Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

FM farvestof cykling på Synapse: sammenligning af høje kalium depolarisering, elektriske og Channelrhodopsin Stimulation

Published: May 24, 2018 doi: 10.3791/57765
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development, Vanderbilt University and Medical Center

Summary

Synaptic vesikel (SV) cykling er den centrale mekanisme for intercellulær kommunikation på neuronal synapser. FM farvestof optagelse og udgivelse er det primære middel til kvantitativt boltpistoler SV endo- og exocytose. Her, sammenligner vi alle stimulation metoderne til at drive FM1-43 cykling på Drosophila neuromuskulære junction (NMJ) model synapse.

Abstract

FM farvestoffer anvendes til at studere den synaptiske vesikel (SV) cyklus. Disse amphipathic sonder har en hydrofil hoved og hydrofobe hale, hvilket gør dem vandopløselige med evnen til at reversibelt indtaste og afslutte membran lipid dobbeltlag. Disse styryl farvestoffer er relativt ikke-fluorescerende i vandigt medium, men indsættelse i den ydre folder af plasmamembran forårsager en > 40 X stigning i fluorescens. I neuronal synapser, er FM farvestoffer internaliseret under SV endocytose, trafikerede både inden for og mellem SV pools og frigivet med SV exocytose, at levere et kraftfuldt værktøj til at visualisere præsynaptiske stadier af neurotransmission. En primær genetiske model af glutamatergic synapse udvikling og funktion er Drosophila neuromuskulære junction (NMJ), hvor FM farvestof imaging har været udbredt til at kvantificere SV dynamics i en bred vifte af mutant betingelser. NMJ synaptic terminal er let tilgængelige, med en smuk vifte af store synaptic boutons ideel til imaging applikationer. Her, vi sammenligner og kontrast de tre måder at stimulere Drosophila NMJ at drive aktivitet-afhængige FM1-43 farvestof optagelse/release: 1) bad anvendelsen af høj [K+] depolarisere neuromuskulære væv, 2) suge elektrode motoriske nerve stimulation til depolarisere den præsynaptiske nerve terminal, og 3) målrettet transgene udtryk af channelrhodopsin varianter for lys-stimuleret, fysisk kontrol af depolarisering. Hver af disse metoder har fordele og ulemper for studiet af genetiske mutation effekter på SV cyklus på Drosophila NMJ. Vi vil diskutere disse fordele og ulemper ved at bistå udvalg af stimulation tilgang, sammen med de metoder, der er specifikke for hver strategi. Ud over fluorescerende imaging, kan FM farvestoffer være photoconverted til elektron-tætte signaler visualiseres ved hjælp af transmissions elektronmikroskopi (TEM) for at studere SV cyklus mekanismer på ultrastrukturelle niveau. Vi levere sammenligninger af Konfokal og elektronmikroskopi imaging fra de forskellige metoder til Drosophila NMJ stimulation, til at hjælpe med at guide udvælgelse af fremtidige eksperimentelle paradigmer.

Introduction

Smukt karakteriseret Drosophila larve neuromuskulære junction (NMJ) glutamatergic synapse model er blevet brugt til at studere synapse dannelsen og funktionen med et stort spektrum af genetiske perturbationer1. Motor neuron terminal består af flere axon filialer, hver med mange udvidede synaptic boutons. Disse rummelige varicosities (op til 5 µm i diameter) indeholder alle neurotransmission maskiner, herunder ensartet glutamatergic synaptiske vesikler (SVs; ~ 40 nm i diameter) i cytosole reserve og let frigøres swimmingpools2. Disse vesikler dock på de præsynaptiske plasmamembran fusion site aktive zoner (AZs), hvor exocytose medierer glutamat neurotransmitter frigivelse for trans-synaptic kommunikation. Efterfølgende, er SVs hentet fra plasma-membran via kys og Kør genanvendelse eller clathrin-medieret endocytose (CME) for gentagne exo/endocytose cyklusser. Drosophila NMJ er let tilgængelig og velegnet til både isolerer og karakteriserer SV cyklus mutanter. Brug fremad genetiske skærme, har roman mutationer ført til identifikation af nye gener kritisk for SV cyklus3. Desuden har omvendt genetiske tilgange starte med allerede kendte gener ført til udredning af nye SV cyklus mekanismer gennem en omhyggelig beskrivelse af mutant cykling fænotyper4. Drosophila NMJ er næsten ideel som en eksperimentel synaptic forberedelse til dissekere SV endocytose og exocytose mekanismer via metoder til optisk bane vesikel cykling under neurotransmission.

En vifte af fluorescerende markører tillader visuel sporing af vesikler cyklet dynamics, men den mest alsidige er FM dye analoger, som er først syntetiseret af Mao, F., mfl. 5. strukturelt, FM farvestoffer indeholder en hydrofil hoved og en lipofile hale forbundet gennem en aromatisk ring, med en central region giver spektrale egenskaber. Disse styryl farvestoffer partition reversibelt i membraner, ikke 'flip-flop' mellem membran foldere og så er aldrig fri i cytosol, og er langt mere fluorescerende i membraner end vand5. Vendbar indsættelse i en lipid tolagede forårsager en 40-fold stigning i fluorescens6. På neuronal synapser består klassiske FM farvestof mærkning eksperimenter af badning i synaptic forberedelse med farvestof under depolariserende stimulation at indlæse farvestof via SV endocytose. Eksterne farvestof er derefter skyllet væk og SV cyklus er anholdt i en calcium-gratis ringetone løsning til billede indlæst synapser7. En anden runde af stimulation i et farvestof-gratis bad udløser FM udgivelse via exocytose, en proces, der kan efterfølges af måling fluorescens intensitet faldet. SV befolkninger fra en enkelt vesikel til puljer, der indeholder hundredvis af blærer kan være kvantitativt overvågede6,7. FM farvestoffer har været brugt til at dissekere aktivitet-afhængige mobilisering af funktionelt adskilte SV pools og sammenligne kys-og-Kør vs CME cykling8,9. Metoden er blevet ændret til separat assay fremkaldte, spontan og miniature synaptic cyklus aktiviteter (med meget følsomt udstyr til at detektere meget små fluorescens ændringer og reducere photobleaching)10. Assays kan udvides til at omfatte de ultrastrukturelle niveau af photoconverting de fluorescerende FM signal i en elektron-tætte etiket for transmissions Elektron Mikroskopi11,12,13,14 .

