Summary
Protokoller er beskrevet for vurderingen af toksicitet af kemi til umodne og voksne myg for udvikling som nye klasser af larvicides, adulticides og endectocides. Protokollerne aktiverer høj overførselshastighed afprøvning af flere kemi på single-point dosis og efterfølgende evaluering via dosis svar analysen til bestemmelse af toksicitet på kontakt eller via indtagelse.
Abstract
Nye klasser af insekticider med nye former for handling er nødvendig for at styre insekticid resistente bestande af myg, som overfører sygdomme som Zika, denguefeber og malaria. Assays til hurtige, høj overførselshastighed analyser af uformulerede roman kemi mod myg larver og voksne er præsenteret. Vi beskriver protokoller for enkelt punkt-dosis og dosis svar assays til at evaluere toksicitet af lille molekyle kemi Aedes aegypti vektor Zika, denguefeber og gul feber, malaria vektor, Anopheles gambiae og den nordlige House myg, Culex quinquefasciatus, på kontakt og via indtagelse. Som et eksempel evalueret vi toksiciteten af amitriptylin, et lille molekyle antagonist i G protein koblede receptorer, via larve, voksen aktuel og voksne blod-fodring assay. Protokollerne giver et udgangspunkt for at undersøge insekticid potentielle. Resultaterne drøftes i forbindelse med yderligere eksperimenter for at udforske produkt programmer og mekanismer til levering.
Introduction
Myg overføre smitsomme sygdomme, der påvirker menneskers sundhed globalt agenser1. De tre vigtigste myg slægter der påvirker menneskers sundhed er Aedes, Anopheles, og Culex. Arter af Aedes myg vektor de arboviruses, der forårsager Zika, denguefeber, gul feber og chikungunya. Anopheles arter vektor malariaparasitter og Culex arter overfører West Nile virus og filarial nematoder2. Verdenssundhedsorganisationen (WHO) har opfordret til udryddelse af ti oversete tropiske sygdomme (NTD) af 20203 og identificeret myggekontrol som den mest bæredygtige strategi. Insekticider er kraftfulde værktøjer til at styre myg og reducere sygdom transmission4,5. Dog, fremkomsten af insekticid-resistente mosquito befolkninger truer fortsat bekæmpelse af mange sygdomme6,7,8. Innovative vektor kontrol Consortium (IVCC) har lanceret den første dedikerede indsats at udvikle udskiftning insekticider for myg kontrol9. Nye insekticider med nye former for action (MoA) er nødvendige for at opfylde der mål og opnå sygdomsbekæmpelse. Opdagelse og udvikling af nye insekticid klasser med romanen MoAs kræver hele organismen assays for hurtige, høj overførselshastighed analyse af kemi og i forhold til branchens standarder10.
Flere assays er tilgængelige til at evaluere frastødning og toksicitet af insekticider til larver og voksne myg, og nogle er velegnede til evaluering af roman formuleret eller uformulerede kemi. WHO protokol11 er en kontakt analysen bruges til at teste produkter mod fjerde instar larver. Offentliggjorte undersøgelser også beskrive en række larve assays bruges til at teste toksicitet af lille molekyle kemi til larver af Aedes aegypti, Anopheles gambiae og Culex quinquefasciatus10,12, 13,14,15,16. Centers for Disease Control og forebyggelse (CDC) flaske bioassay bruges til at vurdere insekticidresistens i feltet fanget populationer af voksne myg via evaluering af dødelig koncentration (LC) og letale tid (LT) i forhold til en standard diagnostiske dosis af en kommerciel insekticid17. WHO modtagelighed test tilbyder en anden tilgang til at vurdere insekticidresistens hos voksne myg hvorved myg er udsat for insekticid-imprægnerede papir inde i hætteglas til 1t og dødelighed er vurderet på 24 h18. Andre assays spray formuleringer inde i forseglet bure og optage myg knockdown og død på ønskede timepoints19. Lokal applikation til myg thorax er blevet brugt til at vurdere styrken af forskellige pesticider20. Liverpool insekt test etablering (LITE)21 beskæftiger standardforskriftertil at vurdere bioactivity af kemi til voksne myg. LITE voksen aktuel analysen gælder en lille mængde af prøveproduktet thorax af voksne myg med dødelighed scorede på 48 timer. Analysen giver mulighed for kvantificering af den dosis, der modtages pr. enkelte myg21. LITE tarsal analysen evaluerer toksiciteten af prøveproduktet til voksne myg hvilende på en kemisk behandlede overflade og bruges til at identificere kemi med udviklingspotentiale som indendørs resterende sprays (IRS) eller bruge i insekticid behandlet myggenet (ITNs) til at styre Anopheles myg.
WHO og CDC assays har begrænsninger for afprøvning roman, uformulerede kemi, og målet med CDC flaske bioassay er evaluering af modtagelighed over korte assay perioder (to timer) i stedet for toksicitet22,23. Derudover assays til evaluering af toksicitet af kemi leveret i blodmel og potentiale for udvikling af systemisk virkende produkter (dvs. endectocides) mangler. Her beskriver vi assays til test mosquitocidal aktivitet af roman kemi, der er opløseligt i vand eller en af flere organiske opløsningsmidler mod larver og voksne af Aedes, Anopheles og Culex. Først skal vi vise en larve assay tidligere beskrevet af vores gruppe10,12,13,16, og udført her som (1) en raster hastigt evaluere flere kemi på ét enkelt sted dosis, og (2) en dosis svar assay til at bestemme den dødelig koncentration (fx LC50, LC75 eller LC90,) af en enkelt kemi. Næste, vi beskriver to voksne assays til bestemmelse af dødelige dosis (LD). Først af disse er en tilpasning af den LITE protokol for afprøvning af topikalt, Roman kemi mod voksne myg i forhold til en positiv kontrol. Andet er en fodring assay for evaluering af kemi leveret systemisk via blod måltid.
