Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Краситель FM Велоспорт на синапсе: сравнение деполяризации высоким содержанием калия, электрических и Channelrhodopsin стимуляции

Published: May 24, 2018 doi: 10.3791/57765
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development, Vanderbilt University and Medical Center

Summary

Синаптических пузырьков (SV) Велоспорт-это основной механизм межклеточные связи в нейрональных синапсах. Поглощение красителя FM и выпуска являются основным средством количественно опробование SV эндо - и экзоцитоз. Здесь мы сравниваем все методы стимуляции для привода FM1-43 Велоспорт на синапсы модели нервно-Джанкшен (NMJ) дрозофилы .

Abstract

FM красители используются для изучения цикла синаптических пузырьков (SV). Эти зонды амфифильными есть гидрофильные головы и гидрофобных хвост, делая их водорастворимый с возможностью обратного въезда и выезда из мембраны липидных бислоев. Эти стириловых красителей относительно не флуоресцентные в водной среде, но вызывает вставку в наружный листок плазматической мембраны > 40 X увеличение флуоресценции. В нейрональных синапсах FM красители учитываются во время SV эндоцитоза, ставших предметом торговли, как внутри, так и между SV бассейны и выпущенные с SV экзоцитоз, обеспечивая мощный инструмент для визуализации Пресинаптический этапы синапсах. Основная генетических модель глутаматергические синапсов и функции — дрозофилы нервно-Джанкшен (NMJ), где FM красителя изображений широко используется для количественного определения SV динамика в широком диапазоне условий, мутант. В NMJ синаптических терминал легко доступны, с массивом красивых больших синаптической boutons идеально подходит для визуализации приложений. Здесь, мы сравним и контраст три способа стимулирования дрозофилы NMJ водить зависящих от деятельности FM1-43 краситель поглощения/выпуска: 1) Ванна применение высокого [K+] depolarize нервно-мышечных тканей, 2) всасывания электрода двигательного нерва стимуляция depolarize Пресинаптический нервных терминал и 3) целевых трансгенных выражение channelrhodopsin вариантов для света стимулирует, пространственного управления деполяризации. Каждый из этих методов имеет преимущества и недостатки для изучения генетической мутации воздействия на цикл SV на дрозофилы NMJ. Мы будем обсуждать эти преимущества и недостатки для оказания помощи при выборе стимуляции подхода, а также методологий, специфичные для каждой стратегии. Кроме флуоресцентный изображений, FM красители могут быть photoconverted электронно плотные сигналы визуализируется с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) для изучения механизмов цикла SV на ультраструктурные уровне. Мы предоставляем сравнения конфокальных и электронной микроскопии изображений из различных методов дрозофилы NMJ стимуляции, чтобы помочь при выборе будущих экспериментальных парадигм.

Introduction

СИНАПС красиво характеризуется глутаматергические дрозофилы личиночной нервно-Джанкшен (NMJ) модель использовалась для изучения формирования синапсов и функции с широкий спектр генетических возмущений1. Мотонейрона терминал состоит из нескольких ветвей аксона, каждый с многими расширенного синаптической boutons. Эти емкие Варикоз (до 5 мкм в диаметре) содержат все синапсах механизма, включая единый глутаматергические синаптических пузырьков (СВС; ~ 40 Нм в диаметре) в цитозольной резерва и легко публикуемой бассейна2. Эти пузырьки док на пресинаптической мембраной плазмы фьюжн сайта активных зон (АЗС), где экзоцитоз опосредует выпуск нейромедиатора глутамата для транс-синаптической связи. Впоследствии СВС извлекаются из плазматической мембраны через поцелуй и побегите рециркуляции или Клатрин опосредованный эндоцитоз (CME) для повторного exo/эндоцитоза циклов. Дрозофилы NMJ легко доступны и хорошо подходит для изоляции и характеризующие SV цикла мутантов. Использование вперед генетических экранов, Роман мутации привели к выявлению новых генов критическое для SV цикла3. Кроме того обратный генетические подходы, начиная с уже известных генов привели к прояснению новых механизмов SV цикла через тщательное описание мутант Велоспорт фенотипов4. Дрозофилы NMJ почти идеально как экспериментальный синаптических подготовка для рассечения SV эндоцитоза и экзоцитоз механизмов через методы для оптически трек везикул Велоспорт в синапсах.

Широкий спектр флуоресцентные маркеры позволяют визуального отслеживания во время Велоспорт динамика пузырьков, но наиболее универсальным являются аналогами краситель FM, которые впервые синтезирован Мао, ф., и др. 5. структурно, FM красители содержат гидрофильные головы и липофильных хвост, подключенных через ароматическое кольцо, с центральным регионом, присвоении спектральных свойств. Эти стириловых красителей обратимо разделов в мембранах, не «триггер» между мембраны листовки и поэтому никогда не бесплатно в цитозоле и гораздо более флуоресцентные в мембранах, чем воды5. Реверсивные вставки липидного бислоя вызывает увеличение разницей флуоресценции6. В нейрональных синапсах Классический FM краска маркировки эксперименты состоят из купания синаптических подготовки с красителем во время расшатывания стимуляции для загрузки краситель через SV эндоцитоз. Внешние краситель затем смыл и SV цикла арестован в растворе кальция бесплатный звонок для изображения загружены синапсы7. Второй раунд стимуляции в бане бесплатно краска триггеров релиз FM через экзоцитоз, процесс, который может следовать путем измерения снижение интенсивности флуоресценции. SV населения из одного везикул в бассейны, содержащих сотни везикулы может быть количественно Мониторим6,7. FM красители были использованы для рассечения зависит от активности мобилизации функционально различных бассейнов SV и сравнить поцелуй и побегите против CME Велоспорт8,9. Этот метод был изменен для отдельно пробирного вызывали, спонтанной и миниатюрные синаптических цикла мероприятия (с весьма чувствительной оборудованием для обнаружения изменения очень маленькие флуоресценции и уменьшить Фотообесцвечивание)10. Анализов могут быть расширены до уровня ультраструктурных photoconverting флуоресцентные FM сигнала в электронно плотные этикетку для передачи электронной микроскопии11,12,13,14 .