Historisk set, badning synaptic præparater i en høj koncentration af kalium (i det følgende benævnt "høj [K+]") har været den foretrukne metode for depolariserende stimulation for at fremkalde SV cykling; lige fra den frog kolinerge NMJ5, til kulturperler gnaver hjernen hippocampus neuroner15, Drosophila glutamatergic NMJ model16,17. Denne høje [K+] tilgang er simpelt, kræver ingen specialiseret udstyr, og er derfor tilgængelig for de fleste labs, men har begrænsninger for både program og data fortolkning. En langt mere fysiologisk passende metode er at bruge suge elektrode elektrisk stimulation af nerve4,5,12. Denne tilgang drev aktionspotentialet formering for direkte stimulering af den præsynaptiske nerve terminal, og resultaterne kan sammenlignes direkte med elektrofysiologiske assays neurotransmission funktion13,14, 15, men kræver specialudstyr og er teknisk meget mere udfordrende. Med fremkomsten af optogenetics har brug af channelrhodopsin neuronal stimulation yderligere fordele, herunder stramme spatiotemporelle kontrol af kanal udtryk ved hjælp af den binære Gal4/UAS system20. Denne tilgang er teknisk meget nemmere end at suge elektrode stimulation og kræver ikke andet end en meget billige LED lyskilde. Her, vi anvender billeddannelse af FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide) til både at sammenligne og kontrast disse tre forskellige stimulation metoder på Drosophila NMJ: simple høj [K+ ], udfordrende elektriske og nye channelrhodopsin metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. larve lim dissektion

  1. Blandes grundigt 10 dele af silikoneelastomer base med 1 del af silikoneelastomer hærdning agent fra elastomer kit (Tabel af materialer).
  2. Coat 22 x 22 mm glas coverslips med elastomer og kur på en varm tallerken på 75 ˚C i flere timer (indtil ikke længere klæbrig at røre).
  3. Sted en enkelt elastomer-belagt glas coverslip ind i custom-made plexi glas dissektion salen (figur 1, bund) som forberedelse til larve dissektion.
  4. Forberede lim pipetter fra borsilikatglas kapillarrør ved hjælp af en standard mikroelektrode aftrækker at opnå den ønskede tilspidsning og tip størrelse.
  5. Forsigtigt bryde ud mikropipette spids, og til anden enden, vedhæfte 2 ft af fleksibelt plastik rør (1/32" indvendige diameter, ID 3/32" udvendig diameter, OD; 1/32" væg; Tabel over materialer) med munden montering (P2 pipette tip).
  6. Fylde en lille container (0,6 mL Eppendorf rør cap) med en lille mængde (~ 20 µL) lim (Table of Materials) som forberedelse til larve dissektion.
  7. Fyld salen med saltvand (i mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, 70 saccharose og 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic syre (HEPES) pH 7,2.
  8. Tilføje anti-peberrodspulver peberrodsperoxidase (HRP)-antistof konjugeret til Alexa Fluor 647 (anti-HRP:647, fortyndet 1:10 fra en 1 mg/mL lager) for mærkning af NMJ præsynaptiske terminal under dissektion21,22.
  9. Ved hjælp af en fin pensel (størrelse 2), fjerne en omvandrende tredje instar fra mad hætteglas og placere på elastomer-belagt cover glas.
  10. Fyld glasset mikropipette spids med en lille mængde lim ved hjælp af negativt lufttryk genereret af munden med vedhæftet fil (trin 1,5).
  11. Position larve dorsale side op med pincet og lim hovedet til den elastomer-belagt coverslip med en lille dråbe lim med positive lufttryk ved munden.
  12. Gentag denne procedure med den bageste ende af larver, og sørg for, at dyret er strakt stramt mellem de to lim vedhæftede filer.
  13. Ved hjælp af saks (blade 3 mm; Tabel af materialer), foretage en horisontal nedskæring (~ 1 mm) på posterior og et lodret snit langs svinekroppens midterlinje.
  14. Ved hjælp af fine pincet (#5, Tabel af materialer), forsigtigt fjerne dorsale luftrøret, gut, fedt kroppen og andre indre organer, der dækker muskulaturen.
  15. Gentag proceduren for limning for de fire kroppen væggen flaps, og sørg for at forsigtigt strække kroppen væggen både horisontalt og vertikalt.
  16. Løft den ventrale nerve ledningen (VNC) ved hjælp af pincet, skær forsigtigt de motoriske nerver med saksen, og derefter helt ophæve VNC.
  17. Erstatte dissektion saltvand med Ca2 +-gratis saltvand (samme som ovennævnte dissektion saltvand uden CaCl2) for at stoppe SV cykling.

2. valgmulighed 1: Høj [K+] FM farvestof lastning

  1. Fra en FM1-43 stamopløsning (4 mM), tilsættes 1 µL 1 mL 90 mM KCl løsning (høj [K+] i dissektion saltvand) til en slutkoncentration på 4 µM.
  2. Ved hjælp af en pipette, erstatte Ca2 +-gratis saltvand i imaging salen med høj [K+] FM farvestof løsningen at stimulere SV endocytose farvestof optagelse.
  3. Straks starte en digital timer til forudbestemte varigheden af høje [K+] depolariserende stimulation periode (fx., 5 min; Figur 2).
  4. For at bekræfte en sunde larver forberedelse, Bemærk de stærke sammentrækninger af muskulaturen for varigheden af perioden høj [K+] depolarisering.
  5. Når den tidtager udløber, hurtigt at fjerne den høje [K+] FM farvestof løsning og erstatte med Ca2 +-gratis saltvand til at stoppe SV cykling.
  6. Vask i hurtig rækkefølge med Ca2 +-gratis saltvand (5 x til 1 min) til at sikre høj [K+] FM farvestof løsning er helt fjernet.
  7. Opretholde den larve forberedelse i frisk Ca2 +-gratis saltvand for øjeblikkelig imaging med Konfokal mikroskop.

3. billedbehandling: Konfokalmikroskopi

  1. Bruge en opretstående Konfokal mikroskop med en 40 X vand fordybelse mål til billede NMJ farvestof fluorescens (andre mikroskoper kan bruges).
  2. Billede muskel 4 NMJ abdominal segmenter 2-4 (andre NMJs kan være afbildet) og indsamle billeder ved hjælp af passende software (Tabel af materialer).
  3. Brug en HeNe 633 nm laser til at ophidse HRP:647 (med long-pass filter > 635 nm) og en Argon 488 nm laser til at ophidse FM1-43 (med bandpass filter 530-600 nm).
  4. Operationelt bestemme optimal gevinst og forskydning for begge kanaler.
    Bemærk: Disse indstillinger vil forblive konstante i resten af forsøget.
  5. Tage en Konfokal Z-stak gennem den hele valgte NMJ fra HRP-mærket toppen til bunden af synaptic terminalen.
  6. Notere omhyggelig NMJ afbildet (segment, side og muskel) for at sikre overskydende til den nøjagtige samme NMJ efter FM farvestof losning.