Protocol
Bemærk: Alle stammer og reagenser kræves for arbejdet, der er beskrevet i de følgende protokoller og leverandører er angivet i Tabel af materialer.
1. kultur af myg larver og voksne
Bemærk: Insekticid modtagelige stammer af myg er tilgængelige fra Malaria forskning og reagens Reference Repository. Anbefalede stammer er som følger: Aedes aegypti Liverpool (Knud) stamme, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) stamme og Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) stamme.
- Kultur myg larver fra æg på en 12-timers dag/12 h nat cyklus på 28 ° C og 75-85% relativ luftfugtighed (RH) i 25 cm x 40 cm plastik skuffer (~ 400 larver pr. bakke) som beskrevet af Nuss29. Fodre larver jorden gerbil (A. aegypti og An. gambiae) eller flake fiskefoder (C. quinquefasciatus). Larve assays, indsamle larver på tredje larve (L3) instar fase.
- Bageste voksne myg fra pupper, der er overført til plast kopper og sted inde 20 L plastic bure i en insectary under ovennævnte betingelser. Vedligeholde myg på 20% sukkeropløsning som beskrevet andetsteds29. Indsamle voksne på 3-5 dage post fremkomsten.
2. larve kontakt Assay (punkt enkeltdosis eller dosis svar Assay)
Bemærk: Analysen kan udføres med kemi, der er opløseligt i vand eller dimethyl sulfoxid (DMSO), forudsat at den endelige koncentration af DMSO i test wells ikke overstiger 1%. Alternative opløsningsmidler kan være en mulighed, men det er æteriske først bekræfte, at den endelige koncentration ikke forårsager mere end 10% dødelighed ved 72 h post eksponering. Analysen kan være udført som en enkelt dosis eller dosis svar assay. Hvis udførelse af sidstnævnte, det anbefales at teste en række koncentrationer (minimum fem), der spænder over de forventede LC50.
- Label wells af en klar 24-godt væv plade, som vist i figur 1.
- Forberede en stamopløsning med test-kemi i en 1,5 mL tube.
- Vejer hver kemi ved hjælp af en Analysevægt, og afhængigt af opløselighed karakteristika, genopslæmmes i sterile ddH2O, DMSO eller andre passende organisk opløsningsmiddel (Se figur 2).
NOTE: Beregningerne bør tage hensyn renheden af kemien. For eksempel, for en kemi, som er 99% rent, 10,1 mg opløses i 1.000 µL af acetone at opnå en 1% opløsning. Forsegle med paraffin film og opbevares ved-20 ° C.
- Vejer hver kemi ved hjælp af en Analysevægt, og afhængigt af opløselighed karakteristika, genopslæmmes i sterile ddH2O, DMSO eller andre passende organisk opløsningsmiddel (Se figur 2).
- Bestemme den endelige koncentration af test-kemi, der vil blive evalueret og forberede serielle fortyndinger fra stamopløsningen i overensstemmelse hermed, ved hjælp af passende opløsningsmiddel.
Bemærk: Koncentration og volumen af kemi og solvens kan beregnes med formlen C1* V1= C2* V2 hvor C1= koncentration af prøve 1, C2= koncentration af prøve 2, V1= volumen af prøve 1 og V2= rumfang af prøve 2. Se eksempel beregninger vist i figur 2 og tabel 1.- Forberede en 10 mM stamopløsning og serielle fortyndinger, som kræves for at opnå ønskede test-koncentrationer (tabel 1B).
- Ved hjælp af wide-bore plast overførsel pipette, overføre fem L3 larver til godt af en vævskultur test plade; L3 larver kan genkendes af længde (~ 2,5-3,5 mm) og hoved kapsel bredde af ~ 0,025 mm24. Forsigtigt fjerne vand med 1 mL pipette og erstatte med den ønskede mængde af Hedeselskabet2O (se nedenfor). Gentag at opnå n = 4 tekniske replikater pr. behandling (dvs. 20 larver samlede pr. behandling).
- Tilføje den passende mængde af test-kemi til hver af de fire Repliker brønde i 24-godt test plade og forsigtigt swirl plade for at sikre ensartet blanding af kemi. Pladen anbringes i en test eller vækst kammer under konstant betingelser (fx 25 ° C og ~ 75-85% RH anbefales, og en 12-timers lys/12 h mørke cyklus hvis muligt).
Bemærk: Sørg For reproducerbarhed mellem eksperimenter, efterfølgende assays udføres under de samme miljøforhold. - Registrere antallet af døde/ikke-responderende larver i hver brønd på 30 min., 1, 1,5, 2, 3, 24, 48 og 72 timer efter eksponering (eller alternative tidspunkter) på score-arket (tabel 2). Tryk forsigtigt på siden af pladen. Hvis ingen bevægelse er observeret, blidt røre larve med en steril tandstikker. Score larver, der ikke reagerer for at trykke/touch som "dødt".
Bemærk: Andre morfologiske og adfærdsmæssige fænotyper kan overholdes og kan registreres. - Korrigere for mortaliteten ved hjælp af den modificerede Abbotts formel hvis det ønskes, som følger:
Dødelighed (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),
hvor X = procent dødelighed i de behandlede prøve, og Y = procent dødelighed i kontrolelementet. - Graf resultaterne som et histogram eller logaritmisk kurve ved hjælp af software valg som graf-pad prisme 6 eller lignende, og beregne dødelig koncentration (LC) værdier i forhold til kontrolelementet.
