Summary
未熟と大人の蚊殺虫剤、adulticides と endectocides の新しいクラスとして開発のために化学物質の毒性を評価するためのプロトコルを説明します。プロトコルは、高スループットのシングル ポイント線量と線量応答測定接触毒性法や摂取を介して後続の評価で複数の化学のテストを有効にします。
Abstract
アクションの新規モードで殺虫剤の新しいクラスは、ジカ、デング熱やマラリアなどの病気を送信蚊の殺虫剤抵抗性個体群を制御する必要が。迅速アッセイ、蚊の幼虫と大人に対する新規化合物 unformulated の高スループット分析が掲載されています。単一のポイント線量とジカ、デング熱、黄熱病、マラリア ベクトル、好むと北部のネッタイシマカベクトルに低分子化学物質の毒性を評価するための線量応答の試金のためのプロトコルについて述べる家の蚊、ネッタイイエカ、接触、経口摂取による。例としては、アミトリプチリン、G タンパク質共役受容体の幼虫、大人局所および大人吸血アッセイによる小分子の拮抗薬の毒性を評価します。プロトコルが殺虫剤の可能性を調査するための出発点を提供します。結果は、製品のアプリケーションと配信メカニズムを探索する追加実験のコンテキストで説明します。
Introduction
蚊の媒介によって世界的に人間の健康に影響を与える伝染病の病原体1。ヒトスジシマカ、ハマダラカ、 アカイエカ人間の健康に影響を与える 3 つの最も重要な蚊属。ヤブカ属のベクトル、ジカ、デング熱、黄熱、チクングニアを引き起こすアルボ ウイルスです。ハマダラカ種ベクトル マラリア原虫とアカイエカ種は西ナイル ウイルスとフィラリア線虫2を送信します。世界保健機関 (WHO) は 2020年3撲滅の 10 無視熱帯病気 (NTD) と呼ばれる、最も実行可能な戦略として蚊コントロールを識別しました。殺虫剤は、蚊を制御し、病気伝達4,5を削減する強力なツールです。ただし、蚊の殺虫剤抵抗性個体群の出現は多く疾患6,7,8の継続的なコントロールを脅かしています。革新的なベクトル制御コンソーシアム (IVCC) は、蚊コントロール9交換用殺虫剤を開発する最初の専用努力を開始しました。アクション (MoA) の新規モードと新しい殺虫剤は、人の目標を達成し、疾病管理を達成するために必要です。発見と小説 2442億と新しい殺虫剤のクラスの開発急速に、高スループットの分析化学と工業規格10と比較して全体の生物の試金が必要です。
新規策定または unformulated の化学的性質の評価が適しているし、複数のアッセイ撥と幼虫、蚊成虫を殺虫剤の毒性を評価することがあります。WHO プロトコル11は 4 齢幼虫に対して製品をテストするために使用接触分析です。発表された研究について述べる様々 な幼虫アッセイネッタイシマカ、に対する、地域のネッタイイエカの10、12,の幼虫に小分子化合物の毒性をテストするために使用13,14,,1516。疾病と予防 (CDC) ボトル バイオアッセイのためセンターを使用して、フィールド キャッチ致死濃度 (LC) と致死時間 (LT の) 診断基準と比較しての評価を介して蚊個体群における殺虫剤抵抗性を評価するには17商業殺虫剤の投与量。WHO の感受性テストという蚊の防虫紙 1 h のガラス瓶の中にさらされているし、死亡率が 24 h18評価蚊の殺虫剤抵抗性を評価する別のアプローチを提供しています。他のアッセイは、必要な縦長19製剤シール ケージとレコード蚊ノックダウンと死の中をスプレーします。蚊胸部へ塗布は20異なる殺虫剤の効力を評価するために使用されています。リバプール昆虫テスト確立 (LITE)21標準の運用手順を採用しています大人の蚊に化学の生物活性を評価します。LITE の大人の局所アッセイは、48 h で獲得した死亡率と蚊成虫の胸部にテスト製品の少量を適用します。アッセイは、個々 の蚊21あたりの受信量の数量化できます。LITE 瞼試金テスト製品を化学的に扱われた表面で休む大人の蚊の毒性を評価し、屋内残留噴霧 (IRS) として開発のための潜在性の化学物質を特定したり、殺虫剤処理蚊帳 (ITNs) で使用するために使用ハマダラカ蚊を制御します。