Исторически купание синаптических препаратов в высокой концентрации калия (далее именуемые как «high [K+]») был методом выбора для расшатывания стимуляции заставить SV Велоспорт; Начиная от лягушки холинергических NMJ5, культивированный грызунов мозга Нейроны гиппокампа15, до16,модель дрозофилы глутаматергические NMJ17. Этот высокий [K+] подход прост, не требует специализированного оборудования и поэтому доступен для большинства лабораторий, но имеет ограничения для приложений и интерпретации данных. Гораздо более физиологически соответствующий метод заключается в использовании всасывания электрода электростимуляции нервов4,5,12. Этот подход диски действий потенциал распространения для прямой стимуляции Пресинаптический нерва терминала, и результаты можно непосредственно по сравнению с электрофизиологических анализов синапсах функции13,14, 15, но требует специализированного оборудования и технически гораздо более сложной. С появлением Оптогенетика использование channelrhodopsin нейронной стимуляции имеет дополнительные преимущества, включая контроль пространственно-временных канала выражения с использованием двоичной системы Gal4/Уан20. Этот подход является технически гораздо проще, чем всасывания электрод стимуляции и требует не более чем очень дешевые светодиодный источник света. Здесь, мы используем изображения FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) пиридиния дибромид) как сравнить и сопоставить эти три различных стимуляции методы на дрозофилы NMJ: простой средней [K+ ], сложных электрических и новой channelrhodopsin подходы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. личиночной клей рассечение

  1. Тщательно смешайте 10 частей силиконового эластомера базы с 1 частью силиконового эластомера Вулканизирующий агент из эластомера kit (Таблица материалов).
  2. Пальто coverslips 22 x 22 мм стекла с эластомера и лечения на горячей плите на 75 градусов на несколько часов (пока больше не липкие на ощупь).
  3. Место одного стекла с покрытием из эластомера coverslip в зале рассечение на заказ plexi стекла (рис. 1, внизу) в рамках подготовки к личиночной рассечение.
  4. Приготовьте клей пипетки от капиллярной боросиликатного стекла, используя стандартный микроэлектродные съемник для получения желаемого конусность и Совет размер.
  5. Аккуратно перерыв с кончика микропипеткой и на другом конце, прикрепить 2 футов гибкой пластиковой трубки (1/32" внутренний диаметр, ID 3/32" наружный диаметр, ОД; 1/32" стены; Таблица материалов) с уст фитинг (наконечник пипетки P2).
  6. Заполните небольшой контейнер (0,6 мл Eppendorf трубка Крышка) с небольшого количества клея (Таблица материалов) в рамках подготовки к личиночной диссекции (~ 20 мкл).
  7. Заполнить камеры с солевой раствор (в мм): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, 70 сахарозы и 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic кислоты (HEPES) рН 7,2.
  8. Добавить анти хрен пероксидазы (ПХ) антитело проспряганное Alexa Fluor 647 (анти-HRP:647; разбавить 1:10 на складе 1 мг/мл) для этикетирования NMJ Пресинаптический терминала во время вскрытия21,22.
  9. С помощью тонкой кистью (размер 2), удалите блуждающих третьего возраста из флакона пищи и на Стекло покровное эластомера покрытием.
  10. Заполните микропипеткой кончик стекла с небольшого количества клея с помощью отрицательных воздуха давление, создаваемое рот с насадкой (шаг 1.5).
  11. Положение личинка спинной стороне вверх с щипцами и клей голову эластомера покрытием coverslip с небольшой капли клея, используя положительное давление воздуха через рот.
  12. Повторите эту процедуру с заднего конца личинка, убедившись, что животное растягивается натянуты между двумя клей вложения.
  13. С помощью ножниц (лезвия 3 мм; Таблица материалов), сделать горизонтальный разрез (~ 1 мм) на задней и вертикальный разрез вдоль наспинная срединная.
  14. С помощью тонкой щипцы (#5, Таблица материалов), аккуратно удалить спинной трахеи, кишечнике, жир тела и других внутренних органов, охватывающих мускулатура.
  15. Повторите процедуру склеивания для четырех стенки тела закрылки, убедившись, что мягко растянуть тело стены горизонтально и вертикально.
  16. Поднимите воспалении брюшины шнур (VNC) с помощью щипцов, тщательно вырезать нервы мотора с ножницами, а затем полностью удалить VNC.
  17. Замените рассечение солевых Ca2 +-бесплатно физраствора (же, как выше рассечение солевых без CaCl2) остановить SV Велоспорт.

2. вариант 1: Высокий [K+] FM краситель загрузки

  1. От Стоковый раствор FM1-43 (4 мм) добавьте 1 мкл в 1 мл 90 мм несогретом растворе (высокая [K+] в солевых рассечение) для окончательного концентрации 4 мкм.
  2. С помощью пипетки, заменить Ca2 +-бесплатный saline на тепловизионные камеры с высокой раствор красителя [K+] FM стимулировать поглощение красителя эндоцитоза SV.
  3. Немедленно начать цифровой таймер на предопределенное время высокого [K+] расшатывания периода стимуляции (например., 5 мин; Рисунок 2).
  4. Для подтверждения здорового личиночной подготовки, отметить сильные сокращения мускулатуры в течение всего периода деполяризации высокой [K+].
  5. Когда заканчивается период таймера, быстро удалить высокой раствор красителя [K+] FM и заменить Ca2 +-бесплатный солевых чтобы остановить SV Велоспорт.
  6. Мыть в быстрой последовательности с Ca2 +-бесплатно солевой раствор (5 x 1 мин) для обеспечения высокой раствор красителя [K+] FM удаляется полностью.
  7. Поддерживать личиночной подготовки в свежих Ca2 +-бесплатный физиологического раствора для немедленной обработки изображений с конфокального микроскопа.

3. томография: Конфокальная микроскопия

  1. Используйте вертикальный Конфокальный микроскоп с 40 X цель погружения воды изображение NMJ краситель флуоресцирования (Прочие микроскопы могут использоваться).
  2. Изображения мышц 4 NMJ абдоминальные сегменты 2-4 (другие NMJs может быть воспроизведен образ) и собирать изображения с помощью соответствующего программного обеспечения (Таблица материалов).
  3. Используйте HeNe 633 нм лазер для возбуждения HRP:647 (с Лонг pass фильтр > 635 нм) и аргон 488 нм лазер для возбуждения FM1-43 (с полосовой фильтр 530-600 Нм).
  4. Оперативно Определите оптимальный усиление и смещение для обоих каналов.
    Примечание: Эти настройки будут остаются постоянными на протяжении всего эксперимента.
  5. Возьмите конфокальный Z-стек через весь выбранный NMJ сверху HRP-отмечен в нижней части синаптического терминала.
  6. Обратите особое внимание образ NMJ (сегмент, стороны и мышц) для обеспечения избыточного точное же NMJ после FM красителя разгрузки.

