Summary
Protokoller er beskrevet for å vurdere toksisitet av kjemikalier til umodne og voksen mygg for utvikling som nye klasser av larvicides, adulticides og endectocides. Protokollene gjør høy gjennomstrømming testing av flere kjemikalier på ett-punkts dose og påfølgende evaluering via dose svar analysen for å fastslå giftigheten kontakt eller via inntak.
Abstract
Nye klasser av insektmidler med romanen moduser handling er nødvendig for å kontrollere insektmiddel motstandsdyktig bestander av mygg som overfører sykdommer som Zika, dengue og malaria. Analyser for rask, høy gjennomstrømming analyser av unformulated roman kjemikalier mot mygg larver og voksne presenteres. Vi beskriver protokoller for enkelt punkt-dose og dose svar analyser vurdere toksisitet av små molekyl kjemikalier til Aedes aegypti vektor Zika, dengue og gul feber, malaria vektor, Anopheles gambiae og Nord huset mygg, Culex quinquefasciatus, kontakt og via inntak. Som et eksempel vurdert vi toksisitet av amitriptyline, et lite molekyl antagonist av G protein-kombinert reseptorer, via larver, voksen aktuell og voksen blodet-fôring analysen. Protokollene gir et utgangspunkt for å undersøke insektmiddel potensielle. Resultatene diskuteres i forbindelse med flere eksperimenter å utforske produktet programmer og mekanismer for levering.
Introduction
Mygg overføre den forårsaker agenter av smittsomme sykdommer som påvirker menneskers helse globalt1. De tre viktigste mygg slektene påvirker menneskers helse er Aedes, Anopheles, og Culex. Arter av Aedes mygg vektor arboviruses at Zika, dengue, gulfeber og chikungunya. Anopheles Art vektor parasitten og Culex Art overføre West Nile virus og filarial nematoder2. World Health Organization (WHO) har kalt for avskaffelse av ti forsømte tropiske sykdommer (NTD) av 20203 og identifisert mygg kontroll som den mest levedyktige strategien. Insektmidler er kraftige verktøy til å styre mygg og redusere sykdommen overføring4,5. Men truer fremveksten av insektmiddel-resistant mygg befolkningsgrupper kontrollen fortsatt mange sykdommer6,7,8. Nyskapende Vector kontroll Consortium (IVCC) har lansert den første dedikerte innsatsen å utvikle erstatning insektmidler for mygg kontroll9. Nye insektmidler med romanen moduser handling (MoA) for å møte som mål og oppnå sykdomskontroll. Oppdagelsen og utvikling av nye insektmiddel klasser med roman MoAs krever hele organismen analyser for rask, høy gjennomstrømming analyse av kjemikalier og i forhold til industrien standard10.
Det finnes flere analyser å evaluere repellency og toksisitet av insektmidler larver og voksne mygg, og noen er egnet for vurdering av romanen formulert eller unformulated kjemikalier. WHO protokollen11 er en kontakt analysen brukes til å teste produkter mot fjerde skikkelsen larver. Publiserte studier beskriver også en rekke larver analyser brukes til å teste toksisitet av små molekyl kjemikalier til Larvene Aedes aegypti, Anopheles gambiae og Culex quinquefasciatus10,12, 13,14,15,16. Centers for Disease Control og Prevention (CDC) flaske bioassay brukes til å vurdere insektmiddel motstand i feltet fanget populasjoner av voksen mygg via evaluering av dødelig konsentrasjon (Langbane) og dødelige tid (LT) sammenlignet med en standard diagnostiske dose av en kommersiell insektmiddel17. WHO mottakelighet testen tilbyr en annen tilnærming for å evaluere insektmiddel motstand i voksen mygg der mygg er utsatt for insektmiddel-impregnert papiret inni hetteglass 1t og dødelighet vurderes 24 h18. Andre analyser spray formuleringer i forseglet bur og registrere mygg knockdown og død ønsket timepoints19. Lokal applikasjon til mygg thorax er brukt til å vurdere styrken på ulike plantevernmidler20. Liverpool insekt Testing etablering (LITE)21 bruker Standard operasjonsprosedyrerå vurdere bioactivity av kjemikalier til voksen mygg. LITE voksen aktuell analysen gjelder en liten mengde test produktet thorax av voksen mygg med dødelighet scoret på 48 timer. Analysen kan kvantifisering av dosen mottatt per personlige mygg21. LITE tarsal analysen evaluerer toksisitet av test produktet til voksen mygg hviler på en kjemisk behandlet overflate og brukes til å identifisere kjemikalier med potensial for utvikling som innendørs gjenværende spray (IRS) eller bruke insektmiddel behandlet bed-garn (ITNs) kontrollere Anopheles myggen.
WHO og CDC analyser har begrensninger for testing roman, unformulated kjemikalier, og målet med CDC flaske bioassay er evaluering av mottakelighet over kort analysen perioder (to timer) enn toksisitet22,23. I tillegg analyser for å vurdere toksisitet av kjemikalier levert i blod måltid og potensial for utvikling av systemisk-fungerende produkter (dvs. endectocides) mangler. Her beskriver vi analyser for å teste mosquitocidal aktiviteten til romanen kjemikalier som er løselig i vann eller en av flere organiske løsemidler mot larver og voksne Aedes, Anopheles og Culex. Først viser vi en larver analysen tidligere beskrevet av vår gruppe10,12,13,16, og utføres her som (1) en skjermen å raskt vurdere flere kjemikalier på enkelt dose, og (2) en dose svar analysen å bestemme dødelige konsentrasjonen (f.eks LC50, . LC75 eller LC90,) i en enkelt kjemi. Neste, vi beskrive to voksne analyser for fastsettelse av dødelig dose (LD). Først av disse er en tilpasning av LITE protokollen for testing av lokalt anvendt, romanen kjemikalier mot voksne mosquitoes i forhold til en positiv kontroll. Andre er en fôring analysen for vurdering av kjemikalier levert systemisk via blod måltid.