4. høj [K+] Stimulation: FM farvestof aflæsning

  1. Erstatte Ca2 +-gratis saltvand med høj [K+] saltvand (uden FM1-43 farvestof) at drive depolarisering, SV exocytose og farvestof frigivelse.
  2. Straks starte en digital timer til forudbestemte varigheden af perioden høj [K+] stimulation (fx., 2 min; Figur 2).
  3. Når den tidtager udløber, straks fjerne høj [K+] saltvand og erstatte med Ca2 +-gratis saltvand til at stoppe SV cykling.
  4. Vask i hurtig rækkefølge med Ca2 +-gratis saltvand (5 x til 1 min) til at sikre høj [K+] saltvand er helt fjernet.
  5. Opretholde den larve forberedelse i frisk Ca2 +-gratis saltvand for øjeblikkelig imaging med Konfokal mikroskop.
  6. Være sikker på at billedet FM1-43 farvestof fluorescens på den samme NMJ nævnt ovenfor benytter de samme Konfokal indstillinger.

5. valgmulighed 2: Elektrisk Stimulation FM farvestof lastning

  1. Forberede en suge pipette med mikroelektrode puller (Table of Materials) til at opnå den krævede tilspidsning og tip størrelse.
  2. Brand-polsk mikroelektrode spidsen med en mikro-forge indtil en enkelt motor nerve kan blive suget med en stram pasform.
  3. Skub suge pipette elektrode holderen til på en micromanipulator og tillægger den lange fleksible plastrør og en sprøjte.
  4. Indstille stimulator parametre (fx., 15 V, 20 Hz frekvens, 20 ms varighed og tidspunkt af 5 min (figur 2) eller 1 min (figur 3)).
  5. Erstatte Ca2 +-gratis saltvand på larve forberedelse med ovenfor FM1-43 saltvand (4 µM; 1 mM CaCl2) på Elektrofysiologi riggen.
  6. Sat forberedelse på stadiet mikroskop og hæve fase indtil larve og suge pipette er i fokus (40 X vand-fordybelse mål).
  7. Suge op en løkke af cut motoriske nerve innerverer de valgte hemisegment med negativt lufttryk genereret af sprøjten ind i den suge elektrode.
  8. Teste funktionen suge elektrode med en kort burst af stimulation mens visuelt overvågning for muskelsammentrækning i den valgte hemisegment.
  9. Stimulere den motoriske nerve ved hjælp af udvalgte parametre (trin 5.4) til at køre SV endocytose og FM1-43 farvestof optagelse (figur 2).
  10. Vask i hurtig rækkefølge med Ca2 +-gratis saltvand (5 x til 1 min) for at sikre FM1-43 farvestof løsning er helt fjernet.
  11. Opretholde den larve forberedelse i frisk Ca2 +-gratis saltvand for øjeblikkelig imaging ved hjælp af Konfokal imaging protokollen fra oven.
  12. Notere NMJ afbildet (segment, side og muskel) at sikre adgang til de nøjagtige samme NMJ efter FM farvestof aflæsning forsigtig ud.

6. elektrisk Stimulation: FM farvestof aflæsning

  1. Erstatte Ca2 +-gratis saltvand med regelmæssige saltvand (uden FM1-43 farvestof) og placere forberedelsen tilbage på Elektrofysiologi rig scenen.
  2. Angiv stimulator parametre for losning (f.eks.15 V, 20 Hz frekvens, 20 ms varighed og tidspunkt for 2 min (figur 2) eller 20 s (figur 3)).
  3. Sutte den samme motor nerve i den samme elektrode som ovenfor, og derefter stimulere for at aktivere SV exocytose og FM1-43 dye udgivelse.
  4. Vask i hurtig rækkefølge med Ca2 +-gratis saltvand (5 x til 1 min) til at sikre den eksterne farvestof er helt fjernet.
  5. Opretholde den larve forberedelse i frisk Ca2 +-gratis saltvand for øjeblikkelig imaging med Konfokal mikroskop.
  6. Sikre, at du billede FM1-43 farvestof fluorescens på den samme NMJ nævnt ovenfor benytter de samme Konfokal indstillinger.

7. mulighed 3: Channelrhodopsin Stimulation FM farvestof lastning

  1. Hæve ChR2-udtrykker larver på fødevarer, der indeholder ChR2 co-faktor all-trans retinal (opløst i ethanol; 100 µM endelige koncentration).
  2. Sted larve præparatet i plexiglas salen på en dissektion mikroskop scenen udstyret med en kamera port.
  3. Vedhæfte en blå LED (470 nm; Tabel over materialer) at en programmerbar stimulator ved hjælp af et koaxialkabel og placere Lysdioden i kameraet-porten.
  4. Fokus den blå LED lys stråle på dissekeret larve funktion ved hjælp af mikroskop zoom-funktionen.
  5. Erstatte Ca2 +-gratis saltvand på larve forberedelse med ovenfor FM1-43 saltvand (4 µM; 1 mM CaCl2) på optogenetic scene.
  6. Indstille LED parametre ved hjælp af stimulator (f.eks.15 V, 20 Hz frekvens, 20 ms varighed og tidspunkt for 5 min (figur 2)).
  7. Start lys stimulering og styr med en timer for forudbestemte varigheden af perioden optogenetic stimulation (fx, 5 min; Figur 2).
  8. Når timeren stopper, hurtigt fjerne FM farvestof løsning og erstatte med Ca2 +-gratis saltvand til at stoppe SV cykling.
  9. Vask i hurtig rækkefølge med Ca2 +-gratis saltvand (5 x til 1 min) for at sikre FM farvestof løsning er helt fjernet.
  10. Opretholde den larve forberedelse i frisk Ca2 +-gratis saltvand for øjeblikkelig imaging med Konfokal mikroskop ved hjælp af billedbehandling protokol fra oven.
  11. Notere NMJ afbildet (segment, side og muskel) at sikre adgang til de nøjagtige samme NMJ efter FM farvestof aflæsning forsigtig ud.

8. Channelrhodopsin Stimulation: FM farvestof aflæsning

  1. Erstatte Ca2 +-gratis saltvand med regelmæssige saltvand (uden FM1-43 farvestof) på stadiet dissektion mikroskop med kamera port LED fokuseret på larve.
  2. Angiv stimulator parametre for losning (fx 15 V, 20 Hz frekvens, 20 ms varighed og tidspunkt for 2 min (figur 2)).
  3. Start lys stimulering og styr med en timer for perioden optogenetic stimulation forudbestemte varighed (f.eks. 2 min. Figur 2).
  4. Når den tidtager udløber, hurtigt fjerne FM farvestof løsning og udskifte med Ca2 +-gratis saltvand til at stoppe SV cykling.
  5. Vask i hurtig rækkefølge med Ca2 +-gratis saltvand (5 x til 1 min) til at sikre den eksterne farvestof er helt fjernet.
  6. Opretholde den larve forberedelse i frisk Ca2 +-gratis saltvand for øjeblikkelig imaging med Konfokal mikroskop.
  7. Sikre, at du billede FM1-43 farvestof fluorescens på den samme NMJ nævnt ovenfor benytter de samme Konfokal indstillinger.