- Gentage assayet ved hjælp af et særskilt parti af myg for at opnå n = 3 eller flere biologiske replikater.
3. voksen aktuel Assay (punkt enkeltdosis eller dosis svar Assay)
Bemærk: Voksen aktuel analysen udføres ved hjælp af acetone som opløsningsmiddel. Alternative opløsningsmidler kan være en mulighed, men det er æteriske først bekræfte, at den endelige koncentration ikke forårsager mere end 10% dødelighed på 48 h post eksponering. Analysen kan være udført som en enkelt dosis eller dosis svar analysen og bruges til at bestemme dødelig dosis (LD). Hvis udførelse af sidstnævnte, det anbefales at teste en række koncentrationer (minimum fem), der spænder over de forventede LD-50.
- Bestem antallet af voksne kvindelige myg kræves for at fuldføre analysen.
Bemærk: Et punkt dosis assay med en enkelt kemi vil kræve et minimum af 90 myg (30 for den positive kontrol, 30 til acetone-kun negative kontrol og 30 for test-kemi). - Kultur 3 til 5 dage gamle voksne kvindelige myg og flytte til en særskilt 20 mL plastik spand ved hjælp af en betjent sug (figur 3).
- Label 9 oz papir kopper med navn og koncentrationen af test-kemi. Der er afsat 10 cm x 10 cm masker firkanter og elastikker til hver kop (Se figur 4).
- Vælg en eksisterende insekticid som positiv kontrol (f.eks., at syntetisk pyrethroid, bifenthrin) og forberede en 1% stamopløsning (10 µg/µL) i acetone.
NOTE: Beregningerne bør tage hensyn renheden af kemien. For eksempel, for en kemi, som er 99% rent, 10,1 mg opløses i 1.000 µL af acetone at opnå en 1% opløsning. Forsegle med paraffin film og opbevares ved-20 ° C. - Brug samme fremgangsmåde som ovenfor, forberede en stamopløsning med test-kemi.
Bemærk: Mange test-kemi er yderst labil og løsninger bør fortrinsvis træffes frisk hver gang bioassay udføres. - Forberede serielle fortyndinger af den positive kontrol og teste kemi fra stamopløsninger som vist i figur 5 ved hjælp af 20 mL hætteglas tidligere skylles med acetone.
- Rense en 1 mL glas sprøjte med acetone, fylde med acetone og sikre i mikro-applikator justeret for at levere en mængde af 0,25 µL.
- Arbejde i partier af ti, Fjern 3 - 5 - dages gamle voksne kvindelige myg fra bure ved hjælp af en betjent sug og bedøver for op til fem min. ved 4 ° C i et køleskab eller på is. Dernæst overføre myg til en petriskål og sted på is i op til 10 min.
- Arbejder hurtigt, fjerne en enkelt kvinde med fine pincet, og gælde den dorsale thorax ved hjælp af sprøjte mikro-applikator 0,25 µL af prøveopløsningen. Bekræfte levering af kemi ved observation ved hjælp af en dissekere mikroskop for at sikre hver myg modtager den passende mængde af test-kemi.
- Overføre myg til en mærket papir kop hvile på isen, og Gentag ni gange at få n = 10 behandlede myg. Forsegle myg i koppen med en firkantet maske sikret med en elastik, og overførsel til en plastik badekar eller vækst kammer under konstant betingelser af 28 ° C og 75-85% RH (på en 12 h dag/12 h nat cyklus er at foretrække).
- Gentag ovenstående eksperimentet to gange for at opnå n = 3 tekniske flergangsbestemmelser (dvs. 30 myg total) pr. behandling eller kontrol gruppe.
- Gentag trin 3.7-3.10 først med test-kemi og derefter den positive kontrol.
NOTE: En anden nyttig kontrol til at omfatte hvis tilstrækkelige myg er tilgængelige er en "blank" af 30 bedøvede myg, der ikke modtager enten test kemi eller opløsningsmiddel. - Registrere antallet af "døde/ikke-responderende" myg på 30 min, 60 min, 2, 24 og 48 timer efter eksponering (eller alternative tidspunkter) ved hjælp af score-arket (tabel 3). Score myg, som "døde/ikke-responderende" hvis de viser mangel på bevægelse, defineret som på den ene side eller på ryggen og med manglende evne til at flyve.
- Hvis det ønskes, rettes til mortaliteten ved hjælp af den modificerede Abbotts formel som følger:
Dødelighed (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),
hvor X = procent dødelighed i de behandlede prøve, og Y = procent dødelighed i kontrolelementet. - Få vist resultaterne som et histogram eller en eksponentialkurve. For en dosis svar assay, beregne LD50, LD75 eller LD90 værdi for test-kemi i forhold til kontrolelementet.
- Gentage assayet mindst to gange ved hjælp af særskilte partier af myg for at opnå n = 3 eller flere biologiske replikater.
4. voksen blod-fodring Assay (punkt enkeltdosis eller dosis svar Assay)
- Indsamle ca. 150 4-5-dages gamle voksne kvindelige myg og overførsel til en separat bur. Gentag for at få 6 bure, hvis udfører en dosis svar assay. Fjerne kilden til sukker 1-24 timer forud for fodring analysen.
- Forberede en stamopløsning af kemi som beskrevet ovenfor, tegner sig for renheden af kemi (en typisk stamopløsning er 80 mM i vand eller salt buffer), og derefter forberede serielle fortyndinger i vand/buffer som krævet.
