Summary

FM colorant cyclisme au niveau de la Synapse : en comparant la dépolarisation élevés de Potassium, électrique et Stimulation de la Channelrhodopsin

Published: May 24, 2018
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Summary

Les vésicules synaptiques (SV) le vélo est le mécanisme central de la communication intercellulaire au niveau des synapses neuronales. Libération et l’absorption de teinture de FM sont les principaux moyens de dosage quantitatif SV endo – et l’exocytose. Nous comparons ici, toutes les méthodes de stimulation pour conduire FM1-43 cyclisme synaptique jonction neuromusculaire (NMJ) modèle drosophile .

Abstract

FM colorants sont utilisés pour étudier le cycle de la vésicule synaptique (SV). Ces sondes amphipathic ont une tête hydrophile et une queue hydrophobe, ce qui les rend solubles dans l’eau avec la capacité de façon réversible, entrer et sortir des bicouches lipidiques membranaires. Ces colorants styryl sont relativement non fluorescent en milieu aqueux, mais l’insertion dans le feuillet externe de la membrane plasmique provoque un > 40 X augmentation de fluorescence. Dans les synapses neuronales, FM colorants sont intériorisées au cours de l’endocytose SV, victimes de la traite au sein et entre les bassins de la SV et libérée par exocytose SV, fournissant un outil puissant pour visualiser les étapes présynaptiques de la neurotransmission. Un modèle génétique primaire de développement synapse glutamatergique et la fonction est la drosophile jonction neuromusculaire (NMJ), où FM teindre imagerie a été largement utilisée pour quantifier la dynamique de la SV dans un large éventail de conditions mutants. Le terminal synaptique NMJ est facilement accessible, avec une belle palette de grands boutons synaptiques idéales pour les applications d’imagerie. Ici, nous comparer et contraster les trois façons de stimuler la drosophile NMJ pour piloter l’activité dépendante FM1-43 colorant capture/release : demande 1) bain de haut [K+] à dépolariser tissus neuromusculaires, 2) aspiration des nerfs moteurs électrode stimulation à dépolariser le nerveuses présynaptiques terminal et 3) cible expression transgénique des variantes de channelrhodopsin pour le contrôle spatial, stimulée par la lumière de la dépolarisation. Chacune de ces méthodes a des avantages et des inconvénients pour l’étude des effets de la mutation génétique sur le cycle de la SV à la drosophile NMJ. Nous allons discuter de ces avantages et les inconvénients pour aider la sélection de l’approche de la stimulation, ainsi que les méthodologies spécifiques à chacune de ces stratégies. En plus de l’imagerie de fluorescence, FM colorants peuvent être photoconverted aux signaux dense aux électrons visualisés à l’aide de microscopie électronique à transmission (TEM) pour étudier les mécanismes cycle SV au niveau ultrastructural. Nous fournissons les comparaisons de confocale et microscopie imagerie de différentes méthodes de stimulation NMJ Drosophila , pour aider à guider la sélection des futurs paradigmes expérimentaux.

Introduction

Le modèle de synapse et de glutamatergique caractérise magnifiquement Drosophila larvaire de la jonction neuromusculaire (NMJ) a été utilisé pour étudier la formation des synapses et la fonction avec un vaste éventail de perturbations génétiques1. Le terminal de neurones moteurs se compose de plusieurs branches axon, chacun avec plusieurs boutons synaptiques élargies. Ces varicosités de grande capacitées (jusqu’à 5 µm de diamètre) contiennent toute la machinerie de la neurotransmission, y compris les vésicules synaptiques glutamatergique uniforme (SVs ; ~ 40 nm de diamètre) dans la réserve cytosolique et piscines facilement libérable par2. Ces vésicules ancrer aux membrane présynaptique de plasma fusion site zones actives (AZs), où l’exocytose intervient dans la libération de neurotransmetteur glutamate pour trans-communication synaptique. Par la suite, le SVs sont extraites de la membrane plasmique par kiss-and-run de recyclage ou d’endocytose clathrine (CME) pour les cycles répétés d’exo/endocytose. La drosophile NMJ est facilement accessible et bien adapté pour les isoler et caractériser des mutants de cycle SV. À l’aide d’écrans génétiques avant, nouvelles mutations ont conduit à l’identification de nouveaux gènes critiques pour le SV cycle3. En outre, les approches génétiques inverses à partir de gènes déjà connus ont conduit à l’élucidation des mécanismes de cycle SV nouvelles par le biais de la description minutieuse du mutant cyclisme phénotypes4. La drosophile NMJ est presque idéales comme préparation pour disséquer les mécanismes de l’endocytose et l’exocytose SV grâce à des méthodes à optiquement piste vésicule cyclisme au cours de la neurotransmission synaptique expérimentale.