4. Высокая [K+] стимуляции: FM краситель разгрузки

  1. Заменить Ca2 +-бесплатный физраствора с высокой saline [K+] (без краски FM1-43) для привода деполяризации, SV экзоцитоз и краска релиз.
  2. Немедленно начать цифровой таймер для заранее продолжительность периода высокой стимуляции [K+] (например., 2 мин; Рисунок 2).
  3. Когда заканчивается период таймера, немедленно удалите высокой saline [K+] и замените Ca2 +-бесплатный солевых чтобы остановить SV Велоспорт.
  4. Мыть в быстрой последовательности с Ca2 +-бесплатно солевой раствор (5 x 1 мин) для обеспечения высокой saline [K+] полностью удаляется.
  5. Поддерживать личиночной подготовки в свежих Ca2 +-бесплатный физиологического раствора для немедленной обработки изображений с конфокального микроскопа.
  6. Убедитесь в том, что изображение FM1-43 краситель флуоресценции в же NMJ отметили выше, используя те же конфокальный параметры.

5. вариант 2: Электрическая стимуляция FM краситель загрузки

  1. Подготовьте всасывающий пипетки с помощью съемника микроэлектродные (Таблица материалов) для получения требуемых конусность и Совет размер.
  2. Огонь польский микроэлектродные наконечник с микро Кузница пока одного двигательного нерва может всасывается с плотную посадку.
  3. Сползите всасывания пипетки на держатель электрода на микроманипулятор и прикрепить к длинные гибкие пластиковые трубы и шприц.
  4. Задать параметры стимулятор (например., 15 V, частота 20 Гц, 20 мс продолжительность и время 5 минут (рис. 2) или 1 мин (рис. 3)).
  5. Заменить Ca2 +-бесплатный saline на личиночной подготовки с выше FM1-43 физраствора (4 мкм; CaCl 1 мм2) на стенде электрофизиологии.
  6. Положите подготовку на этапе микроскопа и поднять стадии до тех пор, пока личинки и всасывания пипеткой находятся в фокусе (40 X цель погружения в воду).
  7. Всасывать цикл резки двигательного нерва, иннервирующих выбранного hemisegment с отрицательным воздуха давление, создаваемое шприц в всасывания электрода.
  8. Протестируйте функцию всасывания электрод с короткий всплеск стимуляции во время визуально мониторинг для мышц в выбранной hemisegment.
  9. Стимулировать двигательного нерва, с использованием выбранных параметров (шаг 5.4) водить SV эндоцитоза и поглощение красителя FM1-43 (рис. 2).
  10. Мыть в быстрой последовательности с Ca2 +-бесплатно солевой раствор (5 x 1 мин) для обеспечения, чтобы полностью удалить раствор красителя FM1-43.
  11. Поддерживать личиночной подготовки в свежих Ca2 +-бесплатный физиологического раствора для немедленного изображений по протоколу конфокальный изображений от выше.
  12. Обратите особое внимание образ NMJ (сегмент, стороны и мышц), обеспечить доступ к точным же NMJ после разгрузки краситель FM.

6. Электрическая стимуляция: FM краситель разгрузки

  1. Заменить Ca2 +-бесплатно физраствора с регулярной физраствора (без краски FM1-43) и место подготовки обратно на сцене Рог электрофизиологии.
  2. Установите параметры стимулятором для разгрузки (например, 15 V, частота 20 Гц, 20 мс продолжительность и время 2 мин (рис. 2) или 20 s (рис. 3)).
  3. Сосать же двигательного нерва в же электрода, как указано выше и затем стимулировать активировать экзоцитоз SV и FM1-43 краситель релиз.
  4. Мыть в быстрой последовательности с Ca2 +-бесплатно солевой раствор (5 x 1 мин) для обеспечения внешнего краска удаляется полностью.
  5. Поддерживать личиночной подготовки в свежих Ca2 +-бесплатный физиологического раствора для немедленной обработки изображений с конфокального микроскопа.
  6. Обеспечить, чтобы изображение FM1-43 краситель флуоресценции в же NMJ отметили выше, используя те же конфокальный параметры.

7. вариант 3: Channelrhodopsin стимуляции FM краситель загрузки

  1. Повышение ChR2-выражая личинки на пищевые продукты, содержащие ChR2 одним фактором все транс сетчатки (растворяют в этаноле; 100 мкм конечная концентрация).
  2. Место личиночной подготовки в зале оргстекла на вскрытие микроскопа с портом камеры.
  3. Прикрепить синий светодиод (470 Нм; Таблица материалов) для программируемых стимулятор с помощью коаксиального кабеля и светодиод в порт камеры.
  4. Луч света фокус синий светодиод на функцию расчлененных личинок, используя функцию масштабирования Микроскоп.
  5. Заменить Ca2 +-бесплатный saline на личиночной подготовки с выше FM1-43 физраствора (4 мкм; CaCl 1 мм2) на optogenetic стадии.
  6. Установите параметры LED с помощью стимулятора (например, 15 V, частота 20 Гц, 20 мс продолжительность и время 5 мин (рис. 2)).
  7. Запустите легкой стимуляции и отслеживать с помощью таймера для заранее определенной продолжительности периода стимуляции optogenetic (например, 5 мин; Рисунок 2).
  8. Когда таймер останавливается, быстро удалить раствор красителя FM и заменить Ca2 +-бесплатный солевых чтобы остановить SV Велоспорт.
  9. Мыть в быстрой последовательности с Ca2 +-бесплатно солевой раствор (5 x 1 мин) для обеспечения раствор красителя FM удаляется полностью.
  10. Поддерживать личиночной подготовки в свежих Ca2 +-бесплатный физиологического раствора для немедленной обработки изображений с конфокального микроскопа с помощью визуализации протокола от выше.
  11. Обратите особое внимание образ NMJ (сегмент, стороны и мышц), обеспечить доступ к точным же NMJ после разгрузки краситель FM.

8. Channelrhodopsin стимуляции: FM краситель разгрузки

  1. Заменить Ca2 +-бесплатный физраствора с регулярной физраствора (без краски FM1-43) на рассечение микроскопа с камерой порт LED сосредоточены на личинки.
  2. Установите параметры стимулятором для разгрузки (например, 15 V, частота 20 Гц, 20 мс продолжительность и время 2 мин (рис. 2)).
  3. Запустите легкой стимуляции и отслеживать с помощью таймера в течение предопределенного периода стимуляции optogenetic (например, 2 мин; Рисунок 2).
  4. Когда заканчивается период таймера, быстро удалить раствор красителя FM и заменить Ca2 +-бесплатный солевых чтобы остановить SV Велоспорт.
  5. Мыть в быстрой последовательности с Ca2 +-бесплатно солевой раствор (5 x 1 мин) для обеспечения внешнего краска удаляется полностью.
  6. Поддерживать личиночной подготовки в свежих Ca2 +-бесплатный физиологического раствора для немедленной обработки изображений с конфокального микроскопа.
  7. Обеспечить, чтобы изображение FM1-43 краситель флуоресценции в же NMJ отметили выше, используя те же конфокальный параметры.