- Tilføje 40 µL af hver af Fortyndingerne til 960 µL af defibrinated kanin blod til at opnå den ønskede test-koncentration. Anvende membran film til en fodring enhed og forsegle med en gummiring. Der overføres 1 mL af blodet via pipette og tillægger en varmeenhed fodring enheden.
- Forsigtigt vatpind membranen overflade med frisk lavet 10% mælkesyre løsning og sted fodring enheden ind i buret af voksne myg. Dække buret med en mørk klud eller sort Papirkurv taske og tillade myg til foder til en time.
- Gentag trin 4.2-4.4 for den resterende del af test-opløsninger og den negative (kun blod) kontrol.
- Ved afslutningen af fodring, skal du placere spande ved 4 ° C i et køleskabet i 5 min. til bedøver myg. Fjern mandlige myg og ikke-fed kvindelige myg, og tælle og registrere det samlede antal fodret og delvist fodret myg ved undersøgelse af maven.
- Bevare delvist og fuldt fodret kvindelige myg, satsning nemlig et minimum af 50 blod-fed myg pr. dosis.
- Overføre spande til en plastik badekar eller vækst kammer under konstant betingelser af 28 ° C og 75-85% RH (på en 12 h dag/12 h nat cyklus er at foretrække).
- Optage det samlede antal døde/ikke-responderende myg på 0,5, 1, 1,5, 2, 24, 48 og 72 h (eller alternative tidspunkter som ønsket) ved hjælp af en score ark (tabel 4).
- På den tredje dag post blod fodring, indføre en Æggebæger i buret og indsamle æg over en periode på 72 h. Tælle det samlede antal æg, der produceres pr. behandling under en dissekere mikroskop.
- Beregn procent dødelighed og frugtbarhed som en funktion af det samlede antal fodret myg for hver behandling gruppe og kontrol. Korrigere for mortaliteten ved hjælp af den modificerede Abbotts formel, hvis det ønskes.
- Vis toksicitet og frugtbarhed data som et histogram plot eller eksponentiel kurve (hvis udfører en dosis svar assay) ved hjælp af software valg. Hvis udførelsen af en dosis svar assay, beregne LD50, LD75 eller LD90 værdi for test-kemi i forhold til kontrolelementet.
- Gentage assayet mindst to gange ved hjælp af særskilte partier af myg for at opnå n = 3 eller flere biologiske replikater.
Representative Results
Figur 6 viser den procent dødelighed af L3 Ae. aegypti efter udsættelse for fem doser af dopamin receptor antagonist, amitriptylin i forhold til vandet kun (negativ) kontrol på 24, 48 og 72 timer. I dette eksempel data indsamlet på hvert af tidspunkter vises en typisk logaritmisk kurve og afsløre en dosisafhængig effekt af amitriptylin på larve dødelighed. LC50 værdi falder over tid løbet af eksperimentet og kan beregnes ved hjælp af 72 h data (dvs. midtpunktet af den logaritmiske kurve).
Figur 7 viser den procent dødelighed af 3 - 5 dage gamle voksne hunner Ae. aegypti efter udsættelse for en 400 µM dosis (10 µg/µL) af dopamin receptor antagonist, amitriptylin og i forhold til den syntetisk pyrethroid, bifenthrin-positive kontrol (tekniske kvalitet, 500 pg/µL), acetone-kun negativ kontrol og ubehandlet myg (tom). I dette eksempel er forårsage både amitriptylin og bifenthrin betydelige voksen dødelighed i forhold til den negative kontrol. Bemærk, at voksne dødelighed falder over tid, formentlig på grund af metaboliske afgiftning af test-kemi.
Figur 8 viser den procent dødelighed (venstre y-akse) 3-5 dages gamle voksne kvindelige Ae. aegypti fodret en blodmel, behandles med en af fire doser af dopamin receptor antagonist, amitriptylin og frugtbarheden (højre y-akse; gennemsnitlige æg tæller / kvindelige) for den første gonotrophic cyklus post eksponering i forhold til kontrol myg (blod-fed kun; negativ kontrol). Dataene, der afslører, at der er nogen væsentlig virkning af amitriptylin på voksen dødelighed i forhold til kontrol men demonstrere at amitriptylin øger frugtbarheden ved den højeste dosis (400 µM).
Figur 1 . Opsætning af larve dosis svar assay. Billedet viser set-up af larve dosis svar analysen udføres ved hjælp af Aedes aegypti L3 larver i 24-godt plade.
Figur 2 . Skematisk viser proceduren for sæt af (A) enkelt dosis eller (B) dosis svar larve assay i 24-godt plade. Efter overførsel af fem L3 larver til brønde, overskydende vand forsigtigt fjernes via pipette og erstattet med frisk, sterile ddH2O. Næste, lager og serielle fortyndinger af test-kemi er forberedt og føjes til en endelige mængden af 1 mL/godt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Kultur af voksne myg. Billedet viser 20 L plastik spand bruges til kultur af voksne myg og brug af en betjent sug til at fjerne myg.
Figur 4 . Voksen aktuel analyse udføres ved hjælp af 4-5 dage gammel kvinde Aedes aegypti. Følgende behandling med kemi eller opløsningsmidler, voksne myg er placeret i papir kopper og overført til et prøvekammer for varigheden af analysen.