Une gamme de marqueurs fluorescents permettent suivi visuel des vésicules au cours de cyclisme dynamique, mais les plus polyvalents sont des analogues de colorant de FM qui est synthétisé pour la première fois par Mao, F., et al. 5. structurellement, FM colorants contiennent une tête hydrophile et une queue lipophile connectés grâce à un cycle aromatique, avec une région centrale conférant des propriétés spectrales. Ces styryl colorants partitionner de manière réversible dans les membranes, ne pas « bascule » entre les feuillets de la membrane et ne sont donc jamais libre dans le cytosol et sont beaucoup plus fluorescentes dans les membranes à l’eau5. Réversible insertion dans une bicouche lipidique provoque une augmentation de 40 fois en fluorescence6. Au niveau des synapses neuronales, classic FM colorant étiquetage des expériences consistent en la préparation synaptique avec le colorant au cours de la stimulation de dépolarisation pour charger le colorant par endocytose SV de baignade. Teinture extérieure est alors emporté et le cycle de la SV est arrêté dans une solution de ringer sans calcium afin d’imager les synapses chargé7. Une deuxième série de stimulation dans un bain sans colorant déclenche FM libération par exocytose, un processus qui peut être suivi en mesurant la diminution d’intensité de fluorescence. Les populations de SV d’une vésicule simple aux piscines contenant des centaines de vésicules peuvent être quantitativement surveillé6,7. Colorants de FM ont été utilisés pour disséquer la mobilisation activité dépendante des pools SV fonctionnellement distincts et de comparer les kiss-and-run vs CME cyclisme8,9. La méthode a été modifiée pour dosage séparément évoquée, spontanée et miniature cycle synaptique activités (avec équipement très sensible pour détecter des changements très faible fluorescence et réduire photobleaching)10. Dosages peuvent être étendues au niveau ultrastructural de photoconverting le signal FM fluorescent à une étiquette opaques pour transmission electron microscopy11,12,13,14 .

Historiquement, les préparations synaptique se baigner dans une forte concentration de potassium (ci-après dénommé « high [K+] ») est la méthode de choix pour dépolariser la stimulation pour provoquer le SV cyclisme ; allant de la grenouille cholinergique NMJ5, à cultivé des neurones de l’hippocampe cerveau rongeurs15, à la drosophile glutamatergique NMJ modèle16,17. Cette approche [K+] élevée est simple, ne besoin d’aucun équipement spécialisé et est donc accessible à la plupart des laboratoires, mais a des limites pour les application et interprétation des données. Une méthode beaucoup plus physiologiquement appropriée consiste à utiliser l’électrode d’aspiration la stimulation électrique du nerf4,5,12. Cette approche conduit la propagation du potentiel d’action pour la stimulation directe du nerf présynaptique terminal, et les résultats peuvent être comparés directement à des tests électrophysiologiques de neurotransmission fonction13,14, 15, mais besoin d’équipement spécialisé et est techniquement beaucoup plus difficile. Avec l’avènement d’optogenetics, l’utilisation de la stimulation neuronale channelrhodopsin a des avantages supplémentaires, y compris un contrôle strict spatio-temporelle de l’expression des canaux en utilisant le binaire de système de Gal4/UAS20. Cette approche est techniquement beaucoup plus facile que la stimulation de l’électrode d’aspiration et n’exige rien de plus qu’une source de lumière LED très bon marchée. Ici, nous utilisons l’imagerie de FM1-43 (dibromure de pyridiniumN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl)) pour les comparer et contraster ces trois méthodes différentes de stimulation à la drosophile NMJ : haute simple [K+ ], contestant les channelrhodopsin électriques et nouvelles approches.