Protocol
Merk: Alle stammer og reagenser kreves for arbeidet som beskrives i følgende protokoller, og leverandører er oppført i Tabellen for materiale.
1. kultur av mygg larver og voksne
Merk: Insektmiddel utsatt stammer av mygg er tilgjengelige fra Malaria forskning og reagens referanse oppbevaringssted. Anbefalt stammer er som følger: Aedes aegypti Liverpool (LVP) belastning, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) belastning og Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) belastning.
- Kultur Larvene egg på en 12 h dag/12 h natt syklus på 28 ° C og 75-85% relativ fuktighet (RH) i 25 cm x 40 cm plast skuffer (~ 400 Larvene per skuff) som beskrevet av Nuss29. Mate Larvene bakken gerbil (A. aegypti og An. gambiae) eller flak fisken næringen (C. quinquefasciatus). For larver analyser, innhente larver i tredje (L3) skikkelsen larvestadiet.
- Bakre voksen mygg fra pupae som er overført til plast kopper og sted innenfor 20 L plastmerder i en insectary under forholdene som er beskrevet ovenfor. Opprettholde mygg på 20% sukkeroppløsning som beskrevet andre steder29. Samle voksne på 3-5 dager innlegget fremveksten.
2. larver kontakt analysen (enkelt punkt Dose eller Dose svar analysen)
Merk: Analysen kan gjennomføres med kjemikalier som er løselig i vann eller dimethyl sulfoxide (DMSO), forutsatt at den endelige konsentrasjonen av DMSO i test brønner ikke overstiger 1%. Alternative løsemidler kan være et alternativ, men det er viktig å først bekrefte at den endelige konsentrasjonen ikke forårsaker mer enn 10% dødelighet på 72 h innlegget eksponering. Analysen kan utføres som en enkelt dose eller dose svar analysen. Hvis utfører sistnevnte, anbefales det å teste en rekke konsentrasjoner (minimum fem), som strekker seg over den forventede LC50.
- Merk brønnene av en klar 24-og vev plate som vist i figur 1.
- Forberede en lagerløsning test kjemi i en 1,5 mL tube.
- Veier hver kjemi ved hjelp av en analytical balanse, og avhengig av løselighet egenskaper, re suspendere i sterilt ddH2O, DMSO eller andre passende organisk løsemiddel valgfrihet (se figur 2).
Merk: Beregninger bør ta hensyn til renheten i kjemi. For eksempel for en kjemi det er 99% ren, oppløse 10,1 mg i 1000 µL av acetone å få en 1% løsning. Forsegle med parafin film og lagre på 20 ° C.
- Veier hver kjemi ved hjelp av en analytical balanse, og avhengig av løselighet egenskaper, re suspendere i sterilt ddH2O, DMSO eller andre passende organisk løsemiddel valgfrihet (se figur 2).
- Bestemme endelige konsentrasjonen av testen kjemien som evalueres og forberede føljetong fortynninger fra lager løsning tilsvarende, bruker det riktige løsemiddelet.
Merk: Konsentrasjonen og volumet av kjemi og løsemiddel kan beregnes ved hjelp av formelen C1* V1= C2* V2 hvor C1= konsentrasjon av prøve 1 C2= konsentrasjon av prøve 2 V1= antall 1 og V2= volum av prøve 2. Se eksempel beregninger vist i figur 2 og tabell 1.- Forberede en 10 mM lagerløsning og føljetong fortynninger som nødvendig for å få ønsket test konsentrasjoner (tabell 1B).
- Bruke en wide-fødte plast overføring pipette, overføre fem L3 Larvene til av en vev kultur test plate; L3 Larvene kan bli gjenkjent av lengde (~ 2,5-3,5 mm) og hodet kapsel bredden på ~ 0.025 mm24. Forsiktig fjerne vannet med en 1 mL pipette og erstatte med det ønskede volumet av ddH2O (se nedenfor). Gjenta for å få n = 4 teknisk gjentak per behandling (dvs. 20 Larvene totalt per behandling).
- Legg den aktuelle mengden test kjemi til hver av de fire Repliker brønnene i 24-vel test platen og forsiktig snurr den for å sikre jevn blanding av kjemi. Plasser platen i en test eller vekst kammer under konstant forhold (f.eks 25 ° C og ~ 75-85% RH anbefales, og en 12 h lys/12 h mørke syklus hvis mulig).
Merk: For reproduserbarhet mellom eksperimenter, kontroller påfølgende analyser utføres under de samme miljøforholdene. - Registrere antall døde/ikke-responsive larver i hver brønn på 30 min, 1, 1,5, 2, 3, 24, 48 og 72 h etter eksponering (eller alternative tidspunkt) på poengsummen ark (tabell 2). Forsiktig Trykk på siden av platen. Hvis ingen bevegelse er observert, forsiktig trykk Larven med en bakteriefri tannpirker. Score larver som ikke reagerer for å peke/touch som "død".