9. флуоресценции количественная оценка

  1. Загрузить изображение в изображении J (низ открытым исходным кодом) и создать проекцию максимальной интенсивности, щелкнув изображение | Стеки | Проект Z.
  2. Использование анти-HRP:647 канал, перейдите к изображение | Отрегулируйте | Порог и слайд верхней панели инструментов до тех пор, пока просто NMJ выделена.
  3. Использование палочки инструмент, нажмите на NMJ. Если NMJ разрывными, удерживайте нажатой кнопку Shift и выберите все детали.
  4. Изменить изображение на канал краситель FM1-43 и перейти на анализ | Мера измерения флуоресценции.
  5. Повторите шаги 9.1-9.4 для «выгрузить» изображения от же NMJ (выявленных сегмента, стороны и мышц).
  6. Чтобы получить процент краска, которая была выгружена, принять отношение интенсивности флуоресценции выгрузки/загрузки.
    Примечание: Эта процедура может быть изменен для анализа флуоресцирования на основе бутон за бутона, с помощью инструментов «Овал» или «от руки» выбор. Флуоресценции фона может быть вычтен путем отбора проб мышечных флуоресценции. Агенты также могут добавляться уменьшить этот фон.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Рисунок 1 показывает поток работы для деятельности зависимых FM красителя изображений протокол. Эксперимента всегда начинается с же личиночной клей рассечение, независимо от метода стимуляции впоследствии используется. Рисунок 1a является схема расчлененных личинки, показывая воспалении брюшины шнур (VNC), излучающих нервы и мышцы шаблон неоднократно hemisegmental. VNC удаляется и подготовки купались в 4 μm раствор FM1-43 (рис. 1b, розовый). Подготовка затем стимулируется присутствии FM краситель, используя один из трех возможных вариантов для загрузки краситель через деятельность зависимых SV эндоцитоза (Рисунок 1cI-III). Далее, FM краситель Велоспорт арестован с помощью Ca2 +-бесплатный физиологического раствора и конкретных NMJ терминал, который был загружен с красителем FM является образ с помощью конфокального микроскопа («загруженного изображения»; Рисунок 1 d). В этом случае мышцы, выбранные с размещением схематический показ нерва, NMJ терминала ветвления и FM 4 NMJ загружен синаптической boutons. Синаптических подготовка стимулируется второй раз, используя тот же метод, выбранного выше, но в отсутствие FM краситель для SV экзоцитоз и FM1-43 выпуска (Рисунок 1e). То же выявлены NMJ (мышцы 4 NMJ в этом примере) затем воспроизведен образ с помощью HRP:647 синаптических label и остаточный сигнал везикул FM1-43 («выгрузить изображение»; Рисунок 1f). Экспериментатор определяет прочность и продолжительность загрузки и разгрузки фаз для оптимизации измерений для конкретного анализа или мутант условие. Интенсивность флуоресценции количественно после погрузки и разгрузки (рис. 1 d, 1f), чтобы получить измерения эндоцитоза синаптических краситель, экзоцитоз и процент загрузки FM краситель выпущена. Анализ может быть сделано для всего NMJ или одного boutons.

Краситель FM Велоспорт может быть поддержано тремя способами: 1) высокий [K+] физиологическим деполяризации всей подготовки, 2) всасывания электрод стимуляции двигательного нерва, или 3) света ведомый Активация целевых channelrhodopsin (ChR2; Рисунок 2). Для прямого бок о бок сравнения всех трех методов мы стимулировали с каждым подходом для 5 минут в присутствии FM1-43 (загрузки), а затем на 2 мин в отсутствие FM1-43 (разгрузки) и образы HRP-меченых NMJs с использованием параметров идентичны конфокальных ( Рисунок 2). Высокий метод физиологическим деполяризации [K+] следует широко используется протокол FM1-43 для личинок NMJ дрозофилы 23, за исключением мы используем клей вместо булавки для личинок рассечение. Клей избегает вмешательства с микроскопом цели и позволяет более точное определение напряжения стенки тела, но требуют средней кривой обучения. Все три метода производят сильного и последовательного флуоресцентные сигналов во всем Арбор синаптических бутона NMJ и в пределах отдельных синаптической boutons (вставки). Все NMJs быть FM-загрузки всей личинка, как он depolarizes каждый нейрон в животных (рис. 2A, средний) вызывает высокий метод физиологическим деполяризации [K+]. Метод электрической стимуляции нервов всасывания электрода диски только в одной hemisegment личинок, для которых соответствующие иннервирующих двигательный нерв был стимулировали (Рисунок 2B, средний). Кератоз сегментов в то же самое животное различаются с помощью метки HRP, но содержат не наблюдаемый Люминесцентную краску загрузки и служат отличным внутреннего контроля. Optogenetic метод ChR2 производит целевых деполяризации зависит от трансгенных Gal4 драйвера работают (рис. 2 c). Здесь водитель был везикулярного глутамата транспортера (vglut) Gal4, поэтому все нейроны глутаматергические деполяризованный с голубой свет стимуляции, включая все глутаматергические двигательных нейронов. В результате все NMJs загружаются с красителем FM1-43 в этом примере (рис. 2 c, средние). Клетки конкретного драйвера может использоваться для обозначения конкретных NMJs и оставить другие без маркировки для внутреннего контроля.