Figur 5 . Materiel og serielle fortyndinger. Skematisk diagram viser proceduren for udarbejdelse af (A) bestand og (B) serial test solutions for den voksne aktuel assay. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Repræsentative data fra en larve kontakt dosis svar assay. Repræsentative data fra en larve kontakt dosis-respons-analysen viser procent dødelighed af Aedes aegypti L3 larverne efter udsættelse for dopamin receptor antagonist, amitriptylin på 24, 48 og 72 h. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdien i µM ± SEM. Data repræsenterer n = 3 biologiske replikater.
Figur 7 . Repræsentative data fra en aktuel voksendosis svar assay. Repræsentative data fra en aktuel voksendosis svar analyse viser giftigheden af dopamin receptor antagonist, amitriptylin (10 µg/µL) til 3-5 dages gamle kvindelige Aedes aegypti i forhold til den syntetisk pyrethroid, bifenthrin (500 pg/µL) positiv kontrol) og negativ kontrol (acetone køretøjet kun) på 2, 24 og 48 h. Data repræsenterer n = 3 biologiske replikater. Fejllinjer angive SEM.
Figur 8 . Repræsentative data fra en voksen indtagelse assay. Repræsentative data fra en voksen indtagelse analyse viser giftigheden af dopamin receptor antagonist, amitriptylin på 100 µM, 200 µM og 400 µM dosis til 3-5 dages gamle voksne kvindelige Aedes aegypti og indvirkning på frugtbarhed (udtrykt som den gennemsnitlige samlede æg tæller per kvinde over den første gonotrophic cyklus). Data repræsenterer n = 3 biologiske replikater ± SEM.
| A. enkelt dosis assays med tre kemi | |||||
| Kemi | Koncentration (400 uM) | ||||
| Amitriptylin | 80 mM lager: 2 mg amitriptylin X 98% (renhed af pulver) X 0,001 g / 1 mg X 1 mol /313.86 g X 1 L/0,08 mol X 106 µL/L = 78.06 µL vand. | ||||
| Serielle fortyndinger: Fortyndes stock 1:2 med ddH2O og derefter 1:4 at opnå 10 mM. Tilføje 40 µL af 10 mM materiel til godt indeholdende 960 µL af Hedeselskabet20 for at opnå en endelig koncentration på 400 µM/godt. Forberede serielle fortyndinger af 10 mM stock 1:2 at opnå 5 mM, 2,5 mM, 1,25 mM og 0,625 mM bestande. | |||||
| CIS-(z)-flupenthixol | 80 mM lager: 2 mg af cis (z) flupenthixol X 98% (renhed af pulver) X 0,001 g / 1 mg X 1 mol/507.44 g cis (z) flupenthixol X 1 L/0.08 mol X 106 µL/L = 48.28 µL vand. | ||||
| Serielle fortyndinger: Som ovenfor. | |||||
| Amitraz | 80 mM lager: 2 mg Amitraz X 0,001 g / 1 mg X 1 mol/293.4 g af amitraz X 1 L/0.08 mol X 106 µL/1 L = 85.21 µL af DMSO (Bemærk: Amitraz er kun opløseligt i DMSO). | ||||
| Serielle fortyndinger: Som ovenfor. | |||||
| B. dosis svar assay | |||||
| Kemi | Dosis 1 | Dosis 2 | Dosis 3 | Dosis 4 | Dosis 5 |
| 400 ΜM | 200 ΜM | 100 ΜM | 50 ΜM | 25 ΜM | |
| fx amitriptylin, cis-(Z)-flupenthixol eller amitraz | 40 ΜL | 40 ΜL | 40 ΜL | 40 ΜL | 40 ΜL |
| 10 mM lager | 5 mM lager | 2,5 mM lager | 1,25 mM lager | 0,625 mM lager | |
Tabel 1. Eksempel beregninger for Aedes aegypti L3 larve (A) enkelt punkt dosis assay og (B) dosis svar assay.
Tabel 2. Eksempel score ark bruges til at registrere data fra myg larve dosis svar assay. Kontrol, kun for vand eller vand med 1% DMSO eller andre opløsningsmidler kun. Typiske doser bruges til at teste lille molekyle antagonist kemi såsom amitriptylin er 25 µM, 50 µM, 100 µM, 200 µM og 400 µM.
| Myg voksen (3-5 dage gammel) aktuel analyse | ||||||
| Datoen: | ||||||
| Investigator: | ||||||
| Arter/stamme: | ||||||
| Assay Type: Enkelt dosis/dose respons | ||||||
| A. dødelighed (nr. døde myg) | ||||||
| (Time) | Dosis 1 | Dosis 2 | Dosis 3 | Dosis 4 | Dosis 5 | Kontrol |
| 0,5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
| B. procent dødelighed | ||||||
| (Time) | Dosis 1 | Dosis 2 | Dosis 3 | Dosis 4 | Dosis 5 | Kontrol |
| 0,5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
Tabel 3. Eksempel score ark bruges til at registrere data fra aktuel voksendosis svar assay.
| Myg voksen (3-5 dage gammel) indtagelse Assay | ||||||
| Datoen: | ||||||
| Investigator: | ||||||
| Arter/stamme: | ||||||
| Assay Type: Enkelt dosis/dose respons | ||||||
| A. antallet fodret myg | ||||||
| Dosis 1 | Dosis 2 | Dosis 3 | Dosis 4 | Dosis 5 | Kontrol | |
| Fodret | ||||||
| Ikke Fed | ||||||
| I alt | ||||||
| % Fed | ||||||
| % Ikke Fed | ||||||
| B. dødelighed (nr. døde myg) | ||||||
| (Time) | Dosis 1 | Dosis 2 | Dosis 3 | Dosis 4 | Dosis 5 | Kontrol |
| 2 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
| C. procent dødelighed | ||||||
| (Time) | Dosis 1 | Dosis 2 | Dosis 3 | Dosis 4 | Dosis 5 | Kontrol |
| 2 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
Tabel 4. Eksempel score ark bruges til at registrere data fra den voksne blod-fodring assay. Typiske doser bruges til at teste lille molekyle antagonist kemi såsom amitriptylin er 50 µM, 100 µM, 200 µM og 400 µM.