Merk: Andre morfologiske og atferdsmessige fenotyper observeres og kan registreres. - Korrigere kontroll dødelighet bruker den endrede Abbotts formelen hvis ønskelig, som følger:
Dødelighet (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),
der X = prosent dødeligheten i behandlet utvalg og Y = prosent dødeligheten i kontrollen. - Graf resultater som et histogram eller logaritmisk kurve ved hjelp av programvaren til valg for eksempel Graph-pad prisme 6 eller lignende, og beregne dødelig konsentrasjon (Langbane) verdier i forhold til kontrollen.
- Gjenta analysen ved hjelp av en egen gruppe med mygg for å få n = 3 eller mer biologiske gjentak.
3. voksen aktuell analysen (enkelt punkt Dose eller Dose svar analysen)
Merk: Voksen aktuell analysen er gjennomført med aceton som et løsemiddel. Alternative løsemidler kan være et alternativ, men det er viktig å først bekrefte at den endelige konsentrasjonen ikke forårsaker mer enn 10% dødelighet på 48t innlegget eksponering. Analysen kan utføres som en enkelt dose eller dose svar analysen og brukes til å bestemme dødelig dose (LD). Hvis utfører sistnevnte, anbefales det å teste en rekke konsentrasjoner (minimum fem), som strekker seg over den forventede LD50.
- Bestemme antall voksne kvinnelige mygg kreves for å fullføre analysen.
Merk: En punkt dose analysen med en enkelt kjemi krever minst 90 mygg (30 for positiv kontrollen 30 for kontrollen aceton-bare negative og 30 for test kjemi). - Kultur 3 til 5 dager gamle voksne kvinnelige mygg og flytte til en egen 20 mL plast bøtte med en aspirator (Figur 3).
- Etiketten 9 oz papir kopper med navn og konsentrasjonen av testen kjemi. Avsatt 10 cm x 10 cm mesh torg og gummi band for hver kopp (se Figur 4).
- Velg et eksisterende insektmiddel som en positiv (f.eks den syntetiske pyrethroid, bifenthrin) og forberede en 1% lagerløsning (10 µg/µL) i aceton.
Merk: Beregninger bør ta hensyn til renheten i kjemi. For eksempel for en kjemi det er 99% ren, oppløse 10,1 mg i 1000 µL av acetone å få en 1% løsning. Forsegle med parafin film og lagre på 20 ° C. - Bruke samme fremgangsmåte som ovenfor, forberede en lagerløsning test kjemi.
Merk: Mange test kjemikalier er svært labil løsninger skal anlegges fersk hver gang bioassay utføres. - Klargjøre føljetong fortynninger av positiv kontrollen og teste kjemikalier fra lager løsninger som vist i figur 5 bruker 20 mL hetteglass tidligere skylles med aceton.
- Tøm 1 mL glass sprøyte med aceton, fyll med aceton og sikre mikro-applikatoren justert for å levere et volum på 0,25 µL.
- Arbeider i grupper på ti, Fjern 3 - 5 - dagers gammel voksen kvinnelig mygg fra bur med en aspirator og bedøve for opp til fem minutter til 4 ° C i kjøleskap eller på isen. Deretter overføre mygg til en Petriskål og sted på is opptil 10 min.
- Arbeider raskt, fjerne en enkelt kvinne med fine pinsett og 0,25 µL av test løsning gjelder dorsal thorax bruke sprøyte mikro-applikatoren. Bekreft levering av kjemi ved observasjon bruke dissecting mikroskop for å sikre hver moskito mottar den riktige mengden test kjemi.
- Overføre mosquito til et merket papir kopp hviler på is, og gjenta ni ganger å få n = 10 behandlet mygg. Forsegle myggen i koppen med en mesh kvadrat sikret med en strikk, og overføre til en plast badekar eller vekst kammer under konstant forhold med 28 ° C og 75-85% RH (på en 12 h dag/12 h natt syklus anbefales).
- Gjenta over eksperimentet to ganger for å få n = 3 teknisk replikat (dvs. 30 mygg totalt) per behandling eller kontroll gruppe.
- Gjenta trinn 3.7-3.10 først med test kjemi og deretter kontrollen positiv.
Merk: En annen nyttig kontroll med Hvis tilstrekkelig mygg er en "blank" av 30 bedøvet mygg som ikke mottar test kjemi eller løsemiddel. - Registrere antall "død/utilgjengelig" mygg på 30 minutter, 60 minutter, 2, 24 og 48 h etter eksponering (eller alternative tidspunkt) med poengsummen ark (tabell 3). Score myggen som "død/utilgjengelig" hvis de viser manglende bevegelsen, definert som legging på den ene siden eller på baksiden og manglende evne til å fly.
- Eventuelt korrigere kontroll dødelighet ved hjelp av den endrede Abbotts formel som følger:
Dødelighet (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),
der X = prosent dødeligheten i behandlet utvalg og Y = prosent dødeligheten i kontrollen. - Viser resultater som et histogram eller en eksponentiell kurve. For en dose svar analysen, beregne LD50, LD75 eller LD90 verdi for testen kjemien i forhold til kontrollen.
- Gjenta analysen minst to ganger bruke separate grupper med mygg for å få n = 3 eller mer biologiske gjentak.
4. voksen blodet-fôring analysen (enkelt punkt Dose eller Dose svar analysen)
- Samle ca 150 4-5-dagers gammel voksen kvinnelig mygg og overføring til separate bur. Gjenta for å få 6 burene hvis utfører en dose svar analysen. Fjerne kilden av sukker 1-24 h før fôring analysen.