9. fluorescens kvantificering

  1. Indlæse billedet i Image Jørgensen (NIH open source) og oprette en maksimal intensitet projektion ved at klikke på billede | Stakke | Z projekt.
  2. Ved hjælp af anti-HRP:647 kanalen, gå til Image | Justere | Tærskel og skub den øverste værktøj advokatstanden indtil bare NMJ fremhæves.
  3. Brug værktøjet tryllestav, klik på NMJ. Hvis NMJ er diskontinuert, hold Shift knappen og vælg alle dele.
  4. Ændre billedet til FM1-43 farvestof kanal og gå på analyser | Foranstaltning at opnå fluorescens målingen.
  5. Gentag trin 9.1-9.4 for den "landede" billede fra de samme NMJ (identificerede segment, side og muskel).
  6. For at opnå procentdelen af farvestof, der blev losset, tage forholdet mellem losses/indlæst fluorescens intensiteter.
    Bemærk: Denne procedure kan ændres til at analysere fluorescens på bouton pr. bouton basis ved hjælp af enten "oval" eller "freehand" markeringsværktøjerne. Baggrund fluorescens kan trækkes af prøveudtagning muskel fluorescens. Agenter kan også tilføjes for at reducere denne baggrund.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser arbejdsgangen for aktivitet-afhængige FM farvestoffet imaging protokol. Eksperimentet begynder altid med den samme larve lim dissektion, uanset metoden stimulation efterfølgende anvendes. Figur 1a er en skematisk af en dissekeret larve, der viser den ventrale nerve ledningen (VNC), udstrålende nerver og gentagne hemisegmental muskel mønster. VNC er fjernet og forberedelsen badet i en 4 µM løsning af FM1-43 (figur 1b, pink). Præparatet er derefter stimuleret i overværelse af FM farvestof ved hjælp af en af de tre mulige indstillinger til at indlæse farvestof via aktivitet-afhængige SV endocytose (figur 1cI-III). Næste, FM farvestof cykling er anholdt ved hjælp af Ca2 +-gratis saltvand og en bestemt NMJ terminal, der er blevet indlæst med FM farvestof er afbildet ved hjælp af en Konfokal mikroskop ("indlæst billede"; Figur 1 d). I dette tilfælde, indlæst musklen 4 NMJ er markeret med skematisk viser placeringen af den nerve, NMJ terminal forgrening og FM synaptic boutons. Synaptic fremstilling er stimuleret for anden gang med den samme metode markeret ovenfor, men i mangel af FM farvestof til at drive SV exocytose og FM1-43 release (figur 1e). Den samme identificeret NMJ (muskel 4 NMJ i dette eksempel) er derefter re-afbildet i brug af HRP:647 synaptic etiket og resterende FM1-43 vesikel signal ("losset billede"; Figur 1f). Eksperimentatoren bestemmer styrken og varigheden af- og pålæsning faser for at optimere målinger for en bestemt analyse eller mutant tilstand. Fluorescens intensitet er kvantificeret efter lastning og losning (figur 1 d, 1f), for at få målinger af synaptic farvestof endocytose og exocytose procentdel af indlæst FM farvestof frigivet. Analyser kan gøres for hele NMJ eller enkelt boutons.

FM farvestof cykling kan stimuleres på tre måder: 1) høj [K+] saltvand depolarisering af hele præparationen, 2) suge elektrode stimulation af den motoriske nerve, eller 3) lys drevet aktivering af målrettede channelrhodopsin (ChR2; Figur 2). For en direkte side-by-side sammenligning mellem alle tre metoder, vi stimuleret med hver tilgang i 5 min i overværelse af FM1-43 (indlæsning) og derefter for 2 min i mangel af FM1-43 (lossehavnen), og filmede HRP-mærket NMJs bruger identiske Konfokal indstillinger ( Figur 2). Metoden høj [K+] saltvand depolarisering følger den udbredte FM1-43 protokol for den Drosophila larve NMJ23, medmindre vi bruge lim i stedet for knappenåle til larve dissektion. Limen undgår interferens med mikroskop mål og giver mulighed for mere præcis bestemmelse af kroppen væg spændinger, men kræver en moderat indlæringskurve. Alle tre metoder producerer stærk og konsekvent fluorescerende signaler i hele NMJ synaptic bouton arbor og inden for enkelte synaptic boutons (mellemværker). Metoden høj [K+] saltvand depolarisering medfører alle NMJs at være FM-loaded i hele larve som det depolarizes hver neuron i dyr (figur 2A, midten). Metoden nerve suge elektrode elektrisk stimulation drev kun i en enkelt hemisegment af larverne som den tilsvarende innerverer motoriske nerve har været stimuleret (figur 2B, midten). Unstimulated segmenter i samme dyr højreanbringelse bruger HRP etiket, men indeholder ingen observerbare fluorescerende farvestof lastning, og tjene som fremragende interne kontroller. Optogenetic ChR2 metode producerer målrettede depolarisering afhængig af den transgene Gal4 driver ansat (figur 2 c). Her, var at føreren en vesikulære glutamat transporter (vglut) Gal4, så alle glutamatergic neuroner er depolariseret med blå lys stimulation, herunder alle glutamatergic motor neuroner. Som et resultat, er alle NMJs fyldt med FM1-43 farvestof i dette eksempel (figur 2 c, midten). Celle-specifikke drivere kan bruges til at mærke specifikke NMJs og lade andre umærket for en intern kontrol.