Discussion
Insekticider er kraftfulde værktøjer til bekæmpelse af myg-bårne sygdomme som malaria25, denguefeber og Zika26. Omfattende insekticid brug har produceret mosquito befolkninger, er modstandsdygtige over for kemisk bekæmpelse, fører til udviklingen af insekticidresistens, som anses for den enkelte største trussel mod fortsatte sygdomsbekæmpelse. Det sidste tiår er sket en dramatisk stigning i populationer af Anopheles spp. resistente over for syntetiske pyrethroider (SPs) anvendes i myggenet i Afrika7. Populationer af Aedes albopictus, en vektor af dengue og Zika, er blevet rapporteret i Florida og New Jersey der er resistente over for organofosfater6. På samme måde, modstand mod DDT og pyrethroider er blevet dokumenteret i populationer af Anopheles og Aedes spp. i Colombia27,28. Der er presserende behov for at udvikle nye larvicides og adulticides, der binder til forskellige orthosteric eller allosteriske websteder på kendte molekylære mål eller at forstyrre nye mål (dvs. roman MoA kemi)29,30 og har minimal miljøpåvirkning. Der også stigende anerkendelse af potentiale omkring endectocides for myg kontrol31,32,33.
For at lette den hurtige udvikling af sådanne produkter, beskriver vi en række protokoller, designet til at evaluere toksicitet af lille molekyle kemi til myg larver og voksne via to levering ruter - kontakt og indtagelse. Protokoller såsom WHO modtagelighed test og CDC flaske assay er til fælles brug for evaluering af toksicitet og frastødning af eksisterende insektbekæmpelsesmidler formuleringer1,2. Men disse assays har begrænsninger for analyser af uformulerede roman kemiske enheder (NCEs) og er ikke indstillet til test af stort antal kemi i moderat eller høj overførselshastighed.
Her beskriver vi en standard larve assay du kan hurtigt vurdere NCEs i enkelt dosis, der kan skaleres til høj overførselshastighed analyser. Vi beskriver også en tilpasning af en analyse, der er udviklet af den LITE21 at vurdere kontakt toksicitet af lille molekyle kemi til voksne myg. Endelig vil vi beskrive en indtagelse assay for at evaluere toksicitet af NCEs leveret via blod måltid til voksne kvindelige myg og udforske endectocide potentiale. Disse larve og voksen assays kan udføres på en række doser for at bestemme LC og LD værdier, henholdsvis, og både larve og voksen kontakt assays kan udføres i forhold til en eller flere eksisterende kemiske formuleringer. Den voksne aktuel analyse giver også mulighed for beregning af LD værdier pr. enkelte myg. Protokollerne kan udføres ved hjælp af arter af Aedes, Anopheles og Culex16,29 og kan blive ændret for at imødekomme de specifikke biologiske egenskaber af en art, hvis det ønskes. Vores erfaring, mosquitocidal kemi typisk udviser bred aktivitet på tværs af disse tre slægter16,29, men der er værdi til vurdering af arter selektivitet.
Assays er udgangspunktet for hurtigt skærmen flere kemi for insekticide aktivitet. Disse kemi, der udviser toksicitet i en eller flere assays kunne vælges for yderligere analyser via sekundær og tertiær assays. Eksempler omfatter LITE tarsal assay og sukker fodring assays34,35. Udvælgelse af yderligere assays bestemmes typisk ved overvejelser omkring forventede markedet og anvendelse, med resultater giver indsigt til mulige produkt levering tilstande. I de repræsentative resultater vist her, undersøge vi toksiciteten af amitriptylin, en antagonist af pattedyr og hvirvelløse dopamin receptorer, der er blevet evalueret for potentiale som en roman MoA insekticid10,12, 13 , 16. amitriptylin udstillet toksicitet for larver og voksne af Ae. aegytpi i μg udvalg foreslår larver og adulticidal aktivitet og giver begrundelsen for en udforskning af en amitriptylin-baserede kemiske serien til at identificere analoger med høj potens. Ingen signifikant effekt på dødelighed eller frugtbarhed blev observeret i Ae. aegypti udsat for amitriptylin i blod måltid. Mens stabilitet af kemi i defibrinated blod og effektiv dosis modtaget pr. myg ikke er kendt, bemærkelsesværdige begrænsninger af analysen, data tyder på at amitriptylin og andre GPCR-aktive forbindelser kan have lidt potentiale som endectocides, på mindst i uformulerede tilstand.
Forholdsregler for at begrænse biologiske variation mellem assays er afgørende. Alle assays skal udføres under standardbetingelser for temperatur og fugtighed, helst i en insekt vækst, for at sikre reproducerbarhed. Det er bydende nødvendigt at standardisere procedurer for scoring fænotypiske punkter, da disse kan være meget subjektiv, fører til betydelig variation i data registreret ved forskellige laboratoriepersonalet. Larve analysen er bedst egnet til evaluering af kemi, der er opløseligt i vand, selv om analysen kan udføres ved hjælp af organiske opløsningsmidler som DMSO, forudsat at det endelige koncentration er mindre end 1% pr. brønd. Vi genkender flere begrænsninger til den voksne aktuel assay. Først, det er nødvendigt at arbejde hurtigt, når du forbereder serielle fortyndinger og levere doser som carrier (acetone) er yderst flygtig og fordampning kan producere variation i mængden af kemi leveret. For det andet bør pleje tages til at sætte en frist for anæstesi, da dette kan bidrage til dødelighed. Det skal også bemærkes, at opløsningsmidler som acetone kan producere en hurtig "knock-down"-effekt i de første mange timer af den aktuelle analyse, som ikke bør forveksles med virkninger som følge af test-kemi. Vi bemærker, at omfanget af blodmel myg varierer mellem individer, kompliceret en vurdering af den dosis, der modtages pr. voksen i voksen indtagelse assay. Endelig bør assay data ikke betragtes i tilfælde hvor dødelighed i den negative kontrol overstiger 10%.
Produkter, der handle synergistisk er i stigende grad anerkendt for deres potentiale til at udvide nytten af eksisterende produkter og give kontrol af insekticid resistente skadedyr populationer15,16,36. Larve assays har været brugt til at undersøge synergi mellem formamidine pesticid, amitraz og en bred vifte af kemi, der forstyrrer hvirvelløse octopamine receptorer14,15. Larve assay og voksen aktuel assay beskrevet er velegnede til evaluering synergistisk eller tilsætningsstof virkninger mellem kombinationer af test-kemi. Vi noterer os, synergister som piperonyl butoxid (PBO) kan integreres i hver af de tre undersøgelser, som beskrevet her.
De ovenfor beskrevne assays give en standardiseret eksperimentelle serie for evaluering af uformulerede, lille molekyle lægemidler mod vandlevende og jordbaserede myg livsstadier. Disse assays er specielt designet til at evaluere toksicitet og tilbyder flere fordele i forhold til eksisterende undersøgelser til fælles brug. Vigtigere er, assays er indstillet til automatisering og kan udføres i industriel skala hen til muliggøre evaluering af tusindvis af test forbindelser. Endelig, som feltet anser udviklingen af produkter, der fungerer via nye MoAs, herunder via afbrydelse af roman molekylære mål og biokemiske veje, vil det være afgørende at score flere fænotypiske slutpunkter ud over dem som dødelighed og lammelse. De ovenstående assays tillade sådanne undersøgelser, hvilket giver et skridt på vejen mod morgendagens højinnovative insektbekæmpelsesmidler teknologier.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne takke H. Ranson, Liverpool School of Tropical Medicine for støtte med assay udvikling og levering af LITE-protokollen, og M. Scharf, Purdue University for rådgivning vedrørende analyse design.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insecticide susceptible mosquito strains | Malaria Research and Reagent Reference Repository | https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Recommended strains: Aedes aegypti Liverpool (LVP) strain, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) strain and Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) strain | |
| Acetone | Mallinckrodt Chemical | CAS 67-64-1 | Use for dilutions and control |
| Amitraz | Sigma-Aldrich | CAS 33089-61-1 | Requires dilution in DMSO |
| Amitriptyline | Sigma-Aldrich | CAS: 549-18-8 | Can be diluted in acetone |
| Bifenthrin | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Synthetic pyrethorid used as positive control |
| Cis-(Z)-flupenthixol | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Pharmacologically tested as disruptor of dop-like receptors |
| Defibrinated rabbit blood | Hemostat | DRB0100 | Blood source for adapted mosquitoes to artificial feeding |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | MKBF2985 | Organic solvent used to disolve amitraz |
| Hemotek membrane feeding system | Hemotek Ltd | Serial no. 1303 | Used for feeding mosquitoes |
| Micro-applicator | Burkard Manufacturing Co. | - | Tool needed for topical application experiments |
| 24-well cell culture plate with lid | Corning Incorporated | 3526 | - |
| Advantage rubber bands | Alliance Rubber Co. | - | Used to seal the paper cups |
| Glass syringe (1 ml) | Becton Dickinson and Co. | 512004 | Needed for the micro-applications. Glass is better than plastic |
| Disposable scintillation vials (20 ml) | Fisher Scientific | 74505-20 | Glass vials prevent evaporation |
| Tulle fabric, white | Walmart | - | - |
| Paper cups | Dixie Consumer Products LLC. | PF15675/13D | Used to keep adult mosquitoes in adult topical assays |
| Petri dishes (150 mm) | Corning Life Sciences | - | Used to maintain the mosquitoes "slept" on cold without direct contact with ice |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | Used to sort larvae |
| Stereo microscope | Olympus | SZ6045 | Used to score larval assays and perform micro-applications |
| Tweezers (fine) | Fontax | - | Used to handle adult mosquitoes |
References
- World Health Organization. A global brief on vector-borne diseases. , Available from: www.who.int/about/Licensing/copyright_form/en (2014).
- World Health Organization. Vector-borne diseases. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs387/en (2016).
- World Health Organization. Report by the Secretariat. Neglected tropical diseases; Prevention, control, elimination and eradication. , Available from: http://www.who.int/neglected_diseases/A66_20_Eng.pdf (2013).
- Tolle, M. A., et al.
- Chen, C. D., et al. Dengue vectors surveillance in endemic areas in kuala lumpur city centre and selangor state, malaysia. Dengue Bulletin. 30, (2006).
- Marcombe, S., et al. Insecticide resistance status of united states populations of Aedes albopictus and mechanisms involved. PLoS ONE. 9 (7), e101992 (2014).