- Forberede en lagerløsning kjemi som beskrevet ovenfor, regnskap for renhet av kjemi (en vanlig lager løsning er 80 mM i vann eller salt buffer), og deretter forberede føljetong fortynninger i vann/buffer som kreves.
- Legge til 40 µL av hver av fortynninger 960 µL defibrinated kanin blod å få ønsket test konsentrasjonen. Bruke membran film til en mating og forsegle med en gummi ring. Overføre 1 mL blod via pipette og feste fôring enheten oppvarming enhet.
- Forsiktig vattpinnen membranen overflaten med fersk gjort 10% melkesyre løsning og sted mating i buret av voksen mygg. Dekk buret med en mørk klut eller svart søppel pose og la mygg å mate i én time.
- Gjenta trinn 4.2-4,4 for resten av testen løsninger og den negative (bare blod).
- Ved ferdigstillelse av fôring, plass bøtter på 4 ° C i kjøleskap i 5 min til å bedøve mygg. Fjerne mannlige mygg og ikke-matet kvinnelige mygg, og teller og registrere antall matet og delvis matet mygg av undersøkelse av magen.
- Beholde delvis og fullt innmatede kvinnelige mygg, satsing for minst 50 blod-matet mygg per dose.
- Overføre bøtter til en plast badekar eller vekst kammer under konstant forhold med 28 ° C og 75-85% RH (på en 12 h dag/12 h natt syklus anbefales).
- Registrere antall døde/ikke-responsive mygg på 0,5, 1, 1.5, 2, 24, 48 og 72 h (eller alternative tidspunkt som ønsket) med poengsummen ark (Tabell 4).
- På den tredje dagen innlegget blod fôring, innføre et egg-kopp i buret og samle egg løpet 72 h. Telle antall egg produseres per behandling under dissecting mikroskop.
- Beregn prosent dødelighet og fruktbarhet som en funksjon av antall matet mygg for hver behandling gruppen og kontrollen. Korrigere kontroll dødelighet bruker den endrede Abbotts formelen hvis ønskelig.
- Vise giftighet og fruktbarhet data som en histogrammet tomten eller eksponentiell kurve (hvis utfører en dose svar analysen) ved hjelp av programvaren til valg. Hvis utfører en dose svar analysen, beregne LD50, LD75 eller LD90 verdi for testen kjemien i forhold til kontrollen.
- Gjenta analysen minst to ganger bruke separate grupper med mygg for å få n = 3 eller mer biologiske gjentak.
Representative Results
Figur 6 viser prosent dødeligheten blant L3 Ae. aegypti etter eksponering for fem doser av dopamin reseptor antagonist, amitriptyline i forhold til vannet bare (negativ) kontroll på 24, 48 og 72 h. I dette eksemplet data som samles inn på hver av tidspunkt viser en typisk logaritmisk kurve og avsløre en doseavhengig effekten av amitriptyline på larver dødelighet. LC50 verdien reduseres over tid selvfølgelig eksperimentet og kan beregnes ved hjelp av 72 h data (dvs. midtpunktet av logaritmisk kurven).
Figur 7 viser prosent dødeligheten blant 3 - 5 dager gamle voksne hunner Ae. aegypti etter eksponering for en 400 µM dose (10 µg/µL) av dopamin reseptor antagonist, amitriptyline og i forhold til syntetiske pyrethroid, bifenthrin-positive kontroll (teknisk karakter, 500 pg/µL), aceton-bare negativ kontroll og ubehandlet mygg (tomt). I dette eksemplet forårsake både amitriptyline og bifenthrin betydelige voksen dødelighet i forhold til kontrollen negative. Merk at voksen dødelighet reduseres over tid, antagelig på grunn av metabolske avgiftning av testen kjemikalier.
Figur 8 viser prosent dødeligheten (venstre y-aksen) på 3-5 dagers gammel voksen kvinne Ae. aegypti matet en blod måltid behandlet med en av fire doser av dopamin reseptor antagonist, amitriptyline og på fruktbarhet (høyre y-aksen, gjennomsnittlig egg teller / kvinnelige) for første gonotrophic syklus innlegget eksponering i forhold til kontrollen mygg (blod-matet bare, negativ kontroll). Dataene avslører at det er ingen signifikant effekt av amitriptyline på voksen dødelighet i forhold til kontrollen men demonstrere at amitriptyline øker fruktbarhet på høyeste dose (400 µM).
Figur 1 . Oppsett av larver dose svar analysen. Bildet viser av larver dose svar analysen utført ved hjelp av Aedes aegypti L3 larver i 24-vel plate.
Figur 2 . Skjematisk vises fremgangsmåten for settet av (A) enkelt dose eller (B) dose svar larver analysen i 24-vel plate. Etter overføring av fem L3 Larvene brønner, overskytende vann er forsiktig fjernet via pipette og erstattet med friske, sterile ddH2O. Deretter er lager og føljetong fortynninger av testen kjemi utarbeidet og lagt til et endelig antall 1 mL/godt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Kultur av voksen mygg. Bildet viser 20 L plast bøtte brukes for kultur av voksen mygg og bruk av en aspirator til å fjerne mygg.
Figur 4 . Voksen aktuell analysen utført ved hjelp av 4-5 dag gammel kvinne Aedes aegypti. Følgende behandling med kjemi eller løsemiddel, voksen mygg er plassert i papir kopper og overført til en testkammer for varigheten av analysen.