FM farvestof losning blev opnået via den samme metode, der blev brugt til at indlæse farvestof. I den første metode, var den larve forberedelse simpelthen badet i høj [K+] saltvand i mangel af FM1-43 depolarisere celler, drev SV exocytose, og losse synaptiske terminalerne (figur 2A, højre). Vi typisk vælge en kortere losning periode (2 min), så losning er delvis og terminaler forbliver synlige i FM-kanalen. Suge elektrode elektrisk stimulation losning er betydeligt mere udfordrende, fordi det indebærer vender tilbage til den samme hemisegment, at identificere den samme nerve, og igen stimulere denne nerve i mangel af FM1-43 til at køre farvestof losning (figur 2B , højre). Bemærk at farvestof losning var igen delvis. ChR2 aflæsning medfører en anden periode af blå LED belysning af larve præparatet i mangel af FM1-43 til at aktivere kanalerne, depolarisere motoriske neuroner og stimulere SV exocytose dye udgivelse (figur 2 c, højre). Med denne tidsplan for losning (2 min), hver af disse depolarization metoder losses kun en procentdel af de indlæste FM1-43 farvestof, med høj [K+] stærkeste og ChR2 svageste i kørsel dye udgivelse (figur 2). Vi målte LED lysintensiteten anvendes (140 µW/mm2), som var i offentliggjorte vifte (20-1000 µW/mm2)24,25,26. ChR2 aktiveres maksimalt ved ~ 1 mW belysning fra 50-200 mW lyskilder, med ChR2 effektivitet også afhænger af ATR koncentrationen fodret til larve27,28. Således kan ChR2 stimulation styrke manipuleres. Desuden kan forholdet ikke forblive tilfældet med andre stimulation styrker, tidsskalaer eller genotyper. Hvis eksperimentatoren arbejder med en mutant, som har formindsket SV endocytose eller usædvanligt hurtigt exocytose, skal stimulation parametrene ændres for at opretholde en observerbar signal efter aflæsning. Etiketten anti-HRP gør det muligt at identificere NMJ selv i den fuldstændige mangel på FM signal, men det er ikke ideelt til kvantificering. I princippet, kunne losning stimulering også være en anden type fra lastning stimulation.

Vi har for nylig undersøgt tabet af udskilles synaptic deacylase Notum virkninger på den SV cyklus ved hjælp af elektrisk stimulation4. Her, udvider vi denne analyse for at sammenligne 1) høj [K+] depolarisering og 2) suge elektrode motoriske nerve stimulation metoder (figur 3). Vi finder at begge metoder giver et lignende resultat, viser reduceret FM1-43 farvestof lastning i en Notum null mutant; men graden af Fænotypen er forskellige mellem de to metoder. Efter depolarisering med høj [K+] saltvand i fem min er der et stort fald i lastet fluorescens intensitet mellem genetiske baggrund kontrol (w1118) med høje niveauer og Notum null mutanter (NotumKO ) med en lav (figur 3A, top). I kvantitative målinger reduceres normaliserede FM fluorescens intensitet i HRP-skitseret NMJ terminaler betydeligt i mangel af Notum (w1118 1,0 ± 0,05 vs NotumKO 0,57 ± 0,07; n≥13, p < 0.0001; Figur 3B). Efter elektrisk stimulation på 20 Hz for 1 min finder vi en ubetydelig nedgang i lastet FM1-43 intensitet mellem kontrol og Notum null-værdier, når kvantificere hele NMJ fluorescens (w1118 1,0 ± 0,05 vs. NotumKO 0,86 ± 0,06; n = 8, p = 0,10; Figur 3A, B). Når du måler farvestof vedtægter på grundlag af bouton pr. bouton, finder vi et signifikant fald i dye fyldt med begge metoder. I kvantitative målinger efter stimulation med høj [K+] saltvand, normaliserede FM fluorescens intensitet pr. bouton er faldt betydeligt (w1118 1,0 ± 0,02 vs NotumKO 0,52 ± 0,02; n≥241, p< 0.0001; Figur 3 c). Efter elektrisk stimulation, normaliserede fluorescens intensitet pr. bouton er også faldt betydeligt, omend i en lavere grad (w1118 1,0 ± 0,02 vs NotumKO 0,83 ± 0,02; n≥127, p< 0,0001; Figur 3 c).

Resultatet forskellene mellem de to stimulation paradigmer kan skyldes en række faktorer. Først, stimulation styrken formodes at være større med høj [K+] sammenlignet med elektrisk motor nervestimulation. Elektrofysiologi optagelser kan ikke ske i nærværelse af den høje [K+] saltvand, men den larve neuromusculature er klart at være håndfast stimuleret, som muskelsammentrækninger er stærk og konstant i hele perioden 5 min badning. Vi ved imidlertid ikke styrke eller frekvensen af stimulation. Den elektriske stimulation styres derimod langt mere med brugeren vælge den nøjagtige spænding styrke og hyppighed af stimulation. Andet stimulering varighed var længere med høj [K+] sammenlignet med elektrisk nervestimulation (figur 3). Vi valgte 1 min af 20 Hz elektrisk stimulation efter gentagne forsøg. Efter 1 min af farvestof lastning var der en stærk og pålidelig FM1-43 signal, så vi valgte at paradigme for vores undersøgelse4, selv om 5 min af stimulation gav en endnu stærkere fluorescerende signal (figur 2). Længden af stimulation paradigmet bidrager således, sandsynligvis til størrelsesorden variabilitet i FM1-43 lastning mellem høj [K+] og elektrisk stimulation (figur 3B, C). Selv om metoden høj [K+] viste en mere robust fænotype for Notum mutanter, brugte vi stadig den elektriske metode på grund af den større kontrol4. Der er mange parametre til at styre som styrke, hyppighed og varighed af stimulation, og disse indstillinger skal være besluttet baseret på mutanten og spørgsmålet. For eksempel, stimulation-metoden valg kan afhænge af SV pool forhørt7 og aktivitet-afhængige mekanisme undersøgt10.

Efter FM1-43 ilægning i NMJ terminal, kan man anvende fluorescens dye photoconversion til at producere den elektron-tætte signal for elektronmikroskopi (figur 4). I denne metode, er dye-lastet præparatet udsat for intenst fluorescerende lys i overværelse af diaminobenzidine (DAB), med den reaktive ilt arter fra FM farvestoffet oxiderende DAB for at oprette en mørk bundfald (figur 4A)11. Se venligst JoVE artikel på photoconversion af styryl farvestoffer til komplet detaljer12. Fordelen ved denne metode er, at SVs klart afsløret på ultrastrukturelle niveau, selv om SV cyklus er naturligvis anholdt med statisk elektronmikroskop billeddannelse. I mangel af stimulation, synaptic boutons i Drosophila NMJ er tæt belæsset med vesikler (~ 40 nm i diameter; Figur 4B), med den sjældne forekomst af udvidede organeller (>100 nm i diameter) formodes at være cykling endosomes. Høj [K+] saltvand depolariserende stimulation kraftigt ændrer denne profil, med en delvis nedbrydning af SV befolkning og den hurtige ophobning af talrige udvidede organeller (>100 nm i diameter) menes at være afledt af bulk endocytose af plasma membran (figur 4 c, venstre). Selv om lignende rum findes i unstimulated kontrolelementer, vækker den høje tæthed af disse organeller efter høj [K+] saltvand depolarisering bekymring at det kan være en ikke-fysiologisk reaktion. Suge elektrode elektrisk stimulation af den motoriske nerve er relativt mere effektiv i nedbryder SV befolkning og producere ikke mere af de udvidede endosomal vesikler (figur 4D, venstre). Dette tyder på, at bulk endocytose drevet af høje [K+] depolarisering bidrager til at opretholde befolkningens SV under mere intens efterspørgsel.