WHO、CDC の試金は小説、unformulated の化学のテストに限界があるし、CDC ボトル バイオアッセイの目標は毒性22,23ではなく、短い測定期間 (2 時間) にわたって感受性の評価。さらに、化学物質の毒性を評価するための試金は血食事で配信し、全身機能製品の開発の潜在的な (すなわちendectocides) が不足しています。ここでは、水や幼虫に対するいくつかの有機溶剤の一つとしアカイエカヒトスジシマカ、ハマダラカの大人で溶ける新規化学の mosquitocidal 活動をテストするための試金をについて説明します。以前当社グループ10,12,13,16、によって記述され、ここで実行される幼虫アッセイを示す (1) として単一の時点で複数の化学反応を高速に評価する画面の線量、そして (2) 単一化学の致死濃度 (例えば、 LC50、 LC75または LC90、) 線量応答アッセイ。次に、我々 は致命的な線量 (LD) の定量のための 2 つのアダルト アッセイをについて説明します。これらの最初の肯定的な制御と比較して大人の蚊に対する局所的に適用される、新規の化学のテストのライトのプロトコルの適応です。2 番目の餌全身血液の食事を介して配信の化学的性質の評価用です。
Protocol
注: 次のプロトコルで説明されているすべての緊張および仕事のために必要な試薬とサプライヤーは、材料表に一覧表示されます。
1. 文化蚊の幼虫と大人
注: 蚊の殺虫剤感受性系統、マラリア研究試薬参照リポジトリから入手できます。株は、次のとおりお勧めします:ネッタイシマカリバプール (LVP) ひずみ、ハマダラカ gambiaeキスム (KISUMU1) 系統および地域のネッタイイエカヨハネスブルグ (JHB) 系統。
- 文化 12 h/日 12 h 夜に卵から幼虫が 28 ° C と 75-85% 相対湿度 (RH) 25 cm × 40 cm プラスチック トレーでサイクル (~ トレイごと 400 幼虫) ナス29のとおり。幼虫地面スナネズミ (ネッタイシマカとgambiae) またはフレーク魚料理 (C. ネッタイイエカ) をフィードします。幼虫の試金のためには、3 番目の幼虫 (L3) 齢段階で幼虫を収集します。
- プラスチックのコップと上記で説明した条件の下で横に 20 L プラスチック製ケージの中の場所に転送されている蛹から成虫蚊をリア.20% 糖液も29に蚊を維持します。3-5 日ポスト出現で大人を収集します。
2. 幼虫の連絡先アッセイ (単一ポイントの線量や線量応答アッセイ)
注: テスト井戸における DMSO の最終濃度が 1% を超えないこと、アッセイは水やジメチル ジメチルスルホキシド (DMSO) で溶ける化学と実施できます。代替溶剤、オプションがありますが、それは 72 h の投稿露出で 10% の死亡率よりも最初に最終濃度が発生しないことを確認することが不可欠です。アッセイは、一点線量や線量応答分析行われるかもしれない。濃度 (最低 5) の範囲をテストする場合は後者を実行することお勧め期待される LC50に 。
- 図 1に示すように、クリア 24 ウェル組織プレートの井戸のラベルを付けます。
- 1.5 mL チューブ テスト化学の原液を準備します。
- 各化学分析用天秤を使用して重量を量るし、溶解度の特性に応じて再滅菌 ddH2O、DMSO または選択の他の好適な有機溶媒で中断 (図 2参照)。
注: 計算化学の純度アカウントにかかる必要があります。たとえば、99% 純粋な化学、取得 1% 溶液にアセトンの 1,000 μ L で 10.1 mg を解散します。パラフィン フィルムで密封し、-20 ° C で保存
- 各化学分析用天秤を使用して重量を量るし、溶解度の特性に応じて再滅菌 ddH2O、DMSO または選択の他の好適な有機溶媒で中断 (図 2参照)。
- 評価され、適切な溶媒を使用してそれに応じて、原液からシリアル希薄を準備するテスト化学の最終的な濃度を決定します。
注: 濃度と化学、溶媒量はすることができます式 C1を使用して計算する * V1C2= * V2どこ C1= 1、C2のサンプルの濃度濃度サンプル 2、V1= = のボリュームサンプル 1 と V2= サンプル 2 のボリューム。図 2および表 1に示す計算例を参照してください。- 必要な試験濃度 (表 1 b) を取得する必要が、10 mM の原液およびシリアルの希薄を準備します。