Figur 5 . Lager og føljetong fortynninger. Skjematisk diagram viser fremgangsmåten for utarbeidelse av (A) lager og (B) føljetong test løsninger for voksen aktuell analysen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 . Representant data fra en larver kontakt dose svar analysen. Representant data fra larver kontakt dose svar analysen viser prosent dødelighet av Aedes aegypti L3 Larvene etter eksponering for dopamin reseptor antagonist, amitriptyline på 24, 48 og 72 h. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittet i µM ± SEM. Data representerer n = 3 biologiske gjentak.
Figur 7 . Representant data fra en voksen dose av aktuelle svar analysen. Representant data fra en voksen dose av aktuelle svar analysen viser giftigheten av dopamin reseptor antagonist, amitriptyline (10 µg/µL) 3-5 dag gamle kvinnelige Aedes aegypti i forhold til syntetiske pyrethroid, bifenthrin (500 pg/µL) positive kontroll) og negative kontroll (bare aceton vehicle) 2, 24 og 48 h. Dataene representerer n = 3 biologiske gjentak. Feilfelt viser SEM.
Figur 8 . Representant data fra voksen inntak analysen. Representant data fra voksen inntak analysen viser toksisitet av dopamin reseptor antagonist, amitriptyline på 100 µM, 200 µM og 400 µM dose til 3-5 dagers gammel voksen kvinnelig Aedes aegypti og innvirkning på fruktbarhet (uttrykt som den gjennomsnittlige totale egg telle hver kvinnelige over første gonotrophic syklus). Dataene representerer n = 3 biologiske gjentak ± SEM.
| A. enkelt dose analyser med tre kjemikalier | |||||
| Kjemi | Konsentrasjon (400 uM) | ||||
| Amitriptyline | 80 mM lager: 2 mg amitriptyline X 98% (renhet pulver) X 0,001 g / 1 mg X 1 mol /313.86 g X 1 L/0,08 mol X 106 µL/L = 78.06 µL av vann. | ||||
| Føljetong fortynninger: Fortynne lager 1:2 med ddH2O og deretter 1:4 å oppnå 10 mM. Legge til 40 µL av 10 mM lager også inneholder 960 µL ddH20 å oppnå en siste konsentrasjon av 400 µM/godt. Klargjør fortsettelsene fortynninger av 10 mM lager 1:2 5 mM, 2,5, 1,25 mM og 0.625 mM aksjer. | |||||
| CIS-(z)-flupenthixol | 80 mM lager: 2 mg av cis (z) flupenthixol X 98% (renhet pulver) X 0,001 g / 1 mg X 1 mol/507.44 g cis (z) flupenthixol X 1 L/0.08 mol X 106 µL/L = 48.28 µL av vann. | ||||
| Føljetong fortynninger: Som ovenfor. | |||||
| Amitraz | 80 mM lager: 2 mg Amitraz X 0,001 g / 1 mg X 1 mol/293.4 g amitraz X 1 L/0.08 mol X 106 µL/1 L = 85.21 µL av DMSO (Merk: Amitraz er bare løselig i DMSO). | ||||
| Føljetong fortynninger: Som ovenfor. | |||||
| B. Dose svar analysen | |||||
| Kjemi | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 |
| 400 ΜM | JEKTET 200 ΜM BAKOVER | 100 ΜM | 50 ΜM | 25 ΜM | |
| f.eks Amitriptyline, cis-(Z)-flupenthixol eller amitraz | 40 ΜL | 40 ΜL | 40 ΜL | 40 ΜL | 40 ΜL |
| 10 mM lager | 5 mM lager | 2,5 lager | 1,25 mM lager | 0.625 mM lager | |
Tabell 1. Eksempel beregninger for Aedes aegypti larver L3 (A) enkelt punkt dose analysen og (B) dose svar analysen.
Tabell 2. Eksempel poengsummen ark brukes til å registrere data fra mygg larver dose svar analysen. Kontroll, vann-bare eller vann med 1% DMSO eller noe annet løsemiddel bare. Typisk doser brukes til å teste lite molekyl antagonist kjemikalier som amitriptyline er 25 µM, 50 µM, 100 µM, 200 µM og 400 µM.
| Mygg voksen (3-5 dag gamle) aktuell analysen | ||||||
| Dato startet: | ||||||
| Etterforsker: | ||||||
| Arten/varianten: | ||||||
| Analysen Type: Enkelt dose/dose svar | ||||||
| A. dødelighet (nr. død mygg) | ||||||
| (Time) | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 | Kontroll |
| 0,5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
| B. prosent dødelighet | ||||||
| (Time) | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 | Kontroll |
| 0,5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
Tabell 3. Eksempel poengsummen ark brukes til å registrere data fra voksen dose av aktuelle svar analysen.
| Mygg voksen (3-5 dag gamle) inntak analysen | ||||||
| Dato startet: | ||||||
| Etterforsker: | ||||||
| Arten/varianten: | ||||||
| Analysen Type: Enkelt dose/dose svar | ||||||
| A. antall matet mygg | ||||||
| Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 | Kontroll | |
| Matet | ||||||
| Ikke Fed | ||||||
| Totalt | ||||||
| % Fed | ||||||
| % Ikke Fed | ||||||
| B. dødelighet (nr. død mygg) | ||||||
| (Time) | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 | Kontroll |
| 2 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
| C. prosent dødelighet | ||||||
| (Time) | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 | Kontroll |
| 2 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
Tabell 4. Eksempel poengsummen ark brukes til å registrere data fra voksen blodet-fôring analysen. Typisk doser brukes til å teste lite molekyl antagonist kjemikalier som amitriptyline er 50 µM, 100 µM, 200 µM og 400 µM.