Разгрузки краситель FM была достигнута через тот же метод, который использовался для загрузки красителя. В первом методе личинок подготовки был просто купались в высокой [K+] физиологического раствора в отсутствие FM1-43 depolarize клетки, диск SV экзоцитоз, и выгрузить синаптических терминалы (рис. 2A, право). Мы обычно выберите более короткий период разгрузки (2 мин), так что разгрузка частичной и терминалы остаются видимыми в FM канал. Всасывания электрода электрической стимуляции выгрузки является значительно более сложным, потому что она предполагает возвращение же hemisegment, выявление же нерва и повторно стимулирования этого нерва в отсутствие FM1-43 водить разгрузки краситель (Рисунок 2B , справа). Обратите внимание, что краска разгрузки снова было частичное. ChR2 Разгрузка влечет за собой второй период синий светодиод подсветки личиночной подготовки в отсутствие FM1-43 активировать каналы, depolarize двигательных нейронов и стимулировать SV экзоцитоз краситель релиз (рис. 2 c, справа). С этой шкале разгрузка (2 мин), каждый из них depolarization методы выгружаются лишь процент загруженного краска FM1-43, с высокой [K+] сильных и слабых в автошколах краситель релиз (рис. 2) ChR2. Мы измерили индикатор интенсивности света используется (140 мкВт/мм2), который был в опубликованных диапазона (20-1000 мкВт/мм2)24,25,26. ChR2 максимально активируется ~ 1 МВт освещения от 50-200 МВт источников света, с ChR2 эффективность также зависит от концентрации ATR, кормили личинка27,28. Таким образом можно манипулировать ChR2 стимуляции силой. Кроме того отношения не могут оставаться поистине с другими стимуляции сильные, графиков или генотипов. Если экспериментатор работает с мутант, что уменьшилась SV эндоцитоз или необычно быстро экзоцитоз, параметров стимуляции может потребоваться изменить сохранить наблюдаемый сигнал после разгрузки. Анти ПХ ярлык позволяет идентифицировать NMJ даже при полном отсутствии сигнала FM, но это не является идеальным для количественной оценки. В принципе разгрузки стимуляции может также быть другого типа от загрузки стимуляции.

Мы недавно изучал потери секретируемые синаптической deacylase Notum воздействия на цикл SV, с помощью электрической стимуляции4. Здесь мы расширяем этот анализ для сравнения 1) высокая [K+] деполяризации и 2) всасывания электрода двигательного нерва стимуляции методы (рис. 3). Мы находим, что оба методы дают аналогичный результат, показываю сокращены FM1-43 краситель, погрузка в Notum мутант значение null; Однако степень фенотипа отличается между двумя методами. После деполяризации с высоким [K+] физиологического раствора для пяти минут с высоким уровнем и Notum значение null мутантов (NotumKO существует большое снижение интенсивности загрузки флуоресценции между генетический фон управления (w1118) ) с низким уровнем (рис. 3A, сверху). В количественных измерений нормализованных FM интенсивности флуоресценции в ПХ изложенные NMJ терминалы значительно уменьшается в случае отсутствия Notum (± 0,05w1118 1.0 против NotumKO 0,57 ± 0,07; n≥13, p < 0,0001; Рисунок 3B). После электрической стимуляции при 20 Гц за 1 мин мы находим незначительное снижение интенсивности загрузки FM1-43 между элементами управления и Notum значения NULL, когда количественная оценка всей NMJ флуоресцирования (w1118 1,0 ± 0,05 против NotumKO 0.86 ± 0,06; n = 8, p = 0,10; Рисунок 3А, Б). При измерении включение краска на основе бутон за бутона, мы находим значительное уменьшение краситель, загружен с обоих методов. В количественных измерений после стимуляции с высоким [K+] физиологического раствора, нормализованных интенсивности флуоресценции FM на бутон значительно сократилось (w1118 1,0 ± 0,02 против NotumKO 0,52 ± 0,02; n≥241, p< 0,0001; Рисунок 3 c). После электростимуляции, нормализованных флуоресценции интенсивности за бутона также значительно сократилось, хотя и в меньшей степени (w1118 1,0 ± 0,02 против NotumKO 0,83 ± 0,02; n≥127, p< 0,0001; Рисунок 3 c).

Результат различия между двумя парадигмами стимуляции может быть вызвано целым рядом факторов. Во-первых, сила стимуляции считается более с высоким [K+] по сравнению с электрическими двигательного нерва стимуляции. Электрофизиологии записи не может быть сделано в присутствии высоких saline [K+], но личинок neuromusculature ясно энергично стимулируется, как сокращения мышц, сильной и постоянной на протяжении всего периода купания 5 мин. Однако мы не знаем силу или частоты стимуляции. В противоположность этому электрической стимуляции гораздо более управляется с пользователей, выбрав точное напряжение сила и частота стимуляции. Во-вторых, продолжительность стимуляции был длиннее с высоким [K+] по сравнению с электрическими нерва стимуляции (рис. 3). Мы выбрали 1 min 20 Гц электрической стимуляции после повторных судебных разбирательств. После 1 мин краситель загрузки был сильный и надежный сигнал FM1-43, поэтому мы выбрали эту парадигму для нашего исследования4, хотя 5 минут стимуляции дал еще сильнее флуоресцентного сигнала (рис. 2). Таким образом длина стимуляции парадигмы вероятно вклад величины изменчивости в FM1-43 загрузки между high [K+] и электрической стимуляции (рис. 3B, C). Хотя метод высокой [K+] показали более надежной фенотип для Notum мутантов, мы по-прежнему используется метод электрического из-за большего управления4. Существует много параметров для управления, например частота, интенсивность и длительность стимуляции, и эти параметры должны решаться на основе мутантных и вопрос. Например выбор метода стимуляции может зависеть от SV бассейн допрашивали7 и изучен механизм деятельности-зависимых от10.

После загрузки в NMJ терминал FM1-43 можно использовать Люминесцентная краска photoconversion производить электронно плотные сигнал для электронной микроскопии (рис. 4). В этом методе подготовка красителя загружен подвергается интенсивным флуоресцентный свет присутствии Диаминобензидин (DAB), с реактивнооксигенных видов от FM краситель, окисляющие DAB для создания темный осадок (рис. 4A)11. Пожалуйста, смотрите статью JoVE на photoconversion стириловых красителей для подробной12. Преимущество этого метода является, что СВС четко выявлены на ультраструктурные уровне, хотя цикл SV конечно арестован с статические микроскопа изображений. В отсутствие стимуляции, синаптической boutons на дрозофилы NMJ плотно загружаются с пузырьки (~ 40 Нм в диаметре; Рисунок 4B), с редким явлением расширенного органеллы (>100 Нм в диаметре), как предполагается, Велоспорт endosomes. Высокое [K+] солевых расшатывания стимуляции сильно изменяет этот профиль, с частичной истощение населения SV и быстрое накопление многочисленных расширенного органеллы (>100 Нм в диаметре), как считается, являются производными от массового эндоцитоза плазматической мембраны (рис. 4 c, слева). Хотя кератоз управления существуют аналогичные отсеков, высокой плотности эти органеллы после высокого [K+] физиологическим деполяризации вызывает озабоченность по поводу того, что это может быть не физиологическая реакция. Электрическая стимуляция всасывания электрода двигательного нерва сравнительно более эффективным в истощению SV населения и не производить больше пузырьков расширенного от англ (рис. 4 d, слева). Это свидетельствует о том, что основная эндоцитоза обусловлен высокой [K+] деполяризации помогает поддерживать SV населения в течение более интенсивным спросом.