- 組織培養テスト プレートのほかに 5 つの L3 幼虫ワイドボア プラスチック転送ピペットを使用して、転送します。L3 幼虫は長さが認識できる (~ 2.5 から 3.5 mm)、ヘッド カプセルの幅 〜 0.025 mm24。そっと 1 mL ピペットで水分を除去し、音量 ddH2O (下記参照) に置き換えます。N を取得する繰り返し治療 (すなわち、 20 幼虫治療あたり合計) あたり 4 技術をレプリケートします。
- 24 ウェル テスト プレートの 4 つのレプリケート井戸の各テスト化学の適切なボリュームを追加し、優しく化学の均一撹拌ようにプレートを旋回します。一定の条件下でテストまたは成長室でプレートを置き (例えば、 25 ° C と 〜 75-85 %rh をお勧めしますと暗い 12 h 光/12 h サイクル可能な場合)。
注: 実験の再現性は、その後の試金が同じ環境条件の下で実行されますを確認します。 - 各 1、30 分でも死者/非応答幼虫の個体数を記録 1.5、2、3、24、48、72 h の暴露後 (または別の時間ポイント) スコア シート (表 2) に。プレートの側面を軽くタップします。動きを認められなかった場合、生殖不能のつまようじと幼虫をそっと触れます。「死んでいる」とタッピング ・ タッチに応答しない幼虫をスコアします。
注: 他の形態学的および行動の表現型を生じること、記録することができます。 - 必要な場合、次のように変更されたアボットの式を使用してコントロールの死亡率の修正します。
死亡率 (%) = (X と Y) * 100/(100-Y)、
ここで、X = 処理サンプルと Y のパーセントの死亡率コントロールのパーセントの死亡率を =。 - ヒストグラムまたはグラフ パッド プリズム 6 または類似など好みのソフトウェアを使用して対数曲線として結果をグラフ化し、致死濃度 (LC) コントロールに対する相対値を計算します。
- N を取得する蚊の別のバッチを使用してアッセイを繰り返します 3 または生物的にレプリケートします。
3. 大人の局所アッセイ (単一ポイントの線量や線量応答アッセイ)
注: 大人の局所アッセイは、溶剤としてアセトンを使用して行われています。代替溶剤、オプションがありますが、それは 48 h 投稿露出で 10% の死亡率よりも最初に最終濃度が発生しないことを確認することが不可欠。アッセイは、単一の線量や線量応答測定点し、なり致死用量 (LD) を決定するために使用実行可能性があります。濃度 (最低 5) の範囲をテストする場合は後者を実行することお勧め期待される LD50に 。
- 試験を完了するために必要な大人のメスの蚊の数を決定します。
注: 単一の化学とポイント線量測定 90 蚊 (肯定的な制御、アセトンだけ否定的な制御のための 30 とテスト化学 30 30) の最小値が必要になります。 - 5 日齢雌成虫蚊に 3 を文化、吸引器 (図 3) を使用して別の 20 mL のプラスチックのバケツに移動します。
- 名前テスト化学濃度と紙コップ 9 オンスのラベルします。脇に 10 cm × 10 cm のメッシュ正方形、各コップの輪ゴム (図 4を参照)。
- (例えば、合成ピレスロイド剤、フォーカス) 肯定的な制御として既存殺虫剤を選択し、アセトンで 1% のストック溶液 (10 μ g/μ L) を準備します。
注: 計算化学の純度アカウントにかかる必要があります。たとえば、99% 純粋な化学、取得 1% 溶液にアセトンの 1,000 μ L で 10.1 mg を解散します。パラフィン フィルムで密封し、-20 ° C で保存 - 上記と同じ手順を使用して、テスト化学のストック溶液を調製します。
注: 多くのテスト化学が非常に不安定とソリューションできればされるべき生物検定が実行されるたびに新鮮。 - 肯定的な制御のシリアル希薄を準備し、20 mL ガラスバイアル以前アセトンで洗浄を使用して図 5のように、原液から化学をテストします。
- アセトン 1 mL ガラス製注射器をパージ、アセトンで埋める、0.25 μ L のボリュームを提供する調整マイクロ アプリケーターで固定します。
- 10 のバッチでの作業、3 - ケージ アスピレーターを使用してから 5 日間の古い雌成虫蚊を削除し、氷または冷蔵庫で 4 ° C で最大 5 分の麻酔。次に、最大 10 分間氷の上ペトリ皿と場所に蚊を転送します。
- 作業は迅速に、高級ピンセットで単一の女性を削除し、テスト ソリューションの 0.25 μ L を注射器マイクロ アプリケータを用いた背胸部に適用します。それぞれの蚊を確保するため解剖顕微鏡を用いた観察によって化学の配信受信テスト化学の適切なボリュームを確認します。
- 氷の上で休んでいるラベル紙コップに蚊を転送し、n を取得する 9 回繰り返します 10 扱われた蚊を =。ゴムのバンドと (12 h 日/12 h 夜のサイクルが望ましい) に 28 ° C と 75-85 %rh の一定条件下でのプラスチック浴槽または成長室に転送で保護メッシュ正方形でカップで蚊をシールします。
- 2 回 n を取得する上記の実験を繰り返す = 治療またはコントロールのグループごとに 3 技術的複製 (すなわち30 蚊合計)。
- 最初テスト化学とし、肯定的な制御の 3.7 3.10 の手順を繰り返します。
注: 十分な蚊が利用可能な場合を含める別の便利な制御テスト化学または溶剤のいずれかを受信しない麻酔蚊を 30 の「空白」です。 - 30 分、60 分、2、24、48 h の暴露後に「死者/非応答"蚊の個体数を記録 (または別の時間ポイント) スコア シート (表 3) を使用して。「死者/非応答」彼らは動きの欠如を示す場合 1 つの側面または背面に、飛ぶことができない置くこととして定義されて蚊をスコアします。
- 必要な場合は、次のように変更されたアボットの式を使用してコントロールの死亡率の修正します。
死亡率 (%) = (X と Y) * 100/(100-Y)、
ここで、X = 処理サンプルと Y のパーセントの死亡率コントロールのパーセントの死亡率を =。 - ヒストグラムまたは指数曲線として結果を表示します。用量反応試験の LD50、LD75またはコントロールに対する相対試験化学 LD90値を計算します。
- 少なくとも 2 回蚊の別のバッチを使用して n を取得するアッセイを繰り返す = 3 または生物的にレプリケートします。
4. 大人の吸血のアッセイ (単一ポイントの線量や線量応答アッセイ)
- 収集 150 約 4-5 日古い雌成虫蚊と別ケージに移動。線量応答測定を実行する場合、6 ケージを取得するを繰り返します。砂糖 1 24 h 前に餌の試金のソースを削除します。
- 会計 (典型的な原液は水または塩バッファー 80 mM) 化学純度のため、上記のように化学の原液を準備し、その後水/バッファー必要に応じてのシリアル希薄を準備します。
- 脱フィブリン ウサギで献血希望試験濃度の 960 μ L に希釈のそれぞれ 40 μ L を追加します。給紙ユニットに薄膜を適用し、ゴム製のリングのシールします。ピペットで 1 mL の血液を転送し、給紙ユニットを加熱装置に添付します。
- 優しく膜表面たて綿棒は蚊成虫のケージに 10% 乳酸溶液と給紙ユニットの場所を作った。暗い布や黒いゴミ袋でケージをカバーし、1 時間を養うため蚊を許可します。
- 残りのテスト ソリューションと負 (血のみ) コントロールの 4.2 4.4 手順を繰り返します。
- 餌の完了、蚊を麻酔を 5 分間冷蔵庫で 4 ° C にバケットを配置します。オスの蚊と非給電のメスの蚊を削除しカウントし、供給され、腹部の検査で蚊を部分的に供給の総数を記録します。
- 線量あたり 50 吸血蚊の最小値を目指して、部分的、完全に供給のメスの蚊を保持します。
- (12 h 日/12 h 夜のサイクルが望ましい) に 28 ° C と 75-85 %rh の一定条件下でのプラスチック浴槽または成長室にバケツを転送します。
- 0.5、1、1.5、2、24、48 で死者/非応答蚊の合計数を記録し、スコアを使用して 72 時間 (または必要に応じて代替時点) シート (表 4)。
- 第 3 日ポスト血液摂餌、ケージに卵カップを導入して 72 時間の期間にわたって卵を集めます。解剖顕微鏡下での治療あたりの生産卵の合計数をカウントします。
- パーセントの死亡率と産卵数とコントロールの各治療群の供給の蚊の合計数の関数として計算します。必要な場合、変更したアボットの式を使用してコントロールの死亡率を修正します。
- (線量応答測定を実行する) 場合毒性と産卵数のデータをヒストグラム プロットまたは指数曲線として表示の好みのソフトウェアを使用しています。線量応答測定を実行している場合は、LD50、LD75またはコントロールに対する相対試験化学 LD90値を計算します。
- 少なくとも 2 回蚊の別のバッチを使用して n を取得するアッセイを繰り返す = 3 または生物的にレプリケートします。
Representative Results
図 6は、ドーパミン受容体拮抗薬、アミトリプチリン、水と比較しての 5 つの線量に被ばく L3 Ae。 ネッタイシマカのパーセントの死亡率を示しています (負の) コントロールのみ 24、48、72 h で。この例での各時間ポイントで収集されたデータは典型的な対数曲線を表示して、アミトリプチリンの幼虫死亡率の用量依存的効果を明らかにします。LC50値は実験の時間にわたって低下し、72 h データ (すなわち、対数曲線の中点) を使用して計算することができます。
図 7は、3 - 5 日齢雌成虫Ae ネッタイシマカのパーセントの死亡率を示しています次の 400 μ m 線量 (10 μ g/μ l) のドーパミン受容体拮抗薬、アミトリプチリンと合成ピレスロイド系と比較すると露出。フォーカス正管理 (技術的な等級; 500 pg/μ L)、アセトンだけ否定的な制御および未処理蚊 (空白)。この例では、アミトリプチリンとフォーカスの両方負のコントロールを基準として重要な成人死亡を引き起こします。代謝解毒化学テストのためおそらく、時間をかけて大人の死亡率を減少させることに注意してください。
図 8は、3 ~ 5 日古い大人の女性のパーセントの死亡率 (左 y 軸) Ae ネッタイシマカ供給 4 用量ドーパミン受容体拮抗薬、アミトリプチリン、および多産の 1 つで治療血液の食事 (右の y 軸; 平均卵数/。女性) 最初の生殖サイクル ポスト露出コントロール蚊と比較して (吸血のみ; 負の制御)。データでは、重要なコントロールに対する相対成人死亡率に及ぼすアミトリプチリンが示さないアミトリプチリンが最高用量 (400 μ M) で産卵数を大幅に増加があることを明らかにします。
図 1.幼虫の線量応答測定のセットアップ。24 ウェル プレートでのネッタイシマカL3 幼虫を用いて幼虫線量応答アッセイのセットアップを示す画像。
図 2.図 24 ウェル プレートで (A) 単一ポイント線量または (B) 線量応答幼虫試金のセットのプロシージャを現してします。5 L3 幼虫の井戸への転送、余分な水は優しくピペットを介して削除、新鮮な滅菌 ddH2O を置き換え次に、株式テスト化学のシリアル希薄、準備し、1 mL/ウェルの最終的なボリュームに追加します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.蚊成虫のカルチャ。画像表示 20 L プラスチック バケツ蚊成虫の文化およびアスピレーターの使用のため蚊.を削除するために使用
図 4.4-5 日古い女性を使用して実行される大人の局所アッセイネッタイシマカ.化学治療後または溶剤、大人の蚊が紙コップに置かれ、アッセイの持続期間のための試験室に転送。
図 5.株式およびシリアルの希薄。(A) 在庫の準備のための手順と大人の局所の試金のための (B) シリアル テスト ソリューションを示す模式図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6.幼虫のお問い合わせ線量応答分析から代表的なデータです。ドーパミン受容体拮抗薬、24、48、72 h でアミトリプチリンに被ばくネッタイシマカL3 幼虫のパーセントの死亡率を示す幼虫連絡先線量応答から代表的なデータの試金します。各データ ポイントを表す μ M ± SEM. データを表す n の平均 3 生物をレプリケートします。
図 7.成人の局所線量応答アッセイから代表的なデータです。ドーパミン受容体拮抗薬、3 ~ 5 日にアミトリプチリン (10 μ g/μ L) の毒性を示す成人の局所線量応答分析から代表的なデータ合成ピレスロイド、フォーカス (500 pg/μ L) 肯定的な相対的な古い女性ネッタイシマカコントロール) と負の制御 (アセトン車両のみ) 2、24、48 h.データを表す n 3 生物をレプリケートします。誤差範囲を示す SEM.
図 8.成人摂取アッセイから代表的なデータです。ドーパミン受容体拮抗薬、100 μ M、200 μ M および 400 μ M のアミトリプチリンの毒性を示す成人摂取アッセイから代表的なデータの 3-5 日に線量古い大人女性ネッタイシマカと産卵数 (平均総卵として表現への影響数女性最初の生殖サイクル以上)。データを表す n = 3 の生物的複製 ± SEM.
| A. 3 化学と一点用量試金 | |||||
| 化学 | 濃度 (400 uM) | ||||
| アミトリプチリン | アミトリプチリン X 98% (粉の純度) 0.001 g/1 mg × 1 mol 313.86 g X 1 L/0.08 mol X 106 μ L/L × 80 mM 在庫: 2 mg = 水の 78.06 μ L。 | ||||
| シリアル希薄:DdH2O でストック 1:2、1:4 10 mM を達成するために希釈します。含む ddH2400 μ M/ウェルの最終的な集中を達成するために 0 の 960 μ L に 40 μ L の 10 の mM の在庫を追加します。 10 mM の在庫 5 mM、2.5 mM、1.25 mM、0.625 mM の在庫を達成するために 1:2 のシリアル希薄を準備します。 | |||||
| シス形-(z)-flupenthixol | cis (z) flupenthixol X 98% (粉の純度) 0.001 g/1 mg × 1 mol/507.44 g cis (z) flupenthixol X 1 L/0.08 mol X 106 μ L/L × 80 mM 在庫: 2 mg = 水の 48.28 μ L。 | ||||
| シリアル希薄:上記のように。 | |||||
| Amitraz | Amitraz X 0.001 g/1 mg × 1 amitraz × 1 L/0.08 mol X 106 μ L/1 L mol/293.4 g の80 mM 在庫: 2 mg = DMSO の 85.21 μ L (注: Amitraz は DMSO に溶解のみ)。 | ||||
| シリアル希薄:上記のように。 | |||||
| B. 線量応答測定 | |||||
| 化学 | 線量 1 | 線量 2 | 線量 3 | 線量 4 | 線量 5 |
| 400 Μ M | 200 Μ M | 100 Μ M | 50 Μ M | 25 Μ M | |
| 例えば、アミトリプチリン、cis-(Z)-flupenthixol または amitraz | 40 Μ L | 40 Μ L | 40 Μ L | 40 Μ L | 40 Μ L |
| 10 mM の在庫 | 5 mM の在庫 | 2.5 mM の在庫 | 1.25 mM の在庫 | 0.625 mM 在庫 | |
テーブル 1。計算例ネッタイシマカ L3 幼虫 (A) 単一ポイントの線量測定と (B) 線量応答アッセイ。
表 2。蚊幼虫の線量応答分析からデータを記録する使用例スコアシート。1 %dmso や他の溶媒だけで水または制御、水だけ。アミトリプチリンなどの小分子拮抗薬化学のテストに使用する典型的な用量は 25 μ、50 μ M、100 μ M、200 μ M、400 μ M。
| 蚊アダルト (3 ~ 5 日古い) の局所分析 | ||||||
| 開始日付: | ||||||
| 治験責任医師: | ||||||
| 種/ひずみ: | ||||||
| 型の分析:一点線量/用量反応 | ||||||
| A. 死亡号死んだ蚊) | ||||||
| 時間 (時間) | 線量 1 | 線量 2 | 線量 3 | 線量 4 | 線量 5 | コントロール |
| 0.5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
| B. % 死亡率 | ||||||
| 時間 (時間) | 線量 1 | 線量 2 | 線量 3 | 線量 4 | 線量 5 | コントロール |
| 0.5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
表 3.成人の局所線量応答分析からデータを記録する使用例スコアシート。
| 蚊アダルト (3 ~ 5 日古い) の摂取法 | ||||||
| 開始日付: | ||||||
| 治験責任医師: | ||||||
| 種/ひずみ: | ||||||
| 型の分析:一点線量/用量反応 | ||||||
| A. 数供給蚊 | ||||||
| 線量 1 | 線量 2 | 線量 3 | 線量 4 | 線量 5 | コントロール | |
| 供給 | ||||||
| 取り込まれない | ||||||
| 合計 | ||||||
| % 連邦準備制度 | ||||||
| % 取り込まれない | ||||||
| B. 死亡号死んだ蚊) | ||||||
| 時間 (時間) | 線量 1 | 線量 2 | 線量 3 | 線量 4 | 線量 5 | コントロール |
| 2 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
| C. % 死亡率 | ||||||
| 時間 (時間) | 線量 1 | 線量 2 | 線量 3 | 線量 4 | 線量 5 | コントロール |
| 2 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
表 4。大人の血液栄養分析からデータを記録するために使用例スコアシート。アミトリプチリンなどの小分子拮抗薬化学のテストに使用する典型的な用量が 50 μ M、100 μ M、200 μ M、400 μ M。
Discussion
殺虫剤は、25マラリア、デング熱、ジカ26など蚊媒介疾患と戦うための強力なツールです。広範な殺虫剤の使用は、化学的制御に耐性の単一の最大の脅威である殺虫剤の抵抗の開発につながる続けている疾病媒介蚊集団を生産しています。最後の十年は、ハマダラカ属耐性蚊帳アフリカ7で使用されている合成ピレスロイド (SPs) の人口の劇的な増加を見ています。ヒトスジシマカ、デング熱のベクトルとジカ、集団は、フロリダ州、ニュージャージー州有機リン剤6に耐性のある報告されています。同様に、DDT とピレスロイド系殺虫剤への抵抗は、コロンビア27,28ハマダラカ、ヤブカ属の個体数で記載されています。新しい殺虫剤と多様な orthosteric にバインドする adulticides を開発する緊急の必要性があるまたは知られている分子標的のアロステリック サイトが新しいターゲット (すなわち、小説 MoA 化学)29,30を混乱させると環境負荷の少ないがあります。モスキート コントロール31,32,33endectocides の周り潜在的な認識になっています。
このような製品の迅速な開発を容易にするには、一連の蚊幼虫と 2 つの配送ルート - 接触、経口摂取による大人に小分子化合物の毒性を評価するために設計されたプロトコルについて述べる。WHO 感受性テストなど CDC ボトルの試金のプロトコル、共通の毒性と既存殺虫製剤1,2の撥水性を評価するための使用です。しかし、これらの試 unformulated 新しい化学実体 (NCEs) の解析では限界がある、中程度または高スループットで多数の化学のテストに従順ではないです。
ここ高いスループット分析のため、拡張可能な単一ポイント線量の NCEs を高速に評価する標準的な幼虫の試金を記述します。大人の蚊に小分子の化学的性質の接触毒性を評価するライト21によって開発されたアッセイの適応についても述べる。最後に、雌成虫蚊に吸血を介して配信 NCEs の毒性を評価するための摂取法と潜在的な動物用駆虫剤を探索.これらの幼虫及び成虫の試金は、それぞれ、LC、LD の値を決定するために用量の範囲で実行できます、1 つまたは複数の既存化学製剤と比較して幼生及び成体の連絡先アッセイを実行できます。大人の局所アッセイは、個々 蚊あたり LD 値の計算もできます。プロトコルしアカイエカヒトスジシマカ、ハマダラカの16,29の種を使用して実行することができます、必要な場合に、種の特定の生物学的特性に合わせて変更できます。我々 の経験で mosquitocidal の化学的性質は通常これら 3 属16,29の間で広範な活動を展示がある魚種選択性の評価値。
法は、急速に殺虫活性の複数の化学物質をスクリーニングするための開始点です。1 つまたは複数のアッセイで毒性を示すそれらの化学反応は、二次、三次の試金によるさらなる分析の選択でした。LITE 瞼アッセイと砂糖の試金34,35を餌があります。追加試金の選択は、通常製品の配信モードに洞察力を提供する結果と予想される市場とアプリケーションの考慮事項によって決まります。ここに示した代表的な結果ではアミトリプチリン、潜在的な小説 MoA 殺虫剤10,12,として評価されている哺乳類、無脊椎動物のドーパミン受容体の拮抗薬の毒性を探る13,16. アミトリプチリン展示幼虫および大人Ae aegytpiの μ g の範囲を示唆殺虫と成虫の活動とアミトリプチリン ベースの化学シリーズの探査のための理論的根拠を提供する識別するためにへの毒性。高ポーテンシーと類似。Ae。 ネッタイシマカ血食事アミトリプチリンにさらされるは死亡率や産卵数に重大な影響は認められなかった。脱フィブリン血と受信した蚊あたりの実効線量の化学安定性は知られていない、アッセイの顕著な制限データ、アミトリプチリンと他の GPCR 活性物質可能性が示唆された小さな可能性として endectocides で少なくとも、unformulated 状態。
試金の間の生物学的変動を制限する対策が不可欠です。すべてのアッセイは、再現性を確保するために温度、湿度、好ましくは昆虫成長室での標準的な条件の下で行わなければなりません。これらは非常に主観的な別の研究者によって記録されたデータの大幅な変化につながることができる表現型エンドポイントをスコアリングのための手順を標準化することが不可欠です。幼虫のアッセイは、アッセイは、最終濃度がよくあたり 1% 未満、DMSO などの有機溶媒を使用して実行できますが、水溶性で、化学的性質の評価に最適です。大人の局所アッセイにいくつかの制限を認識しています。まず、シリアル希薄を準備するとき、急速に動作する必要があるし、キャリア (アセトン) は揮発性の高い蒸発が生じる化学量変化と用量をもたらします。第二に、これは死亡率に貢献できるよう麻酔の期間を制限するため注意が必要があります。また、アセトンなどの溶剤がテスト化学による効果と混同すべきではない話題のアッセイの最初の数時間で急速な「ノックダウン」効果を作り出すことができる注意する必要があります。我々 は、蚊の吸血量は成人摂取試験で大人 1 名につき受け取った線量の評価を複雑な個人によって異なります注意してください。最後に、測定データを陰性対照の死亡率が 10% を超えた場合に見なすべきでない。
相乗的に動作する製品は、その潜在的な既存製品の有用性を拡張し、殺虫剤抵抗性害虫の人口の15,16,36の制御を提供するますます認識されます。幼虫の試金は formamidine 農薬、amitraz、様々 な無脊椎動物オクトパミン受容体14,15を混乱させる化学間の相乗作用を調べるために使用されています。幼虫のアッセイと説明大人の局所分析テスト化学の組み合わせの間の相乗的あるいは添加物効果の評価に適しています。我々 はここで説明した 3 つの試金のそれぞれに共力剤ピペロニルブトキシド (PBO) などを組み込むことができます注意してください。
上記の試金は水生と陸生の蚊のライフ ステージに対して unformulated、小分子薬の評価に関する標準化された実験的なシリーズを提供します。これらのアッセイは、毒性を評価し、共通の使用を試金する既存の上のいくつかの利点を提供する設計します。重要なは、法はオートメーションに適しているし、テスト混合物の何千もの評価を有効にする工業的規模で実行できます。最後に、フィールドは、新しい 2442億を介して動作する製品の開発を検討、新たな分子標的と生化学的経路の混乱など不可欠になります以外死亡率など複数の表現型エンドポイントを獲得して麻痺。上記の試金は、このように明日の革新的な殺虫技術に向けてのステップを提供する、このような調査を許可します。
Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
著者 H. ランソン、分析法の開発と LITE の議定書のいかなる規定についてリバプール熱帯医学校に感謝し、m ・ シャーフ、パデュー大学のアッセイに関する助言のためのデザインします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insecticide susceptible mosquito strains | Malaria Research and Reagent Reference Repository | https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Recommended strains: Aedes aegypti Liverpool (LVP) strain, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) strain and Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) strain | |
| Acetone | Mallinckrodt Chemical | CAS 67-64-1 | Use for dilutions and control |
| Amitraz | Sigma-Aldrich | CAS 33089-61-1 | Requires dilution in DMSO |
| Amitriptyline | Sigma-Aldrich | CAS: 549-18-8 | Can be diluted in acetone |
| Bifenthrin | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Synthetic pyrethorid used as positive control |
| Cis-(Z)-flupenthixol | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Pharmacologically tested as disruptor of dop-like receptors |
| Defibrinated rabbit blood | Hemostat | DRB0100 | Blood source for adapted mosquitoes to artificial feeding |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | MKBF2985 | Organic solvent used to disolve amitraz |
| Hemotek membrane feeding system | Hemotek Ltd | Serial no. 1303 | Used for feeding mosquitoes |
| Micro-applicator | Burkard Manufacturing Co. | - | Tool needed for topical application experiments |
| 24-well cell culture plate with lid | Corning Incorporated | 3526 | - |
| Advantage rubber bands | Alliance Rubber Co. | - | Used to seal the paper cups |
| Glass syringe (1 ml) | Becton Dickinson and Co. | 512004 | Needed for the micro-applications. Glass is better than plastic |
| Disposable scintillation vials (20 ml) | Fisher Scientific | 74505-20 | Glass vials prevent evaporation |
| Tulle fabric, white | Walmart | - | - |
| Paper cups | Dixie Consumer Products LLC. | PF15675/13D | Used to keep adult mosquitoes in adult topical assays |
| Petri dishes (150 mm) | Corning Life Sciences | - | Used to maintain the mosquitoes "slept" on cold without direct contact with ice |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | Used to sort larvae |
| Stereo microscope | Olympus | SZ6045 | Used to score larval assays and perform micro-applications |
| Tweezers (fine) | Fontax | - | Used to handle adult mosquitoes |
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