Discussion
Insektmidler er kraftige verktøy for å bekjempe mygg-sykdommer som malaria25, dengue og Zika26. Omfattende insektmiddel bruk har produsert mygg populasjoner som er resistente mot kjemiske kontroll, fører til utvikling av insektmiddel motstand, som regnes som den eneste største trusselen mot fortsatte sykdomskontroll. Det siste tiåret har sett en dramatisk økning i populasjoner av Anopheles spp. motstandsdyktig mot syntetiske pyrethroids (SP) brukes i seng garn i Afrika7. Bestander av Aedes albopictus, en vektor av dengue og Zika, har blitt rapportert i Florida og New Jersey som er resistente mot organophosphates6. Tilsvarende er DDT og pyrethroids dokumentert i populasjoner av Anopheles og Aedes spp. i Colombia27,28. Det er presserende behov for å utvikle nye larvicides og adulticides som binder seg til ulike orthosteric eller allosteric nettsteder kjent molekylære mål eller at forstyrre nye mål (dvs. romanen MoA kjemikalier)29,30 og har minimal miljøpåvirkning. Det er også økende anerkjennelse av potensialet rundt endectocides for mygg kontroll31,32,33.
For å lette den raske utviklingen av slike produkter, beskriver vi en rekke protokollene designet vurdere toksisitet av små molekyl kjemikalier mygg larver og voksne via to levering ruter - kontakt og svelging. Protokoller som WHO mottakelighet testen og CDC flaske analysen er i vanlig bruk for å vurdere giftighet og repellency av eksisterende insecticidal formuleringer1,2. Men disse analyser har begrensninger for analyser av unformulated roman kjemiske enheter (NCEs) og er ikke mottakelig for testing store mengder kjemikalier i moderat eller høy gjennomstrømming.
Her beskriver vi en standard larver analysen for å raskt vurdere NCEs enkelt dose som kan skalere for høy gjennomstrømning analyser. Vi beskriver også en tilpasning av analysen utviklet av LITE21 evaluere kontakt toksisitet av små molekyl kjemikalier til voksen mygg. Endelig vi beskrive en inntak analyse for å vurdere toksisitet av NCEs levert via blod måltid til voksne kvinnelige mygg og utforske endectocide potensielle. Disse larver og voksne analyser kan gjennomføres på en rekke doser for å bestemme LC og LD verdiene, henholdsvis, og både larver og voksne kontakt analyser kan utføres i forhold til én eller flere eksisterende kjemiske formuleringer. Voksen aktuell analysen kan også beregningen av LD verdier per personlige mygg. Protokollene utføres med arter Aedes, Anopheles og Culex16,29 og kan endres for å tilpasses bestemte biologiske egenskapene til Art, om ønskelig. I vår erfaring, mosquitocidal kjemikalier viser vanligvis bred aktivitet over disse tre slekter16,29, men det er verdi til vurdering av arter selektivitet.
Analyser er utgangspunkt til raskt skjermen flere kjemikalier for insecticidal aktivitet. Disse kjemikalier som viser toksisitet i én eller flere analyser kan velges for videre analyser via sekundære og tertiære analyser. Eksempler er LITE tarsal analysen og sukker fôring analyser34,35. Valg av flere analyser bestemmes vanligvis av betraktninger rundt forventede markedet og program resultater gir innsikt til leveringsmodiene som mulig produkt. Representant treff vises her, utforske vi toksisitet av amitriptyline, en antagonist av pattedyr og invertebrate dopamin-reseptorer som er evaluert for potensial som en roman MoA insektmiddel10,12, 13 , 16. amitriptyline utstilt toksisitet for larver og voksne i Ae. aegytpi i μg området antyder larvicidal adulticidal aktivitet og gir begrunnelsen for utforskning av en amitriptyline-baserte kjemiske serie å identifisere analoger med høy styrke. Ingen signifikant effekt på dødelighet eller fruktbarhet ble observert i Ae. aegypti utsatt for amitriptyline blod måltid. Mens stabiliteten i kjemien i defibrinated blod og effektive dose mottatt per mygg ikke er kjent, kjente begrensninger av analysen, dataene foreslår at amitriptyline og andre GPCR-aktive forbindelser kan ha lite potensial som endectocides, på minst i unformulated tilstand.
Forholdsregler for å begrense biologisk variasjon mellom analyser er avgjørende. Alle analyser bør utføres under standard betingelser for temperatur og fuktighet, fortrinnsvis i et insekt vekst kammer, for å sikre reproduserbarhet. Det er viktig å standardisere prosedyrer for scoring fenotypiske end-meningene som disse kan være svært subjektive, fører til betydelig variasjon i data registrert av ulike laboratoriepersonell. Larver analysen er best egnet til evaluering av kjemikalier som er løselig i vann, selv om analysen utføres med organiske løsemidler som DMSO forutsatt at endelig konsentrasjonen er mindre enn 1% per brønn. Vi gjenkjenner flere begrensninger voksen aktuell analysen. Først må arbeide raskt når du klargjør fortsettelsene fortynninger og levere doser som transportøren (aceton) er svært ustabilt og fordampning kan gi variasjoner i kjemi levert. Andre bør forsiktighet utvises begrense perioden bedøvelse som dette kan bidra til dødelighet. Det bør også bemerkes at løsemidler som aceton kan produsere en rask "slå ned" effekt i første flere timer av aktuell analysen, som ikke må forveksles med effekter på grunn av testen kjemi. Vi registrerer at volumet av mygg blod måltid varierer mellom individer, kompliserer en vurdering av dosen mottatt per voksen i voksen inntak analysen. Til slutt, analysen data bør ikke vurderes i tilfeller der dødeligheten i kontrollen negative overstiger 10%.
Produkter som fungerer synergi blir stadig mer anerkjent for sitt potensial til å utvide nytten av eksisterende produkter og gi kontroll av insektmiddel motstandsdyktig pest bestander15,16,36. Larver analyser har blitt brukt til å undersøke synergism mellom formamidine plantevernmidler, amitraz og en rekke kjemikalier som forstyrrer virvelløse octopamine reseptorer14,15. Larver analysen og voksen aktuell analysen beskrevet er egnet for å vurdere synergistisk eller additiv effekter mellom kombinasjoner av testen kjemikalier. Vi konstaterer at synergists som piperonyl butoxide (PBO) kan bli innlemmet i hver av de tre analyser beskrevet her.
De ovenfor beskrevet analyser gir en standardisert eksperimentelle serie for evaluering av unformulated, små molekyl narkotika mot akvatiske og bakkenett mygg livsstadier. Disse analyser er spesielt designet for å vurdere toksisitet og tilby flere fordeler sammenlignet med eksisterende søk i vanlig bruk. Viktigere, analyser er mottakelig for automatisering og kan utføres på industriell skala aktivere evaluering av test forbindelser. Til slutt, som feltet vurderer utviklingen av produkter som fungerer via nye MoAs, inkludert via forstyrrelse av romanen molekylære mål og biokjemiske stier, vil det være viktig å score flere fenotypiske endepunkt i tillegg til de som dødelighet og lammelse. De ovenfor analyser tillater slike undersøkelser, gir et skritt mot morgendagens svært nyskapende insecticidal teknologier.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne takker H. Ranson, Liverpool School of Tropical Medicine for hjelp med analysen utvikling og levering av LITE-protokollen, og M. Scharf, Purdue University for råd om analysen design.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insecticide susceptible mosquito strains | Malaria Research and Reagent Reference Repository | https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Recommended strains: Aedes aegypti Liverpool (LVP) strain, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) strain and Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) strain | |
| Acetone | Mallinckrodt Chemical | CAS 67-64-1 | Use for dilutions and control |
| Amitraz | Sigma-Aldrich | CAS 33089-61-1 | Requires dilution in DMSO |
| Amitriptyline | Sigma-Aldrich | CAS: 549-18-8 | Can be diluted in acetone |
| Bifenthrin | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Synthetic pyrethorid used as positive control |
| Cis-(Z)-flupenthixol | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Pharmacologically tested as disruptor of dop-like receptors |
| Defibrinated rabbit blood | Hemostat | DRB0100 | Blood source for adapted mosquitoes to artificial feeding |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | MKBF2985 | Organic solvent used to disolve amitraz |
| Hemotek membrane feeding system | Hemotek Ltd | Serial no. 1303 | Used for feeding mosquitoes |
| Micro-applicator | Burkard Manufacturing Co. | - | Tool needed for topical application experiments |
| 24-well cell culture plate with lid | Corning Incorporated | 3526 | - |
| Advantage rubber bands | Alliance Rubber Co. | - | Used to seal the paper cups |
| Glass syringe (1 ml) | Becton Dickinson and Co. | 512004 | Needed for the micro-applications. Glass is better than plastic |
| Disposable scintillation vials (20 ml) | Fisher Scientific | 74505-20 | Glass vials prevent evaporation |
| Tulle fabric, white | Walmart | - | - |
| Paper cups | Dixie Consumer Products LLC. | PF15675/13D | Used to keep adult mosquitoes in adult topical assays |
| Petri dishes (150 mm) | Corning Life Sciences | - | Used to maintain the mosquitoes "slept" on cold without direct contact with ice |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | Used to sort larvae |
| Stereo microscope | Olympus | SZ6045 | Used to score larval assays and perform micro-applications |
| Tweezers (fine) | Fontax | - | Used to handle adult mosquitoes |
References
- World Health Organization. A global brief on vector-borne diseases. , Available from: www.who.int/about/Licensing/copyright_form/en (2014).
- World Health Organization. Vector-borne diseases. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs387/en (2016).
- World Health Organization. Report by the Secretariat. Neglected tropical diseases; Prevention, control, elimination and eradication. , Available from: http://www.who.int/neglected_diseases/A66_20_Eng.pdf (2013).
- Tolle, M. A., et al.
- Chen, C. D., et al. Dengue vectors surveillance in endemic areas in kuala lumpur city centre and selangor state, malaysia. Dengue Bulletin. 30, (2006).
- Marcombe, S., et al. Insecticide resistance status of united states populations of Aedes albopictus and mechanisms involved. PLoS ONE. 9 (7), e101992 (2014).
- Ranson, H., et al. Pyrethroid resistance in African anopheline mosquitoes: what are the implications for malaria control? Trends in Parasitology. , 1-8 (2010).
- Hemingway, J., Ranson, H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease. Annual Review of Entomology. 45, 371-391 (2000).
- Hemingway, J., Beaty, B. J., Rowland, M., Scott, T. W., Sharp, B. L. The Innovative Vector Control Consortium: improved control of mosquito-borne diseases. Trends in Parasitology. 22 (7), 308-312 (2006).
- Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: Pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D 1-like dopamine receptors. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6 (1), e1478 (2012).
- World Health Organization. Instructions for determining the susceptibility or resistance of mosquito larvae to insecticides. , Available from: http://apps.who.int/iris/handle/10665/69615 (1981).
- Hill, C. A., et al. Re-invigorating the insecticide discovery pipeline for vector control: GPCRs as targets for the identification of next gen insecticides. Pestide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 141-148 (2013).
- Conley, J. M., et al. Evaluation of AaDOP2 Receptor antagonists reveals antidepressants and antipsychotics as novel lead molecules for control of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeautics. 352 (1), 53-60 (2015).
- Ahmed, M. A. I., Matsumura, F. Synergistic actions of formamidine insecticides on the activity of pyrethroids and neonicotinoids against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 49 (6), 1405-1410 (2012).
- Ahmed, M. A. I., Vogel, C. F. A. Synergistic action of octopamine receptor agonists on the activity of selected novel insecticides for control of dengue vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) mosquito. Pesticide Biochemistry and Physiology. 120, 51-56 (2015).
- Hill, C. A., et al. Comparative pharmacological characterization of D1-like dopamine receptors from Anopheles gambiae, Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus suggests pleiotropic signaling in mosquito vector lineages. Parasites Vectors. 9 (1), 192 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for evaluating insecticide resistance in vectors using the CDC bottle bioassay. , Available from: https://www.cdc.gov/malaria/resources/pdf/fsp/ir_manual/ir_cdc_bioassay_en.pdf (2011).
- World Health Organization. Test procedures for insecticide resistance monitoring in malaria vector mosquitoes. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/250677/1/9789241511575-eng.pdf (2013).
- Geneva: World Health Organization. Guidelines for efficacy testing of insecticides for indoor and outdoor ground-applied space spray applications control of neglected tropical diseases who pesticide evaluation scheme. , Available from: http://www.who.int/iris/handle/10665/70070 2-53 (2009).
- Pridgeon, J. W., et al. Susceptibility of Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus Say, and Anopheles quadrimaculatus Say to 19 pesticides with different modes of action. Journal of Medical Entomolog. 45 (1), 82-87 (2008).
- Liverpool Insect Testing Establishment. , Available from: http://www.lite-testing-facility.com (2018).
- Aïzoun, N., et al. Comparison of the standard WHO susceptibility tests and the CDC bottle bioassay for the determination of insecticide susceptibility in malaria vectors and their correlation with biochemical and molecular biology assays in Benin, West Africa. Parasites Vectors. 6, 147 (2013).
- Owusu, H. F., Jančáryová, D., Malone, D., Müller, P. Comparability between insecticide resistance bioassays for mosquito vectors: time to review current methodology? Parasites Vectors. 8, 357 (2015).
- Savignac, R., Maire, A. A simple character for recognizing second and third instar larvae of five Canadian mosquito genera (Diptera: Culicidae). , (1981).
- Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. eLife. 4, 174 (2015).
- Zaim, M., et al. Alternative insecticides: an urgent need. Trends in Parasitology. 18 (4), 161-163 (2002).
- Fonseca, I., Quinoñes, M. L. Resistencia a insecticidas en mosquitos (Diptera: Culicidae): mecanismos, deteccion y vigilancia en salud publica. Revista Colombiana de Entomologia. 31 (2), 107-115 (2005).
- Fonseca-Gon Alez, I., Qu, M. L., Lenhart, A., Brogdon, W. G. Insecticide resistance status of Aedes aegypti (L.) from Colombia. Pest Management Science. 67, 430-437 (2011).
- Nuss, A. B., et al. Dopamine receptor antagonists as new mode-of-action insecticide leads for control of Aedes and Culex mosquito vectors. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 1-19 (2015).
- Shidrawi, G. R. A WHO Global Programme for monitoring vector resistance to pesticides. Bulletin of the World Health Organization. 68 (4), 403 (1990).
- Sylla, M., Kobylinski, K. C., Foy, B. D. Gates grand challenges explorations award: endectocides for controlling transmission of mosquito-borne diseases. Malariaworld Journal. 4 (5), (2013).
- Foy, B. D., Kobylinski, K. C., da Silva, I. M., Rasgon, J. L., Sylla, M.
- Chaccour, C. J., et al. Ivermectin to reduce malaria transmission: a research agenda for a promising new tool for elimination. Malaria Journal. 12 (1), 153 (2013).
- Olson, D. M., Fadamiro, H., Lundgren, J. G., Heimpel, E. Effects of sugar feeding on carbohydrate and lipid metabolism in a parasitoid wasp. Physiol Entomol. 25, 17-26 (2000).
- World Health Organization. Report of the WHO Informal Consultation. Evaluation and testing of insecticides. , Available from: http://www.who.int/whopes/resources/ctd_whopes_ic_96.1/en/ (1996).
- Huang, Q., Deng, Y., Zhan, T., He, Y. Synergistic and antagonistic effects of piperonyl butoxide in fipronil-susceptible and resistant rice stem borrers, Chilo suppressalis. Journal of Insect Science. 10, 182 (2010).