FM1-43 photoconversion может быть достигнуто с помощью высокой [K+] физиологическим деполяризации или всасывания электрода электростимуляции двигательного нерва, для сравнения синаптических Ультраструктура относительно отдыха бутона (рис. 4). С высокой [K+] расшатывания стимуляции, как отдельных СВС, так и расширенного везикулы (>100 Нм в диаметре) могут быть помечены с электронно плотные DAB осадок следующим свет управляемый photoconversion (рис. 4 c, право). По неизвестным причинам расширенного везикул мембранных обычно менее плотно помечены, чем меньше SV мембраны. Кроме того СВС часто появляются наполнен DAB осадок, а не просто мембраны, но это делает их гораздо легче отличить от неподписанных везикулы. С всасывания электрод стимуляции двигательного нерва Велоспорт SV населения также может быть отмечен относительно немеченого СВС (рис. 4 d, право). С электрической стимуляции, расширен везикулы (>100 Нм в диаметре) не образуются detectably в boutons и, неизменно, мембраны предполагаемой endosomes не обозначены FM1-43 photoconversion. Как выше, Велоспорт СВС обычно заполнены DAB осадка в несколько обновляющие моды и поэтому более легко отличить от СВС, которые не были сформированы во время стимуляции (рис. 4 d, право). Мы еще не пытались photoconversion после стимуляции ChR2. Курсы в разное время стимуляции FM1-43 краситель photoconversion позволяет определить, где формируются СВС, как продают СВС и сроков движения между различных пространственных бассейнов в синаптических бутона. Сравнение средней [K+] и стимуляция нерва позволяет рассечение сыпучих и Двухместный SV эндоцитоза механизмов.

Figure 1
Рисунок 1: Схема FM1-43 красителя загрузки протокол на дрозофилы NMJ. Личинок клей рассечение производит плоский neuromusculature подготовки, шнуром воспалении брюшины (VNC) проектирование сегментарных нервов от брюшной срединной (Vm) hemisegmentally повторил стенки тела мышечные массивы (шаг). VNC режется бесплатно, и весь личиночной рассечение затем инкубируют в розовый раствор FM1-43 (4 мкм) в рамках подготовки к стимуляции (шаг b). FM1-43 затем загружается с выбранной стимуляции парадигмы (шаг 3); с параметрами высокого [K+] деполяризации всего личинки (cI) всасывания электрод стимуляции одного двигательного нерва (cII), или свет driven активации весьма целевой channelrhodopsin (cIII). FM1-43 включение арестован с помощью Ca2 +-бесплатные физиологического раствора и загружен краситель NMJ образы (шаг d). Затем второй стимуляции делается без FM1-43 в ванне для привода краситель синаптических пузырьков экзоцитоз (шаг e). Же NMJ затем повторно imaged в assay выгружен синаптических терминал (шаг f). Интенсивности флуоресценции измеряется от загрузки и выгрузки NMJs для количественного определения SV эндоцитоза и SV экзоцитоз уровнях. На нижней панели показывает строительство параметры и размеры для Прозрачный акриловый камеры, используемые для этих исследований. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: FM красителя погрузки и разгрузки сравнение всех методов стимуляции. Сравнение FM1-43 красителя погрузки и разгрузки в Блуждающие третьего instar NMJ с 1) высокий [K+] деполяризации всего личиночной подготовки (вверху), 2) всасывания электрода электростимуляции двигательного нерва (в середине) и 3) свет- Активация целевой channelrhodopsin (ChR2) только в двигательных нейронов (внизу). (A) личинок NMJ помечены анти-HRP:647 пресинаптической мембраны маркер (синий, слева), загружается с FM1-43 через высокий деполяризации [K+] за 5 мин (в середине) и затем выгружается через высокие [K+] деполяризации на 2 мин (B) Сравнение с всасывания электрод стимуляции нервных с те же периоды стимулы для обоих FM1-43 краситель погрузки и разгрузки. (C) целевых vglut-Gal4>бла-ChR2-H134R выражение в двигательных нейронов активируется с синим (470 Нм) света за те же периоды раздражители FM1-43 красителя погрузки и разгрузки. Звездочками относятся к вставками, показано выше, увеличение boutons. В баре шкалы составляет 10 мкм, с вставкой синаптической boutons расширен 3.5 X из главных панелей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Значение null мутантов Notum Показать сокращения красителя FM загрузки в синаптической boutons. FM1-43 загружается в синаптических терминалы блуждающих третий Инстар NMJ сравнения генетического контроля (w1118) для Notum значение null мутантов (NotumKO). (A) NMJ boutons помечены высокой деполяризации [K+] весь личиночной подготовки (вверху) или всасывания электрод стимуляции одного двигательного нерва (внизу) в w1118 (слева) и NotumKO (справа). (B) определенного загружен FM1-43 флуоресценции в NMJ как точечная сравнения высоких [K+] деполяризации и всасывания электрод стимуляции в элементах управления w1118 против мутантов NotumKO . (C) определенного загружен флуоресцирования на основе бутон за бутона как коробки и нитевидные график сравнения высоких [K+] деполяризации и всасывания электрод стимуляции в элементах управления w1118 против Notum,ко . Студента двустороннее t тесты проводились для каждого сравнения с p значений, отображаемых на графиках. Бары показывают среднее ± SEM, сделанные с призмой (версии 7.0 для Windows). Электрическая стимуляция данных был адаптирован с разрешения Kopke et al., 144 развития (19): 3499-510, 2017. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: синаптических Ультраструктура с FM photoconversion краситель для обозначения везикулы. Флуоресцентный FM1-43 может быть photoconverted к электронно плотные преципитат Диаминобензидин окисляется (DAB) для визуализации через просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА). (A) A схема метода photoconversion для обозначения NMJ дрозофилы , после окрашивания FM1-43 зависящих от деятельности загрузки. (B) представитель ТЕА изображение синаптических бутона wildtype в состоянии покоя (кератоз). Обратите внимание на плотность населения единообразного размера SVs. (C) синаптической boutons которые стимулировали с высоким [K+] физиологическим деполяризации за 5 мин, без photoconversion (слева) или с FM1-43 photoconversion (справа). Обратите внимание на наличие массовых структур от англ, маркировкой и без маркировки. (D) синаптической boutons, которые электрически стимулировали с нерва всасывания электрода при 20 Гц за 5 мин не photoconversion (слева) или с FM1-43 photoconversion (справа). Обратите внимание, что краситель загружен пузырьки появляются намного темнее, чем прилегающие выгружен везикулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Высокое [K+] физиологический деполяризующий стимуляция является на сегодняшний день самым простым из трех вариантов для зависящих от деятельности FM краситель Велоспорт, но вероятно наименее физиологических29. Этот простой метод depolarizes каждой доступной клетки тела животного и поэтому не позволяют направлены исследования. Это может быть возможность локально применять высокие [K+] физраствора с микропипеткой, но это будет по-прежнему depolarize pre/postsynaptic клетки и вероятно СИНАПС связанные глии1. Еще одной серьезной проблемой является что высокие [K+] деполяризации диски быстрое формирование массовых endosomes, что только редко встречаются в кератоз boutons. Однако основная endosome формирование является активный механизм заблокированы мутации29, указав реальный физиологический процесс. Таким образом FM1-43 изображений с высоким деполяризации [K+] может использоваться для выборочного изучения массовых эндоцитоза на синапсы. Всасывания электрода электростимуляции двигательного нерва является гораздо более управляемый метод. Это имеет то преимущество, что стимулируется только один Аксон расслоение, и только Пресинаптический Термини находится непосредственно деполяризованный (конечно, мышечные волокна затем деполяризованный действием передатчика). Поэтому он обеспечивает большой внутреннего контроля NMJs в то же самое животное, которое не стимулируются. Этот метод позволяет жестко контролировать параметры стимуляции, в отличие от метода стимуляции высокой [K+], что позволяет прямое сравнение с электрофизиологии записи4. Однако этот метод требует специализированного оборудования и достаточно высокий уровень технического мастерства и поэтому менее доступной. Свет driven Активация целевых channelrhodopsin (ChR2) имеет преимущество Ориентация выберите нейронов30. Этот метод требует не знакомы с методами электрофизиологии и может быть сделано с очень дешевое оборудование в любой лаборатории, но этот подход требует базовые знания генетики дрозофилы .