FM1-43 photoconversion kan opnås ved hjælp af enten høj [K+] saltvand depolarisering eller suge elektrode elektrisk stimulation af den motoriske nerve, for at sammenligne synaptic ultrastruktur i forhold til en hvilende bouton (figur 4). Med høj [K+] depolariserende stimulation, både individuelle SVs og udvidede vesikler (>100 nm i diameter) kan være mærket med den elektron-tætte DAB bundfald følgende lys-drevne photoconversion (figur 4 c, højre). Af ukendte årsager er udvidede vesikel membranen typisk mindre tætbefolkede mærket end de mindre SV membran. Derudover SVs vises ofte fyldt med DAB bundfaldet, snarere end blot membranen, men det gør dem meget lettere at skelne fra de umærkede vesikler. Med suge elektrode stimulation af den motoriske nerve mærkes cykling SV befolkningen også i forhold til umærkede SVs (figur 4D, højre). Med elektrisk stimulation, udvidet vesikler (>100 nm i diameter) dannes ikke detectably i boutons og konsekvent, membraner i den formodede endosomes er ikke mærket af FM1-43 photoconversion. Som er ovenfor, cykling SVs typisk fyldt med DAB bundfald i en noget alt mode, og derfor lettere kan skelnes fra SVs, der ikke er blevet dannet under stimulation (figur 4D, højre). Vi har endnu ikke forsøgt photoconversion efter ChR2 stimulation. Med forskellige tidsforløb for stimulation tillader FM1-43 farvestoffet photoconversion en at afgøre hvor SVs dannes, hvordan SVs er offer for menneskehandel, og timingen af bevægelse mellem forskellige rumlige pools inden for de synaptic bouton. Sammenligning af høj [K+] og nervestimulation giver dissektion af bulk og enkelt SV endocytose mekanismer.

Figure 1
Figur 1: Flowchart FM1-43 farvestof lastning protokol på Drosophila NMJ. Larve lim dissektion producerer en flad neuromusculature forberedelse, med den ventrale nerve ledningen (VNC) fremspringende segmental nerver fra den ventrale midterlinjen (Vm) til hemisegmentally gentagne kroppen væggen muskel arrays (trin en). VNC skæres fri, og hele larve dissektion er derefter inkuberes i den lyserøde FM1-43 løsning (4 µM) som forberedelse til stimulation (trin b). FM1-43 der derefter indlæses med et valgte stimulation paradigme (trin 3); med muligheder for høj [K+] depolarisering af de hele larve (cI) suge elektrode stimulering af en enkelt motor nerve (cII) eller lys-drevet aktivering af meget målrettede channelrhodopsin (cIII). FM1-43 indarbejdelse er anholdt ved hjælp af Ca2 +-gratis saltvand og dye-lastet NMJ afbildet (trin d). En anden stimulering sker derefter uden FM1-43 i bad til at drive farvestof synaptic vesikel exocytose (trin e). Den samme NMJ er derefter re-afbildet for at assay losset synaptic terminalen (trin f). Fluorescerende intensitet måles fra både lastet og losset NMJs at kvantificere SV endocytose og SV exocytose niveauer. Bundpanelet viser konstruktion parametre og dimensioner for gennemsigtig akryl mødesalen anvendes til disse undersøgelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: FM farve lastning og losning sammenligning af alle stimulation metoder. Sammenligning af FM1-43 farve lastning og losning i den omvandrende tredje instar NMJ med 1) høj [K+] depolarisering af den hele larve forberedelse (top), 2) suge elektrode elektrisk stimulation af den motoriske nerve (i midten) og 3) lys-drevet aktivering af den målrettede channelrhodopsin (ChR2) kun i motor neuroner (nederst). (A) den larve NMJ mærket med anti-HRP:647 præsynaptiske membran markør (blå, venstre), fyldt med FM1-43 via høj [K+] depolarisering i 5 min (i midten) og derefter losses via høj [K+] depolarisering i 2 min. (B) Sammenligning med suge elektrode elektrisk nervestimulation med de samme stimuli perioder for begge FM1-43 farve lastning og losning. (C) målrettet vglut-Gal4>UAS-ChR2-H134R udtryk i motoriske neuroner aktiveret med blå (470 nm) lys i de samme stimuli perioder af FM1-43 farve lastning og losning. Stjerner henvise til mellemværker vise højere forstørrelse boutons. Skalalinjen er 10 µm, med inset synaptic boutons udvidet 3,5 X fra vigtigste paneler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Notum null mutanter Vis reduceret FM farvestof lastning i synaptic boutons. FM1-43 indlæses i synaptiske terminalerne den vandrer tredje instar NMJ sammenligne den genetiske kontrol (w1118) til Notum null mutanter (NotumKO). (A) NMJ boutons mærket med høj [K+] depolarisering af hele larve forberedelse (øverst) eller suge elektrode stimulation af én motor nerve (nederst) i w1118 (venstre) og NotumKO (til højre). (B) Quantified indlæst FM1-43 fluorescens pr. NMJ som en scatter plot sammenligning af høj [K+] depolarisering og suge elektrode stimulation w1118 kontrol vs. NotumKO mutanter. (C) Quantified indlæst fluorescens på grundlag af bouton pr. bouton som en boks og bakkenbart plot sammenligne høj [K+] depolarisering og suge elektrode stimulation w1118 kontrol vs. NotumKO . Students to-sidede t-tests blev udført for hver sammenligning med p-værdier vises på grafer. Viser gennemsnit ± SEM lavet med prisme (Version 7.0 for Windows). Elektrisk stimulation data er blevet tilpasset med tilladelse fra Kopke mfl., udvikling 144 (19): 3499-510, 2017. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Synaptic ultrastruktur med FM farvestoffet photoconversion at markere vesikler. Fluorescerende FM1-43 kan være photoconverted til en oxideret diaminobenzidine (DAB) elektron-tætte bundfaldet for visualisering via transmissions Elektron Mikroskopi (TEM). (A) A skematisk diagram over photoconversion metoden til at mærke den Drosophila NMJ efter aktivitet-afhængige FM1-43 farvestof lastning. (B) repræsentative TEM billede af en vildtype synaptic bouton på resten (unstimulated). Bemærk tæt bestand af ensartet størrelse SVs. (C) Synaptic boutons, der har været stimuleret med høj [K+] saltvand depolarisering i 5 min, uden photoconversion (til venstre) eller FM1-43 photoconversion (til højre). Bemærk tilstedeværelsen af bulk endosomal strukturer, mærket og umærket. (D) Synaptic boutons, der har været elektrisk stimuleret med en nerve suge elektrode på 20 Hz til 5 min med ingen photoconversion (venstre) eller FM1-43 photoconversion (til højre). Bemærk at de dye-lastet vesikler vises meget mørkere end tilstødende losset vesikler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Høj [K+] saltvand depolariserende stimulation er langt den letteste af de tre muligheder for aktivitet-afhængige FM farvestof cykling, men sandsynligvis den mindste fysiologiske29. Denne simple metode depolarizes alle tilgængelige celle i hele dyret, og så tillader ikke styret undersøgelser. Det kan være muligt at anvende lokalt høj [K+] saltvand med en mikropipette, men det vil stadig depolarisere pre/postsynaptiske celler og sandsynligvis synapse-associerede glia1. En anden vigtig bekymring er at høj [K+] depolarisering drev hurtig dannelse af bulk endosomes, der ses kun sjældent i unstimulated boutons. Bulk endosome dannelse er imidlertid en aktiv mekanisme blokeret af mutationer29, der angiver en reel fysiologisk proces. FM1-43 imaging med høj [K+] depolarisering kan således bruges til selektivt studere bulk endocytose på synapser. Suge elektrode elektrisk stimulation af den motoriske nerve er et langt mere kontrolleret metode. Det har den fordel, at kun et enkelt axon bundt stimuleres, og kun de præsynaptiske termini er direkte depolariseret (selvfølgelig, depolariseret muskelfiber derefter af senderen handling). Det giver derfor en stor intern kontrol af NMJs i de samme dyr, der ikke stimuleres. Denne metode tillader en stramt styre stimulation parametre, i modsætning til den høje [K+] stimulation metode, muliggør direkte sammenligning med Elektrofysiologi optagelser4. Dog, denne teknik kræver specialudstyr og en forholdsvis høj grad af tekniske færdigheder, og er derfor mindre tilgængelig. Lys-drevet aktivering af målrettede channelrhodopsin (ChR2) har fordelen af målretning Vælg neuroner30. Denne metode kræver ingen kendskab til Elektrofysiologi metoder, og kan gøres med meget billige udstyr i enhver lab, men denne tilgang kræver grundlæggende kendskab til Drosophila genetik.

Valget af stimulation parametre er kritisk vigtigt for afprøvning SV cycle dynamics forespørges inden for en række genetiske forhold med meget varierende fænotyper1. For alle de metoder, den eksterne [Ca2 +] bruges er en afgørende parameter kontrollerer den drivende kraft af SV cykling. Med høj [K+] stimulation-metoden et vigtigt valg er [K+] bruges, som bestemmer graden af depolarisering styrke. Målinger af Drosophila haemolymph angive en [K+] af 5 mM og 90 mM er typisk koncentrationen oftest udvalgt til aktivitet stimulation3,7,15,17 , 31. dog et [K+] spænder fra 30-90 mM har været ansat til at variere stimulation styrke5,16,32. En anden afgørende parameter beslutning er længden af høj [K+] stimulation for begge FM1-43 lastning og losning. Perioden for lastning bestemmer om hele cykling SV befolkningen effektivt er indlæst, eller kun et undersæt af aktive vesikler7. Frist for aflæsning på samme måde dikterer procentdelen af SVs gennemgår exocytose i perioden stimulation, som kan afsløre eller obskure mutant fænotyper afhængig af sats ændrer i SV cykling frekvens2. Med suge elektrode elektrisk motor nervestimulation omfatter parameter valg også stimulation spænding, frekvens, varighed og puls interval. Tidsligt mønstrede aktivitet er en vigtig faktor for SV cykling dynamics7, og forskellige stimulation mønstre kan selektivt mobilisere særskilte SV swimmingpools. Med målrettede lys-drevne ChR2 aktivering, valg omfatte alle de ovenfor (med lysintensiteten variabler) og yderligere transgene indstillinger diskuteret i næste afsnit. Med disse parameter valg kommer mere eksperimenterende kontrol, men også øgede tekniske kompleksitet.

Channelrhodopsin-2 (ChR2) er en lys-gated membran kanal gennemtrængelig for mono- og divalent kationer33. Hvis ChR2 stimulation er valgt, er der mange valg herunder Gal4 driver, UAS-ChR2 konstruktion og lyskilde variabler for kanal aktivering. Gal4 drivere spænder fra allestedsnærværende til meget specifikke. For eksempel, allestedsnærværende UH1-Gal4 (daughterless) ville udtrykke ChR2 i hver celle, mens CcapR-Gal4 (Janelia) drev ChR2 i musklen 6/7 NMJ men ikke muskel 4 NMJ31,34. Denne selektivitet kan bruges som en kraftig intern kontrol. Der er ligeledes mange UAS-ChR2 varianter, herunder ChR2-H134R (brugt her, muterede rester forårsager øget photocurrents)35, VChR1, ChIEF og mange flere36. Hver af disse kanal varianter har forskellige egenskaber af lys gating, ledningsevne, ion selektivitet, kinetik og desensibilisering. Bemærk nogle konstruktioner indeholde en fluorescerende tag, der kunne forstyrre FM billeddannelse. For eksempel, UAS-ChR2-H134R bruges her er markeret med mCherry (ex: 587 nm, em: 610 nm), men ikke producerer detectible emission med FM1-43 (ex: 479 nm, em: 598 nm) imaging filtre. Tekniske parameter valg omfatter lyskilde, bølgelængde og intensitet for kanal aktivering. En indstilling, der bruges her er en billig blå lysende LED, med stimulation visuelt bekræftet af boltpistoler muskelsammentrækninger. Vi havde også held med aktivering ChR2 brug epifluorescensmikroskop, selv om en scanning Konfokal laser ikke var tilstrækkelig. Epifluorescensmikroskop kunne bruges i målrettet stimulation (specifikke segmenter i stedet for hele dyret), men stimulation parametre er svære at styre, mens LED forbundet til en simpel stimulator nemt ændrer både varighed og hyppighed af lys pulser. Fokus LED lys gennem dissektion mikroskop kamera port tillader mere kontrolleret, intense lys stimulation.

Det er op til eksperimentatoren at afgøre, om ikke at forlade den ventrale nerve ledningen/hjerne intakt under stimulation paradigme. Vi valgte at fjerne hele centralnervesystemet til sammenligning af de tre metoder, der anvendes her, men nogle gange den upstream ledninger er overladt intakt15. En komplikation er, at endogene neurale aktivitet forekommer når nervesystemet er overladt hele. Graden af denne aktivitet er meget varierende fra dyr til dyr, høj grad afhængige af eksperimentatoren dissektion ekspertise. Denne variabel aktivitet kan bidrage til mængden af FM1-43 farvestof, der er lastet og losset, som er derfor ikke udelukkende på grund af eksogen stimulation ansat15. En beslægtet teknisk komplikation er at intakt dissekeret larver kontrakt muskulatur i fiktive bevægelse, og denne forskydning høj grad forstyrrer NMJ imaging. Denne bevægelse er afhjulpet hvis det centrale nervesystem er fjernet, og også gennem anvendelse af Ca2 +-gratis saltvand under imaging4. Disse metoder, der anvendes her er tilstrækkeligt til at sikre fremragende FM1-43 farvestof imaging i NMJ forberedelse. Men nogle eksperimentatorer vælge at tilføje narkotika for at hæmme muskelsammentrækning (f.eks. ryanodine, philanthotoxin-433), eller bruge aktionspotentialet blokkere (fx tetrodotoxin)37,38. En række lægemidler kan bruges til selektivt manipulere SV cyklus, for at fremhæve bestemte skridt eller fremhæve mutant fænotyper for at undersøge neurotransmission mekanismer. For eksempel, nogle eksperimentatorer har ansat Veratridine (aktiveres spænding-gated Na+ kanaler39) for at øge SV lastning i reserve pool, ciclosporin A (hæmmer Calcineurin aktivitet40) for at forbedre SV endocytose, og Forskolin (aktiveres adenylyl cyclase41, som forbedrer synaptisk transmission42) at øge den exo/endo cykling pool7,43,44. Sådanne farmakologiske manipulationer kan give yderligere indsigt. Endelig kan FM1-43 baggrund forekomme i varierende grad baseret på kvaliteten af dissektion, vask effektivitet og stimulation protokol. Nogle tilføje en sulfobutylated derivat af β-cyclodextrin Advasep-745eller den vandige fluorophore sulforhodamine46, til dæmpning af uspecifik fluorescens og forbedre signalet til baggrund ratio.

Der er mange teknikker, der kan ledsage FM fluorescerende imaging til yderligere forståelse af SV cyklus (f.eks. Elektrofysiologi, synaptopHluorin, elektron mikroskopi). Eksempel vist her er FM fluorescens photoconversion, der bruges til at undersøge SV cyklus i ultrastrukturelle detaljer. SVs er organiseret i flere pools, der er rumligt og funktionelt adskilte2. Den let udgivelsesværdige pool (VEJL.) indeholder vesikler straks frigives ved akut stimulation. En større genanvendelse pool fastholder SV udgivelse på betingelser af moderat aktivitet. En intern reserve pool (RP) er kun ansat med stærk (tilsyneladende nær fysiologiske) stimulation2. SV-puljer, der aktiveres afhænger af typen af stimulation anvendes47, og rapporter fra Drosophila NMJ ved hjælp af FM photoconversion har afsløret nøglen indblik i rumlige og funktionelle egenskaber af disse forskellige SV pools48. FM photoconversion kan bruges til at studere SV pools aktiveret under forskellige stimulation paradigmer, og forespørgslen spørgsmål såsom lange-drøftet menneskehandel samspillet mellem endosomes og SVs49. Hvis eksperimentatoren er interesseret i FM billedbehandling i kombination med andre aktivitet-afhængige ændringer på synapser, er der en sigende fixable analog af FM1-43 farvestof (FM1-43FX). Denne sonde skal tillader en at lave Drosophila NMJ efter aktivitet-afhængige farvestof lastning, og derefter følge op med antistof mærkning for at teste for korrelationer mellem bouton aktivitetsniveau (FM farvestof fluorescens) og aktivitet-afhængige udtryk for en protein af interesse. I fremtiden, det vil være meget givende for at udforske yderligere metoder, der kan give en kombination af FM farvestof imaging med andre billeddiagnostiske tilgange på den smukke Drosophila NMJ model synapse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker Broadie Lab medlemmer for bidrag til denne artikel. Dette arbejde blev støttet af NIH R01s MH096832 og MH084989 til K.B., og NIH predoctoral fellowship F31 MH111144 til D.L.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit Fisher Scientific NC9644388 To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1 Fisherbrand 12-542-B To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200 Thermolyne HPA2235M To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber N/A N/A Handmade
Borosilicate Glass Capillaries WPI 1B100F-4 To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller Sutter Instrument P-2000 To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing Component Supply Co. TET-031A For mouth and suction pipette
P2 pipette tip USA Scientific 1111-3700 For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap Fisher Scientific 05-408-120 Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M WPI vetbond Glue used for dissections
Potassium Chloride Fisher Scientific P-217 Forsaline
Sodium Chloride Millipore Sigma S5886 For saline
Magnesium Chloride Fisher Scientific M35-500 For saline
Calcium Chloride Dihydrate Millipore Sigma C7902 For saline
Sucrose Fisher Scientific S5-3 For saline
HEPES Millipore Sigma H3375 For saline
HRP:Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 123-605-021 To label neuronal membranes
Paintbrush Winsor & Newton 94376864793 To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5 WPI 500233 Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) WPI 14177 Used during dissection 
FM1-43 Fisher Scientific T35356 Fluorescent styryl dye
Digital Timer VWR 62344-641 For timing FM dye load/unload 
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope Zeiss For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0 Zeiss Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser Lasos To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser Lasos To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge WPI MF200 To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip BD 301625 To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base) Narishige MMN-9 To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator Grass S48 To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope Zeiss Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective Zeiss Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal Millipore Sigma R2500 Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port Zeiss 2000-C Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm ThorLabs M470L2 Used for ChR activation
T-Cube LED Driver ThorLabs LEDD1B To control the LED
LED Power Supply Cincon Electronics Co. TR15RA150 To power the LED
Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D To measure LED intensity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  2. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
  3. Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
  4. Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
  5. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  6. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
  7. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  8. Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
  9. Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  10. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
  11. Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
  12. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790 (2010).
  13. Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
  14. Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
  15. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  16. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  17. Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
  18. Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
  19. Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
  20. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
  21. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
  22. Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
  23. Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
  24. Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
  25. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
  26. Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133 (2009).
  27. Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 2, Unit 2.16 (2012).
  28. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  29. Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
  30. Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
  31. Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
  32. Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
  33. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  34. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  35. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  36. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  37. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  38. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
  39. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
  40. Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
  41. Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
  42. Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
  43. Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
  44. Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
  45. Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
  46. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
  47. Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135 (2010).
  48. Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
  49. Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).

Tags

Neurovidenskab spørgsmålet 135 Drosophila neuromuskulære junction FM1-43 Elektrofysiologi photoconversion transmissions elektronmikroskopi
FM farvestof cykling på Synapse: sammenligning af høje kalium depolarisering, elektriske og Channelrhodopsin Stimulation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye… More

Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation. J. Vis. Exp. (135), e57765, doi:10.3791/57765 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter