Synaptiske vesicle (SV) sykling er kjernen mekanisme intercellulære kommunikasjon på neuronal synapser. FM fargestoff opptak og utgivelsen er hovedmåten å kvantitativt assaying SV endo- og exocytosis. Her sammenligne vi alle stimulering metoder for å drive FM1-43 sykling Drosophila nevromuskulær krysset (NMJ) modell synapse.
FM fargestoffer brukes til å studere synaptic vesicle (SV) syklusen. Disse amphipathic sonder har et hydrofile hode og hydrofobe hale, noe som gjør dem vannløselige med reversibel angi og avslutte membran lipid bilayers. Disse styryl fargestoffer er relativt ikke-fluorescerende i vandig medium, men innsetting ytre heftet av plasma membranen forårsaker en > 40 X økning i fluorescens. I neuronal synapser, er FM fargestoffer internalisert under SV endocytose, trafikkert både innenfor og mellom SV bassenger, og befridd med SV exocytosis, gir et kraftig verktøy for å visualisere presynaptic stadier av neurotransmission. En primær genetisk modell av glutamatergic synapse utvikling og funksjon er Drosophila nevromuskulær krysset (NMJ), der FM fargestoff bildebehandling har vært brukt mye å kvantifisere SV dynamikken i en rekke mutant forhold. NMJ synaptic terminalen er lett tilgjengelig, med en vakker rekke store synaptic boutons ideelt for bildebehandlingsprogrammer. Her vi sammenligne og kontrast på tre måter å stimulere Drosophila NMJ å kjøre aktivitet-avhengige FM1-43 fargestoff opptak/release: 1) bad anvendelse av høy [K+] depolarize nevromuskulær vev, 2) enkel sugeevnen elektrode motor nerve stimulans til depolarize presynaptic nerve terminal, og 3) målrettet transgene uttrykk for channelrhodopsin varianter for lys-stimulert, romlig kontroll av depolarization. Hver av disse metodene har fordeler og ulemper for studier av genetisk mutasjon effekter på SV syklusen på Drosophila NMJ. Vi vil diskutere disse fordeler og ulemper å hjelpe valg av stimulering tilnærming, sammen med metodikkene som er spesifikke for hver strategi. I tillegg til fluorescerende bildebehandling kan FM fargestoffer photoconverted til elektron-tette signaler visualisert bruker overføring elektronmikroskop (TEM) for å studere SV syklus mekanismer på et ultrastructural nivå. Vi tilbyr sammenligninger av AC confocal og elektronmikroskop imaging fra ulike metoder for Drosophila NMJ stimulering, å hjelpe valg av fremtidige eksperimentelle paradigmer.
Vakkert preget Drosophila larver nevromuskulær krysset (NMJ) glutamatergic synapse modellen er brukt til å studere synapse dannelse og fungere med et stort spekter av genetisk forstyrrelser1. Motor neuron terminalen består av flere axon avdelinger, hver med mange forstørret synaptic boutons. Disse capacious varicosities (opptil 5 µm i diameter) inneholder alle neurotransmission maskiner, inkludert uniform glutamatergic synaptic blemmer (SVs; ~ 40 nm i diameter) i cytosolic reserve og lett releasable bassenger2. Disse vesikler dock på de presynaptic plasma membranen fusion aktive områdene (AZs), der exocytosis formidler glutamat nevrotransmitter utgivelsen for trans-synaptic kommunikasjon. Senere, hentes SVs fra plasma membranen via kyss-and-run resirkulering eller clathrin-mediert endocytose (CME) for gjentatte exo/endocytose sykluser. Drosophila NMJ er lett tilgjengelig og godt egnet for både isolere og karakterisere SV syklus mutanter. Bruke frem genetisk skjermer, har romanen mutasjoner ført til identifisering av nye gener kritisk for SV syklus3. Videre har omvendt genetisk tilnærminger starter med allerede kjent gener ført til utviklingen av nye SV syklus mekanismer gjennom forsiktig beskrivelse av mutant sykling fenotyper4. Drosophila NMJ er nesten perfekt som en eksperimentell synaptic forberedelse for dissekere SV endocytose og exocytosis mekanismer via metoder å optisk spor vesicle Sykling under neurotransmission.
En rekke fluorescerende markører tillate visuell sporing av blemmer under sykling dynamics, men den mest allsidige er FM fargestoff analogs som er først syntetisert av Mao, F., et al. 5. strukturelt, FM fargestoffer inneholder en hydrofile hode og en lipofile hale knyttet gjennom en aromatiske ringen, et sentralt område overdragelse spektrale egenskapene. Disse styryl fargestoffer partisjonere reversibel i membraner, ikke ‘flip-flop’ mellom membran brosjyrer og så er aldri gratis i stoffer, og er langt mer fluorescerende i membraner vann5. Reversibel innsetting en lipid bilayer forårsaker en 40-fold økning i fluorescens6. På neuronal synapser består klassisk FM fargestoff merking eksperimenter av bading synaptic utarbeidelse med fargestoff under depolarizing stimulering laste fargestoff via SV endocytose. Eksterne fargestoff deretter vasket bort og SV syklusen er arrestert i en kalsium-gratis ringe løsning å image lastet synapser7. En ny runde med stimulering i en dye-fri bad utløser FM utgivelse gjennom exocytosis, en prosess som kan følges ved å måle fluorescens intensitet reduksjon. SV bestander fra en enkelt vesicle å bassenger som inneholder hundrevis av blemmer kan være kvantitativt overvåkede6,7. FM fargestoffer har blitt brukt til å dissekere aktivitet-avhengige mobilisering av funksjonelt forskjellige SV bassenger og sammenligne kyss-and-run vs CME sykling8,9. Metoden er endret til separat analysen fremkalt, spontane og miniatyr synaptic syklus aktiviteter (med svært følsom utstyr å oppdage svært liten fluorescens endringer og redusere photobleaching)10. Analyser kan utvides til ultrastructural nivå ved photoconverting fluorescerende FM signalet til et elektron-tette etikett for overføring elektronmikroskop11,12,13,14 .
Historisk bading synaptic forberedelser i en høy konsentrasjon av kalium (heretter referert til som “high [K+]”) har vært metoden for valg for depolarizing stimulering å indusere SV syklingen. mellom frosk cholinergic NMJ5, kultivert gnager hjernen hippocampus neurons15 Drosophila glutamatergic NMJ modell16,17. Denne høy [K+] tilnærmingen er enkel, krever ingen spesialisert utstyr, og er derfor tilgjengelig for de fleste laboratorier, men har begrensninger for både programmer og data tolkning. En mye mer fysiologisk metoden er å bruke sugekraft elektrode elektrisk stimulering av nerve4,5,12. Denne tilnærmingen kjører handlingen potensial overføring for direkte stimulering av presynaptic nerve terminal, og resultatene kan være direkte forhold til elektrofysiologiske analyser av neurotransmission funksjonen13,14, 15, men krever spesialisert utstyr og er teknisk mye mer utfordrende. Bruk av optogenetics har bruk av channelrhodopsin nevrale stimulering flere fordeler, inkludert tett spatiotemporal kontroll over kanalen uttrykk med de binære Gal4/UAS system20. Denne tilnærmingen er teknisk mye lettere enn sugekraft elektrode stimulering og krever ikke annet enn en veldig billig LED-lyskilde. Her, brukes avbilding av FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide) å både sammenligne metodene for tre ulike stimulering i Drosophila NMJ: enkel høy [K+ ], utfordrende elektriske og nye channelrhodopsin tilnærminger.
Høy [K+] saltvann depolarizing stimulering er den enkleste av de tre alternativene for aktivitet-avhengige FM fargestoff sykling, men sannsynligvis den minste fysiologiske29. Denne enkle metoden depolarizes hver tilgjengelig celle i hele dyret, og så tillater ikke rettet studier. Det kan være mulig å bruke lokalt høy [K+] saline brønnene med, men dette vil fortsatt depolarize pre/postsynaptic celler og sannsynlig synapse-assosiert glia1. Et annet…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Broadie Lab medlemmer for bidrag til denne artikkelen. Dette arbeidet ble støttet av NIH R01s MH096832 og MH084989 til K.B., og NIH predoctoral fellesskap F31 MH111144 til D.L.K.
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | To put on cover glass for dissections |
Microscope Cover Glass 22×22-1 | Fisherbrand | 12-542-B | To put SylGard on for dissections |
Aluminum Top Hot Plate Type 2200 | Thermolyne | HPA2235M | To cure the SylGard |
Plexi glass dissection chamber | N/A | N/A | Handmade |
Borosilicate Glass Capillaries | WPI | 1B100F-4 | To make suction and glue micropipettes |
Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-2000 | To make suction and glue micropipettes |
Tygon E-3603 Laboratory Tubing | Component Supply Co. | TET-031A | For mouth and suction pipette |
P2 pipette tip | USA Scientific | 1111-3700 | For mouth pipette |
0.6-mL Eppendorf tube cap | Fisher Scientific | 05-408-120 | Used to put glue in for dissection |
Vetbond 3M | WPI | vetbond | Glue used for dissections |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | P-217 | Forsaline |
Sodium Chloride | Millipore Sigma | S5886 | For saline |
Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M35-500 | For saline |
Calcium Chloride Dihydrate | Millipore Sigma | C7902 | For saline |
Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | For saline |
HEPES | Millipore Sigma | H3375 | For saline |
HRP:Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 123-605-021 | To label neuronal membranes |
Paintbrush | Winsor & Newton | 94376864793 | To manipulate the larvae |
Dumont Dumostar Tweezers #5 | WPI | 500233 | Used during dissection |
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) | WPI | 14177 | Used during dissection |
FM1-43 | Fisher Scientific | T35356 | Fluorescent styryl dye |
Digital Timer | VWR | 62344-641 | For timing FM dye load/unload |
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope | Zeiss | For imaging the fluorescent markers | |
Zen 2009 SP2 version 6.0 | Zeiss | Software for imaging on confocal | |
HeNe 633nm laser | Lasos | To excite HRP:647 during imaging | |
Argon 488nm laser | Lasos | To excite the FM dye during imaging | |
Micro-Forge | WPI | MF200 | To fire polish glass micropipettes |
20mL Syringe Slip Tip | BD | 301625 | To suck up the axon for electrical stimulation. |
Micro Manipulator (magnetic base) | Narishige | MMN-9 | To control the suction electrode for electrical stimulation |
Stimulator | Grass | S48 | To control the LED and electrical stimulation |
Zeiss Axioskop Microscope | Zeiss | Used during electrical stimulation. | |
40X Achroplan Water Immersion Objective | Zeiss | Used during electrical stimulation and confocal imaging | |
All-trans Retinal | Millipore Sigma | R2500 | Essential co-factor for ChR2 |
Zeiss Stemi Microscope with camera port | Zeiss | 2000-C | Used during channelrhodopsin stimulation |
LED 470nm | ThorLabs | M470L2 | Used for ChR activation |
T-Cube LED Driver | ThorLabs | LEDD1B | To control the LED |
LED Power Supply | Cincon Electronics Co. | TR15RA150 | To power the LED |
Optical Power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | To measure LED intensity |