Выбор параметров стимуляции является критически важным для тестирования SV цикла динамики запрашивается в рамках ряда генетических условий с высоко вариабельные фенотипов1. Для всех методов, внешний [Ca2 +] используется является ключевым параметром, контролируя движущей силой SV Велоспорт. С высокой метода стимуляции [K+], важный выбор является [K+] используется, которая определяет степень деполяризации прочности. Измерения дрозофилы гемолимфы указывают [K+] 5 мм и 90 мм обычно концентрация, чаще всего выбирают для деятельности стимуляции3,7,15,17 , 31. Однако, изменять стимуляции силой5,16,32был нанят [K+] диапазон от 30-90 мм. Другой критический параметр решение является длина высокого [K+] стимуляции для обоих FM1-43 погрузки и разгрузки. Период для загрузки определяет ли население Велоспорт SV фактически загружен, или только подмножество активных везикулы7. Период для разгрузки аналогично диктует процент СВС, претерпевает экзоцитоз в период стимуляции, которые можно раскрыть или скрывать мутант фенотипов зависит скорость изменения в SV Велоспорт частоты2. С всасывания электрода электрического двигательного нерва стимуляции выбор параметра включают также стимуляции напряжения, частоты, продолжительности и частоты пульса интервала. Височно узорной деятельности является ключевым фактором, определяющим SV Велоспорт динамика7, и различные стимуляции шаблоны можно выборочно мобилизации отдельных бассейнов SV. С целевых ориентированных на свет ChR2 активации, выбор включают в себя все выше (с переменными интенсивности света) и дополнительные трансгенных варианты обсуждаются в следующем разделе. С этим параметром выбор приходит более экспериментальный контроль, но и увеличение технической сложности.

Channelrhodopsin-2 (ChR2) является проницаемой для моно - и двухвалентной катионов33канал закрытый свет мембраны. Если выбран ChR2 стимуляции, есть много вариантов следует включая Gal4 водитель, бла-ChR2 конструкцию и переменные источника света для активации канала. Gal4 драйверы варьируются от вездесущих весьма специфический. Например, повсеместно UH1-Gal4 (daughterless) хотел бы выразить ChR2 в каждой ячейке, тогда как CcapR-Gal4 (Janelia) диски ChR2 в мышцах NMJ 6/7, но не в мышцах 4 NMJ31,34. Эта избирательность может использоваться как мощный внутреннего контроля. Есть также много вариантов бла-ChR2, включая ChR2-H134R (используется здесь; мутировавших остатков причины повышенной photocurrents)35, VChR1, начальника и многие более36. Каждый из этих вариантов канал имеет различные свойства света стробирования, проводимость, ионная селективность, кинетика и десенсибилизации. Обратите внимание, что некоторые конструкции содержат флуоресцентные тег, который может мешать FM изображений. К примеру, бла-ChR2-H134R здесь отмеченных mCherry (ex: 587 Нм, Эм: 610 Нм), но не производят хрусталику выбросов с FM1-43 (ex: 479 Нм, Эм: 598 Нм) изображений фильтры. Выбор технических параметров включают источник света, волны и интенсивности для активации канала. Параметр, используемый здесь это дешевый голубой светодиодами LED, при стимуляции, наглядно подтверждается опробование сокращения мышц. Мы также были успешными в активации ChR2 с помощью эпифлуоресцентного, хотя Сканирующий конфокальный лазерный не было достаточно. Эпифлуоресцентного могут быть использованы в целевых стимуляции (конкретных сегментов вместо всего животных), но параметров стимуляции трудны для управления, тогда как индикатор подключен до простой стимулятора легко изменяет продолжительность и частота света импульсов. Сосредоточение внимания светодиодный свет через порт камеры микроскопа рассечение позволяет более управляемой, интенсивный свет стимуляции.

Это зависит от экспериментатора или не оставить нетронутыми воспалении брюшины шнур/мозга во время стимуляции парадигмы. Мы решили удалить всю центральную нервную систему для сравнения трех методов, используемых здесь, но иногда вверх по течению проводки осталось нетронутыми15. Осложнение-эндогенного нейронной активности происходит всякий раз, когда осталось всего нервной системы. Степень этой деятельности является сильно варьирует от животного к животному, в значительной степени зависит от опыта рассечение экспериментатора. Эта переменная деятельность может способствовать количество красителя FM1-43, которая загружается и выгружается, который поэтому не только из-за внешних стимуляции занятых15. Смежных технических осложнений, что нетронутыми расчлененных личинки контракт мускулатура в фиктивном движения, и это перемещение существенно мешает с NMJ изображений. Это движение облегчено, если удаляется центральной нервной системы, а также через приложение Ca2 +-бесплатные физиологического раствора во время визуализации4. Эти подходы, используемые здесь достаточно, чтобы позволить отличные FM1-43 красителя изображений в подготовке NMJ. Однако некоторые экспериментаторы решили добавить препараты ингибируют сокращение мышц (например, рианодиновыми, philanthotoxin-433), или использовать потенциал действия блокаторы (например, Тетродотоксин)37,38. Широкий спектр препаратов может использоваться избирательно управлять SV цикла, с тем чтобы выделить определенные шаги, или подчеркнет мутант фенотипов для изучения механизмов синапсах. Например, некоторые экспериментаторы используют Veratridine (активирует напряжения закрытый Na+ каналы39) для увеличения загрузки в резерв, циклоспорин (подавляет активность кальциневрина40) для повышения SV эндоцитоза, SV и Форсколин (активирует adenylyl циклазы41, которая улучшает синаптическую передачу42) для увеличения exo/Эндо Велоспорт бассейн7,,4344. Такие фармакологических манипуляций может обеспечить дополнительные идеи. И наконец FM1-43 фона может произойти в различной степени основаны на качество вскрытия, мытье эффективность и стимуляции протокол. Некоторые добавляют sulfobutylated производное β-циклодекстрина Advasep-745, или водный Флюорофор sulforhodamine46, чтобы утолить неспецифических флуоресценции и улучшения соотношения сигнал фон.

Существуют многочисленные методы, которые могут сопровождать FM флуоресцентных изображений для углубления понимания SV цикла (например, электрофизиологии, synaptopHluorin, электронная микроскопия). Пример, показанный здесь, это FM флуоресценции photoconversion, которая используется для изучения SV цикла ультраструктурных подробно. СВС объединяются в несколько бассейнов, которые являются территориально и функционально различных2. Легко публикуемой бассейн (RRP) содержит везикулы, немедленно освобожден после острой стимуляции. Более крупные рециркуляции пул поддерживает SV выпуска в условиях умеренной активности. Только внутренний резерв (RP) набирается с сильным (казалось бы рядом физиологических) стимуляции2. SV бассейны, которые активируются, зависят от типа стимуляции используется47, и доклады от дрозофилы NMJ с помощью FM photoconversion показали понимание ключевых пространственных и функциональных свойств этих различных бассейнов ОКП48. FM photoconversion могут быть использованы для изучения SV пулов активирован при стимуляции различных парадигм и запроса такие вопросы, как давно обсуждаемая людьми взаимодействия между endosomes и СВС49. Если экспериментатор заинтересована в FM изображений в сочетании с другими зависящих от деятельности изменения в синапсе, якобы поправимо аналоговый FM1-43 краситель (FM1-43FX). Этот зонд должен позволяют исправить дрозофилы NMJ после краска активность зависимой загрузки и затем следовать с антитела маркировки для тестирования для корреляции между бутона уровень активности (Люминесцентная краска FM) и деятельности зависимой выражения протеин интереса. В будущем, это будет чрезвычайно полезным изучить дополнительные методы, позволяющие комбинацию FM красителя изображений с других изображений подходов на красивых дрозофилы NMJ модель синапса.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют не конкурирующие интересы.

Acknowledgments

Мы благодарим членов Broadie лаборатории за вклад в эту статью. Эта работа была поддержана низ R01s MH096832 и MH084989 к.б. и низ лектор стипендий F31 MH111144 для D.L.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit Fisher Scientific NC9644388 To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1 Fisherbrand 12-542-B To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200 Thermolyne HPA2235M To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber N/A N/A Handmade
Borosilicate Glass Capillaries WPI 1B100F-4 To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller Sutter Instrument P-2000 To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing Component Supply Co. TET-031A For mouth and suction pipette
P2 pipette tip USA Scientific 1111-3700 For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap Fisher Scientific 05-408-120 Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M WPI vetbond Glue used for dissections
Potassium Chloride Fisher Scientific P-217 Forsaline
Sodium Chloride Millipore Sigma S5886 For saline
Magnesium Chloride Fisher Scientific M35-500 For saline
Calcium Chloride Dihydrate Millipore Sigma C7902 For saline
Sucrose Fisher Scientific S5-3 For saline
HEPES Millipore Sigma H3375 For saline
HRP:Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 123-605-021 To label neuronal membranes
Paintbrush Winsor & Newton 94376864793 To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5 WPI 500233 Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) WPI 14177 Used during dissection 
FM1-43 Fisher Scientific T35356 Fluorescent styryl dye
Digital Timer VWR 62344-641 For timing FM dye load/unload 
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope Zeiss For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0 Zeiss Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser Lasos To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser Lasos To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge WPI MF200 To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip BD 301625 To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base) Narishige MMN-9 To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator Grass S48 To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope Zeiss Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective Zeiss Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal Millipore Sigma R2500 Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port Zeiss 2000-C Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm ThorLabs M470L2 Used for ChR activation
T-Cube LED Driver ThorLabs LEDD1B To control the LED
LED Power Supply Cincon Electronics Co. TR15RA150 To power the LED
Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D To measure LED intensity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  2. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
  3. Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
  4. Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
  5. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  6. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
  7. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  8. Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
  9. Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  10. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
  11. Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
  12. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790 (2010).
  13. Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
  14. Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
  15. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  16. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  17. Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
  18. Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
  19. Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
  20. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
  21. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
  22. Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
  23. Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
  24. Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
  25. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
  26. Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133 (2009).
  27. Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 2, Unit 2.16 (2012).
  28. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  29. Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
  30. Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
  31. Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
  32. Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
  33. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  34. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  35. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  36. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  37. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  38. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
  39. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
  40. Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
  41. Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
  42. Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
  43. Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
  44. Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
  45. Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
  46. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
  47. Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135 (2010).
  48. Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
  49. Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).

Tags

Нейробиологии выпуск 135 дрозофилы нервно-Джанкшн FM1-43 электрофизиологии photoconversion просвечивающей электронной микроскопии
Краситель FM Велоспорт на синапсе: сравнение деполяризации высоким содержанием калия, электрических и Channelrhodopsin стимуляции
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye… More

Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation. J. Vis. Exp. (135), e57765, doi:10.3791/57765 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter