskription kan blive belyst i hidtil uset detalje.
Introduction
Genomet giver en præcis biologiske blueprint af liv. For at gennemføre denne plan korrekt, er det vigtigt for genom til blive transskriberet med stor præcision. Transskription er imidlertid usandsynligt, at være fejlfri. For eksempel, RNA polymeraser har længe været kendt for at være fejlbehæftet in vitro-1,2, og for nylig blev det vist, at de begår fejl i vivo samt3,5,6, især når de konfronteres med DNA skader7,8,9,10. Taget sammen, tyder disse observationer på at transskription fejl ske løbende i alle levende celler, tyder på, at de kunne være en potent kilde af muterede proteiner.
Denne proces kaldes transkriptionel mutagenese, adskiller sig fra klassisk mutagenese på to måder. Først, i modsætning til genetiske mutationer, transskription fejl påvirker både mitotiske og post mitotiske celler, som de ikke afhænger af DNA-replikation. At studere de mekanismer, der påvirker troskab af transkription vil derfor give værdifuld indsigt i mutation belastningen af både mitotiske og post mitotiske celler. Interessant, transskription fejl har for nylig været involveret i fremme af protein sammenlægning11,12,13 , og har været en hypotese for at bidrage til både carcinogenese10 og den udvikling af antibiotikaresistens i bakterier14.
For det andet, i modsætning til genetiske mutationer, transskription fejlene er forbigående karakter. Deres midlertidige eksistens er særligt udfordrende, fordi det gør transskription fejl overordentlig svært at opdage. For eksempel, mens flere laboratorier har udtænkt værdifulde reporter assays til studiet af transcriptional mutagenese, er disse assays kun kunne måle transskription fejl i et begrænset antal sammenhænge og model organismer4,15. For at overvinde disse begrænsninger, mange forskere har henvendt sig til RNA sekventering teknologi (RNA-FF.), som teoretisk kan transskription fejl registreres i hele transkriptom af enhver art. Disse undersøgelser er dog let forvirret af bibliotek konstruktion artefakter, som reverse transkription fejl, PCR forstærkning fejl og fejlbehæftet art sekventering selv. For eksempel, begå reverse transcriptases cirka én fejl hver ~ 20.000 baser, mens RNA polymeraser (RNAPs) forventes at gøre kun én fejl hver 300.000 baser5,6. Fordi fejlrate på reverse transkription alene dværge fejlrate af RNA polymeraser inde i cellerne, er det næsten umuligt at skelne sande transskription fejl fra artefakter forårsaget af bibliotek forberedelse i traditionelle RNA-Seq data ( Figur 1a).
For at løse dette problem har udviklet vi en optimeret version af cirkel-sekventering (Cirseq, eller C-seq fremover) assay5,16. Denne analyse tillader bruger hen til opdager transskription fejl og andre sjældne varianter i RNA hele transkriptom5. Cirkulære-sekventering analysen bærer dette navn, fordi et vigtigt skridt i denne analyse kredser omkring RNA circularization. Når RNA mål er circularized, er de omvendt transskriberet i en rullende cirkel mode, til at producere lineær cDNA molekyler, der indeholder mange kopier af den samme RNA skabelon. Hvis en fejl var til stede i en af disse skabeloner, vil denne fejl også være til stede i hver enkelt gentagelse indeholdt i cDNA-molekyle. Derimod fejl indført ved reverse transkription, PCR-amplifikation eller sekventering tendens til at opstå tilfældigt, og dermed vil være til stede i kun én eller to gentagelser. Således, ved at generere en konsensus sekvens for hver cDNA molekyle, og skelne tilfældige fejl fra fejl, der opstår i alle gentagelser, bibliotek konstruktion artefakter kan effektivt adskilles fra sande transskription fejl (figur 1b).
Hvis de bruges rigtigt, C-seq analysen kan bruges til at præcist afsløre sats af basen erstatningsvarer, indsættelser og sletninger i RNA hele transkriptom af enhver art (for eksempel Se Traverse og Ochman17). For eksempel, har vi brugt C-seq analysen for at give genome-wide målinger af fejlprocenten af transkription i Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasterog Caenorhabditis elegans med en enkelt base opløsning5 (upublicerede observationer). Oprindeligt brugt til at præcist sekvens RNA-virus populationer, er denne optimeret version af C-seq assay blevet strømlinet for at minimere barske betingelser under udarbejdelsen, bibliotek, der bidrager til biblioteket konstruktion artefakter. Derudover ved hjælp af en række af kommercielt tilgængelige kits, er gennemløb af analysen væsentligt forbedret, samt dens brugervenlighed. Hvis de bruges rigtigt, kan dette assay præcist afsløre tusindvis af transskription fejl pr. replikat, derved høj grad forbedre på tidligere studier6. Samlet set denne metode giver en kraftfuld værktøj til at studere transcriptional mutagenese og vil tillade brugeren at få ny indsigt i de mekanismer, der styrer troskab af transkription i en bred vifte af organismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her, beskriver vi en optimeret protokol for forberedelse af C-seq biblioteker til påvisning af transskription fejl i Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasterog Caenorhabditis elegans. Denne protokol har mange fordele i forhold til eksisterende protokoller, såvel som alternative teknikker.
I de sidste 15 år, er der blevet udviklet talrige reporter systemer, der er afhængige af luciferase7,8 eller …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne publikation blev muliggjort af finansiering fra grant T32ES019851 (til C. Fritsch), give R01AG054641 og efterforsker AFAR unge (M. Vermulst).
Materials
| RiboPure RNA purification kit | ThermoFisher | AM1926 | Total RNA purification |
| Genelute mRNA purification kit | Sigma-Aldrich | MRN70-1KT | mRNA purification |
| Nuclease-free Water | Ambion | AM9937 | Elution and dilution |
| Ambion RNase III | ThermoFisher | AM2290 | RNA fragmentation |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204S | RNA circularization |
| Ribolock | ThermoFisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18080044 | Rolling circle reverse transcription |
| 10 mM dNTP mix | ThermoFisher | 18427013 | Rolling circle reverse transcription |
| Random hexamers (50 ng/µl) | ThermoFisher | N8080127 | Rolling circle reverse transcription |
| NEB Second Strand Synthesis Module | New England Biolabs | E6111S | Second Strand Synthesis |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7370S | cDNA library preparation |
| NEB Next index primers | NEB | E7335S | Multiplex PCR primers |
| Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | D4061 | Clean up of RNA and DNA samples |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Magnetic bead purification |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic bead purification |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | FisherScientific | 05-403-93 | centrifugation |
| INCU-Shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | Cell culture |
| T100 Thermal Cycler | BIO RAD | 1861096 | Medium to High temperature cycling conditions |
| PTC-200 Thermal Cycler | GMI | 8252-30-0001 | Low temperature cycling conditions |
| RNase Away | Molecular Bioproducts | 700S-11 | Sterilization |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning | 430290 | Nuclease-free |
| 15 ml Centrifuge Tube | Corning | 430052 | Nuclease-free |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Nuclease-free |
| 4200 Tapestation System | Agilent | G2991AA | Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| High Sensitivity RNA Screen Tape | Agilent | 5067-5579 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5577 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5578 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | Double stranded DNA quality control |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | Quality control for double stranded cDNA samples |
| Water Bath | VWR | 462-0244 | Incubation |
| NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000C | Determination of RNA concentration |
References
- Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
- Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
- Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
- Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532 (2014).
- Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484 (2017).
- Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
- Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
- Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
- Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
- Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
- Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065 (2015).
- van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer’s disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
- van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer’s and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
- Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
- Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
- Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
- Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
- Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Kent, W. J. BLAT–the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36 (2013).
- Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
- Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).