- Ranson, H., et al. Pyrethroid resistance in African anopheline mosquitoes: what are the implications for malaria control? Trends in Parasitology. , 1-8 (2010).
- Hemingway, J., Ranson, H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease. Annual Review of Entomology. 45, 371-391 (2000).
- Hemingway, J., Beaty, B. J., Rowland, M., Scott, T. W., Sharp, B. L. The Innovative Vector Control Consortium: improved control of mosquito-borne diseases. Trends in Parasitology. 22 (7), 308-312 (2006).
- Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: Pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D 1-like dopamine receptors. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6 (1), e1478 (2012).
- World Health Organization. Instructions for determining the susceptibility or resistance of mosquito larvae to insecticides. , Available from: http://apps.who.int/iris/handle/10665/69615 (1981).
- Hill, C. A., et al. Re-invigorating the insecticide discovery pipeline for vector control: GPCRs as targets for the identification of next gen insecticides. Pestide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 141-148 (2013).
- Conley, J. M., et al. Evaluation of AaDOP2 Receptor antagonists reveals antidepressants and antipsychotics as novel lead molecules for control of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeautics. 352 (1), 53-60 (2015).
- Ahmed, M. A. I., Matsumura, F. Synergistic actions of formamidine insecticides on the activity of pyrethroids and neonicotinoids against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 49 (6), 1405-1410 (2012).
- Ahmed, M. A. I., Vogel, C. F. A. Synergistic action of octopamine receptor agonists on the activity of selected novel insecticides for control of dengue vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) mosquito. Pesticide Biochemistry and Physiology. 120, 51-56 (2015).
- Hill, C. A., et al. Comparative pharmacological characterization of D1-like dopamine receptors from Anopheles gambiae, Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus suggests pleiotropic signaling in mosquito vector lineages. Parasites Vectors. 9 (1), 192 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for evaluating insecticide resistance in vectors using the CDC bottle bioassay. , Available from: https://www.cdc.gov/malaria/resources/pdf/fsp/ir_manual/ir_cdc_bioassay_en.pdf (2011).
- World Health Organization. Test procedures for insecticide resistance monitoring in malaria vector mosquitoes. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/250677/1/9789241511575-eng.pdf (2013).
- Geneva: World Health Organization. Guidelines for efficacy testing of insecticides for indoor and outdoor ground-applied space spray applications control of neglected tropical diseases who pesticide evaluation scheme. , Available from: http://www.who.int/iris/handle/10665/70070 2-53 (2009).
- Pridgeon, J. W., et al. Susceptibility of Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus Say, and Anopheles quadrimaculatus Say to 19 pesticides with different modes of action. Journal of Medical Entomolog. 45 (1), 82-87 (2008).
- Liverpool Insect Testing Establishment. , Available from: http://www.lite-testing-facility.com (2018).
- Aïzoun, N., et al. Comparison of the standard WHO susceptibility tests and the CDC bottle bioassay for the determination of insecticide susceptibility in malaria vectors and their correlation with biochemical and molecular biology assays in Benin, West Africa. Parasites Vectors. 6, 147 (2013).
- Owusu, H. F., Jančáryová, D., Malone, D., Müller, P. Comparability between insecticide resistance bioassays for mosquito vectors: time to review current methodology? Parasites Vectors. 8, 357 (2015).
- Savignac, R., Maire, A. A simple character for recognizing second and third instar larvae of five Canadian mosquito genera (Diptera: Culicidae). , (1981).
- Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. eLife. 4, 174 (2015).
- Zaim, M., et al. Alternative insecticides: an urgent need. Trends in Parasitology. 18 (4), 161-163 (2002).
- Fonseca, I., Quinoñes, M. L. Resistencia a insecticidas en mosquitos (Diptera: Culicidae): mecanismos, deteccion y vigilancia en salud publica. Revista Colombiana de Entomologia. 31 (2), 107-115 (2005).
- Fonseca-Gon Alez, I., Qu, M. L., Lenhart, A., Brogdon, W. G. Insecticide resistance status of Aedes aegypti (L.) from Colombia. Pest Management Science. 67, 430-437 (2011).
- Nuss, A. B., et al. Dopamine receptor antagonists as new mode-of-action insecticide leads for control of Aedes and Culex mosquito vectors. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 1-19 (2015).
- Shidrawi, G. R. A WHO Global Programme for monitoring vector resistance to pesticides. Bulletin of the World Health Organization. 68 (4), 403 (1990).
- Sylla, M., Kobylinski, K. C., Foy, B. D. Gates grand challenges explorations award: endectocides for controlling transmission of mosquito-borne diseases. Malariaworld Journal. 4 (5), (2013).
- Foy, B. D., Kobylinski, K. C., da Silva, I. M., Rasgon, J. L., Sylla, M.
- Chaccour, C. J., et al. Ivermectin to reduce malaria transmission: a research agenda for a promising new tool for elimination. Malaria Journal. 12 (1), 153 (2013).
- Olson, D. M., Fadamiro, H., Lundgren, J. G., Heimpel, E. Effects of sugar feeding on carbohydrate and lipid metabolism in a parasitoid wasp. Physiol Entomol. 25, 17-26 (2000).
- World Health Organization. Report of the WHO Informal Consultation. Evaluation and testing of insecticides. , Available from: http://www.who.int/whopes/resources/ctd_whopes_ic_96.1/en/ (1996).
- Huang, Q., Deng, Y., Zhan, T., He, Y. Synergistic and antagonistic effects of piperonyl butoxide in fipronil-susceptible and resistant rice stem borrers, Chilo suppressalis. Journal of Insect Science. 10, 182 (2010).