Protocol

1. larves colle Dissection Bien mélanger 10 parties en élastomère de silicone base avec 1 partie en élastomère de silicone polymérisation agent du kit élastomère (Table des matières). Enrober les lamelles de verre de 22 x 22 mm avec l’élastomère et le remède sur une plaque chauffante à 75 ° c pendant plusieurs heures (jusqu’à ce que n’est plus collant au toucher). Placez une lamelle de verre élastomère unique dans la chambre de dissection de verre plexi …

Representative Results

La figure 1 illustre le flux de travail pour la teinture de FM activité-dépendant du protocole d’imagerie. L’expérience commence toujours par la dissection de larves colle même, peu importe la méthode de stimulation utilisée par la suite. Figure 1 a est une représentation schématique d’une larve disséquée, montrant le cordon nerveux ventral (VNC), irradiant les nerfs et modèle muscle hemisegmental répétées. VN…

Discussion

Haute [K+] la stimulation dépolarisante saline est de loin le plus facile des trois options pour la teinture de FM activité-dépendant du cyclisme, mais probablement la moins physiologique29. Cette méthode simple dépolarise chaque cellule accessible chez l’animal entier et donc ne permet pas aux études dirigées. Il peut être possible d’appliquer localement élevés [K+] une solution saline avec une micropipette, mais cela sera toujours dépolariser les cellules pr?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions les membres Broadie Lab pour contribution à cet article. Ce travail a été soutenu par les NIH R01s MH096832 et MH084989 à K.B. et NIH pré-doctoral fellowship F31 MH111144 à D.L.K.

Materials

SylGard 184 Silicone Elastomer Kit Fisher Scientific NC9644388 To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22×22-1 Fisherbrand 12-542-B To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200 Thermolyne HPA2235M To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber N/A N/A Handmade
Borosilicate Glass Capillaries WPI 1B100F-4 To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller Sutter Instrument P-2000 To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing Component Supply Co. TET-031A For mouth and suction pipette
P2 pipette tip USA Scientific 1111-3700 For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap Fisher Scientific 05-408-120 Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M WPI vetbond Glue used for dissections
Potassium Chloride Fisher Scientific P-217 Forsaline
Sodium Chloride Millipore Sigma S5886 For saline
Magnesium Chloride Fisher Scientific M35-500 For saline
Calcium Chloride Dihydrate Millipore Sigma C7902 For saline
Sucrose Fisher Scientific S5-3 For saline
HEPES Millipore Sigma H3375 For saline
HRP:Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 123-605-021 To label neuronal membranes
Paintbrush Winsor & Newton 94376864793 To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5 WPI 500233 Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) WPI 14177 Used during dissection 
FM1-43 Fisher Scientific T35356 Fluorescent styryl dye
Digital Timer VWR 62344-641 For timing FM dye load/unload 
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope Zeiss For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0 Zeiss Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser Lasos To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser Lasos To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge WPI MF200 To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip BD 301625 To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base) Narishige MMN-9 To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator Grass S48 To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope Zeiss Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective Zeiss Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal Millipore Sigma R2500 Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port Zeiss 2000-C Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm ThorLabs M470L2 Used for ChR activation
T-Cube LED Driver ThorLabs LEDD1B To control the LED
LED Power Supply Cincon Electronics Co. TR15RA150 To power the LED
Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D To measure LED intensity

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Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation. J. Vis. Exp. (135), e57765, doi:10.3791/57765 (2018).

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