Summary
פרוטוקולים מתוארים להערכת הרעילות של בדיקות, הביוכימיה כדי יתושים ילדותית, למבוגרים לפיתוח כמו שיעורים חדשים של larvicides, adulticides ו- endectocides. הפרוטוקולים מאפשרים תפוקה גבוהה בדיקה של מספר בדיקות, הביוכימיה ב נקודה אחת במינון והערכה עוקבות באמצעות מנה assay התגובה לקביעת רעילות במגע או באמצעות בליעה.
Abstract
שיעורים חדשים של קוטלי חרקים עם הרומן דרכי פעולה נדרשים לשלוט אוכלוסיות חרקים עמידים יתושים המעבירים מחלות כגון Zika, קדחת דנגה ומלריה. מבחני עבור מהירה, ניתוחים תפוקה גבוהה של unformulated בדיקות, הרומן הביוכימיה נגד יתושים הזחלים ומבוגרים מוצגים. אנו מתארים פרוטוקולים במינון נקודה אחת, מנה מבחני התגובה להערכת הרעילות של בדיקות, הביוכימיה מולקולה קטנה כדי הווקטור Aedes aegypti של Zika, דנגי, קדחת צהובה, הווקטור מלריה, אנופלס gambiae הצפונית הבית נגד יתושים, כולכית quinquefasciatus, על קשר, דרך בליעה. לדוגמה, אנו מוערכים הרעילות של amitriptyline, אנטגוניסט מולקולה קטנה של G-חלבון בשילוב קולטנים, באמצעות זחל, למבוגרים אקטואלי ובעל למבוגרים מדם וזמינותו. הפרוטוקולים לספק נקודת התחלה לחקור בקוטלי חרקים פוטנציאליים. תוצאות נידונות בהקשר של ניסויים נוספים כדי לחקור מנגנונים למסירה ויישומים של המוצר.
Introduction
היתושים לשדר את הסוכנים סיבתי של מחלות זיהומיות שמשפיעים על בריאות האדם באופן כללי1. שלושה סוגים יתושים החשוב ביותר המשפיעים על בריאות האדם הן אאדס, אנופלס, כולכית. מינים של יתושים אאדס וקטור arboviruses הגורמות Zika, דנגי, קדחת צהובה, chikungunya. אנופלס מינים וקטור טפילי מלריה ולשדר כולכית מינים וירוס הנילוס המערבי ונמטודות filarial2. ארגון הבריאות העולמי (WHO) נקרא למיגור של עשר מוזנח טרופי מחלות (NTD) על ידי 20203 , מזוהה הדברת יתושים כמו האסטרטגיה הכי ברת קיימא. קוטלי חרקים הינם כלים רבי-עוצמה כדי לשלוט יתושים ולהפחית את המחלה שידור4,5. עם זאת, הופעתה של אוכלוסיות חרקים עמידים יתושים מאיימת על המשך השליטה של מחלות רבות6,7,8. וקטור חדשני שליטה Consortium (IVCC) השיקה את המאמץ ייעודי הראשונה לפתח תחליף קוטלי חרקים יתושים שליטה9. הדברה חדשים עם הרומן דרכי פעולה (מואה) יש צורך לפגוש את מי מטרות ולהשיג שליטה במחלה. בגילוי ופיתוח של מחלקות חדשות בקוטלי חרקים עם הרומן MoAs לדרוש מבחני מהאורגניזם לניתוח מהיר, תפוקה גבוהה של בדיקות, הביוכימיה, לעומת תקני התעשייה10.
מבחני מרובים זמינים להעריך את repellency ואת רעילות חומרי הדברה כדי זחלים של יתושים בוגרים, וחלקם מתאימים על ההערכה של הרומן ניסח או unformulated בדיקות, הביוכימיה. פרוטוקול11 מי הוא וזמינותו קשר משמש לבדיקת מוצרים נגד הזחלים לחלל הרביעי. מחקרים שפורסמו גם לתאר את מגוון של מבחני דרגות זחל משמש לבדיקת הרעילות של בדיקות, הביוכימיה מולקולה קטנה כדי הזחלים Aedes aegypti, אנופלס gambiae , כולכית quinquefasciatus10,12, 13,14,15,16. המרכז לבקרת bioassay בקבוק ובקרה מחלות ומניעתן (CDC) משמשת להערכת עמידות חרקים שדה תפסו אוכלוסיות של יתושים בוגרים באמצעות הערכה של ריכוז קטלני (LC) וזמן קטלני (LT) לעומת תקן אבחון מנה של חרקים מסחרי17. מי רגישות המבחן מציע גישה אחרת להערכת עמידות חרקים יתושים בוגרים לפיה יתושים נחשפים נייר ספוג בקוטלי חרקים בתוך זכוכית vials 1 h ואת התמותה מוערך ב 24 שעות18. מבחני אחרים תרסיס ניסוחים בתוך כלובים אטום ואת היתושים הרשומה נוקאאוט מוות הרצוי timepoints19. יישום מקומי לבית החזה יתושים שימש כדי להעריך את העוצמה של חומרי הדברה שונים20. הקמת בדיקות חרק ליברפול (לייט)21 מעסיקה נהליכדי להעריך את bioactivity של בדיקות, הביוכימיה כדי היתושים הבוגרים. וזמינותו אקטואלי בוגרים לייט חלה נפח קטן של בדיקת המוצר על בית החזה של יתושים בוגרים עם התמותה הבקיע ב 48 שעות. וזמינותו מאפשר כימות של המינון שהתקבלו לפי יתושים בודדים21. וזמינותו tarsal LITE מוערך הרעילות של בדיקת המוצר היתושים הבוגרים נח על משטח שטופל והוא משמש לזיהוי בדיקות, הביוכימיה עם פוטנציאל לפיתוח כמו תרסיסים מקורה שיורית (IRS) או להשתמש במטופלים בקוטלי חרקים יתושים (ITNs) כדי לשלוט יתושים אנופלס .
אשר מבחני לבקרת מחלות יש מגבלות עבור בדיקות בדיקות הרומן, unformulated, הביוכימיה, ואת המטרה של bioassay בקבוק ה-CDC הוא הערכה של רגישות על פני תקופות assay קצר (שעתיים) ולא רעילות22,23. בנוסף, מבחני להערכת הרעילות של בדיקות, הביוכימיה יועבר. בתוך הסעודה דם, פוטנציאל פיתוח של מוצרים מערכתית אקטינג חסרים (קרי: endectocides). כאן, אנו מתארים את מבחני בדיקה את הפעילות mosquitocidal של בדיקות, הביוכימיה חדשניים שאינם מסיסים במים או לאחד מספר ממיסים אורגניים נגד הזחלים ומבוגרים אאדס, אנופלס , כולכית. ראשית, נדגים וזמינותו זחל בעבר שתואר על ידי שלנו קבוצה10,12,13,16, והופיע פה כמו (1) מנה מסך להעריך במהירות מספר בדיקות, הביוכימיה בנקודה אחת, וכן (2) assay תגובת המינון כדי לקבוע ריכוז קטלני (למשל, LC50, LC75 או LC90) של הכימיה יחיד. בשלב הבא, אנו מתארים שני מבחני למבוגרים לקביעת מנה קטלנית (LD). הראשון מביניהם הוא עיבוד של פרוטוקול LITE לבדיקת למריחה, הרומן בדיקות, הביוכימיה נגד יתושים בוגרים לעומת פקד חיובי. השני הוא assay האכלה על ההערכה של בדיקות, הביוכימיה מועברת מערכתית באמצעות ארוחת דם.
Protocol
הערה: כל זני, ריאגנטים הנדרש עבור העבודה המתוארות הפרוטוקולים הבאים, ספקים המפורטים בטבלה של חומרים.
1. תרבות של יתוש הזחלים ומבוגרים
הערה: חרקים זנים רגישים של יתושים זמינות מתוך מאגר הפניה ריאגנט ומחקר מלריה. מומלץ זנים הם כדלקמן: Aedes aegypti ליברפול (להעברת) זן, אנופלס gambiae זן: קיסומו בקניה (KISUMU1), quinquefasciatus כולכית יוהנסבורג (יוהנסבורג) זן.
- מחזור התרבות יתוש הזחלים מביצים בליל 12 שעות ביום/12 h ב- 28 ° C ו 75-85% לחות יחסית (RH) במגשי פלסטיק 25 ס"מ על 40 ס"מ (~ 400 הזחלים למגש) כפי שתואר על ידי Nuss,29. להאכיל את הזחלים גרביל הקרקע (aegypti א ו- An. gambiae) או מזון לדגים פתית (quinquefasciatus ג). עבור מבחני דרגות זחל, לאסוף את הזחלים בשלב השלישי זחל (L3) לחלל.
- אחורי היתושים הבוגרים מן הגלמים זה הועברו כוסות פלסטיק, מקום בתוך 20 L ארגזים מפלסטיק insectary בתנאים שתוארו לעיל. לשמור על יתושים על פתרון 20% סוכר כמתואר29. לאסוף מבוגרים-הופעתה פוסט 3-5 ימים.
2. זחל Assay קשר (מינון נקודה בודדת או מינון תגובה Assay)
הערה: וזמינותו יכול להתבצע עם בדיקות, הביוכימיה שאינם מסיסים במים או דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), ובלבד הריכוז הסופי של דימתיל סולפוקסיד בבארות הבדיקה לא יעלה על 1%. ממיסים חלופיות עשויה להיות אופציה, אבל זה חיוני לאשר הראשונה כי הריכוז הסופי אינו גורם יותר מ- 10% תמותה-72 h פוסט החשיפה. ניתן לבצע את הבדיקה בנקודה אחת במינון או מינון תגובה וזמינותו. אם ביצוע האחרון, מומלץ לבחון את מגוון של ריכוזי (מינימום של חמישה), פורש את ה LC הצפוי50.
- תווית הבארות של צלחת 24-ובכן ברור רקמות כמוצג באיור1.
- להכין פתרון מניות של הכימיה מבחן צינור 1.5 מ.
- שוקל כל כימיה באמצעות איזון האנליטי, וכן בהתאם למאפייני מסיסות, להשעות מחדש ב- ddH סטרילי2O, דימתיל סולפוקסיד או אחרים ממס אורגני מתאים של בחירה (ראה איור 2).
הערה: חישובים צריך לקחת בחשבון את הטוהר של הכימיה. לדוגמה, עבור כימיה זה 99% טהורים, להמיס mg 10.1 ב- 1,000 µL של אצטון להשגת פתרון 1%. חותם עם הסרט פרפין ולאחסן ב-20 ° C.
- שוקל כל כימיה באמצעות איזון האנליטי, וכן בהתאם למאפייני מסיסות, להשעות מחדש ב- ddH סטרילי2O, דימתיל סולפוקסיד או אחרים ממס אורגני מתאים של בחירה (ראה איור 2).
- לקבוע את הריכוז הסופי של הכימיה מבחן זה יוערך ולהכין דילולים טורי מהפתרון מניות בהתאם, באמצעות הממיס המתאים.
הערה: ריכוז ונפח של כימיה, הממס ניתן לחשב באמצעות הנוסחה C1* V1= C2* V2 איפה C1= ריכוז מדגם 1, C2= ריכוז מדגם 2, V1= נפח של דוגמה 1 ו- V2= נפח דגימה 2. ראה את החישובים בדוגמה המוצגת באיור 2 , טבלה 1.- להכין פתרון מניות 10 מ מ דילולים טורי ככל הנדרש כדי להשיג ריכוזי המבחן הרצוי (טבלה 1B).
- באמצעות פיפטה של העברת פלסטיק רחב נשא, להעביר את הזחלים L3 חמש הטוב של צלחת בדיקת תרביות רקמה; L3 הזחלים ניתן לזהות על ידי אורך (~ 2.5-3.5 ממ) ואת הראש קפסולת רוחב ~ 0.025 mm24. בעדינות להסיר את המים עם פיפטה 1 מ"ל והחלף האחסון הרצוי של ddH2O (ראו להלן). אני חוזר כדי להשיג n = 4 משכפל טכני לכל טיפול (קרי, 20 הזחלים הכולל לכל טיפול).
- להוסיף נפח מתאים של בדיקת כימיה לכל אחת מארבע בארות שכפל בצלחת 24-ובכן הבדיקה, מערבולת בעדינות את הצלחת כדי להבטיח ערבוב אחיד של הכימיה. מקם את הצלחת בחדר הבדיקה או גידול בתנאים קבועים (למשל, 25 ° C ו ~ 75-85% לחות יחסית מומלץ, ו- h אור/12 12 שעות כהה מחזור במידת האפשר).
הערה: עבור הפארמצבטית בין ניסויים, ודא מבחני העוקבות מתבצעות תחת באותם תנאים סביבתיים. - לרשום את מספר הזחלים המלח/לא מגיב היטב כל-30 דקות, 1, 1.5, 2, 3, 24, 48, 72 שעות לאחר חשיפה (או נקודות זמן חלופי) בגיליון הציון (טבלה 2). טפח בעדינות את הצד של הצלחת. אם אין תנועה נצפית, לגעת בעדינות הזחל עם קיסם סטרילי. ציון הזחלים לא מגיבים הקשה/מגע כמו "מתים".
הערה: פנוטיפים התנהגותיים מורפולוגיים אחרים עלולים להיות שנצפו, ניתן להקליט. - תקן בקרת לתמותה באמצעות הנוסחה של אבוט ששונה במידת הצורך, כדלקמן:
התמותה (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),
איפה X = את אחוזי תמותה בשיעור של מדגם שטופלו, ו- Y = את אחוזי תמותה בשיעור של הפקד. - גרף תוצאות היסטוגרמה או עקומת לוגריתמי באמצעות תוכנה של בחירה כגון גרף-pad פריזמה 6 או דומה, לחשב את ערכי ריכוז קטלני (LC) ביחס הפקד.
- חזור על וזמינותו באמצעות אוסף נפרד של יתושים כדי להשיג n = 3 או יותר ביולוגי משכפל.
3. למבוגרים Assay אקטואלי (מינון נקודה בודדת או מינון תגובה Assay)
הערה: וזמינותו אקטואלי למבוגרים מתנהל באמצעות אצטון כמו הממס. ממיסים חלופיות עשויה להיות אופציה, אבל זה חיוני לאשר הראשונה כי הריכוז הסופי אינו גורם יותר מ- 10% התמותה ב 48 שעות פוסט החשיפה. ניתן לבצע את הבדיקה כפי יחיד הצבע במינון או מינון תגובה assay והיא משמשת כדי לקבוע מנה קטלנית (LD). אם ביצוע האחרון, מומלץ לבחון את מגוון של ריכוזי (מינימום של חמישה), פורש את הצפוי LD50.
- לקבוע את מספר הבוגרים יתושים הנשי הדרושה כדי להשלים את הבדיקה.
הערה: assay במינון נקודת בכימיה יחיד ידרוש מינימום של יתושים 90 (30 עבור הפקד חיובית, 30 עבור הפקד שלילי אצטון-בלבד ו- 30 עבור הכימיה הבדיקה). - תרבות 3 בן יום-5 הנשי יתושים בוגרים ולהעביר אל דלי פלסטיק נפרד בפטרת באמצעות סופג את הנוזלים (איור 3).
- תווית עוז 9 כוסות נייר השם ואת ריכוז של הכימיה הבדיקה. להפריש 10 ס"מ x 10 ס"מ רשת ריבועים, גומיות עבור כל גביע (ראה איור 4).
- בחר להדברת חרקים קיימים כפקד חיובית (למשל, pyrethroid סינתטי, bifenthrin) והכן פתרון מניות 1% (10 µg/µL) ב אצטון.
הערה: חישובים צריך לקחת בחשבון את הטוהר של הכימיה. לדוגמה, עבור כימיה זה 99% טהורים, להמיס mg 10.1 ב- 1,000 µL של אצטון להשגת פתרון 1%. חותם עם הסרט פרפין ולאחסן ב-20 ° C. - משתמש באותו הליך כאמור לעיל, להכין פתרון מניות של הכימיה הבדיקה.
הערה: בדיקות המבחן רבים, הביוכימיה הן מאוד יציב, פתרונות רצוי לבצעו טריים בכל פעם התכולה יוצאת מבוצעת. - להכין דילולים טורי של הפקד חיובי ולבדוק בדיקות, הביוכימיה מפתרונות מניות, כפי שמוצג באיור 5 באמצעות 20 מ ל זכוכית בקבוקונים בעבר שטפה עם אצטון.
- נקה מזרק זכוכית 1 מ"ל עם אצטון, למלא עם אצטון ולאבטח בהמיקרו-המוליך מותאם כדי לספק נפח של 0.25 µL.
- עבודה בקבוצות של עשרה, הסר 3 - 5 - בן יום יתושים למבוגרים נקבה מן הכלובים באמצעות של העצמות, עזים ומתנגד עבור עד חמש דקות ב 4 ° C במקרר או על קרח. העברה הבא, יתושים פטרי, המקום על הקרח עד 10 דקות.
- עובד מהר, להסיר נקבה יחידה עם פינצטה בסדר, חלות µL 0.25 של פתרון מבחן בית החזה הגבי באמצעות המיקרו-המוליך את המזרק. לאשר מסירת כימיה באמצעות התבוננות באמצעות מיקרוסקופ ויבתר כדי להבטיח כל יתוש מקבל נפח מתאים של בדיקת כימיה.
- להעביר את היתוש כוס נייר שכותרתו נח על קרח, וחזור תשע פעמים כדי להשיג n = 10 יתושים שטופלו. חותם את היתושים בגביע עם ריבוע רשת מאובטחת עם גומייה, העברה לתא פלסטיק או גידול בתנאים קבועה של 28 מעלות צלזיוס ו- 75-85% לחות (על 12 שעות בלילה h יום/12 מחזור עדיפה).
- חזור על הניסוי הנ ל פעמיים כדי להשיג n = משכפל טכני 3 (קרי, 30 סה כ יתושים) לכל קבוצה טיפול או פקד.
- חזור על שלבים 3.7-3.10 קודם עם הכימיה מבחן ולאחר מכן הפקד חיובי.
הערה: פקד שימושי אחר כדי לכלול אם יתושים מספקת זמינות היא "ריק" של 30 ומורדמת יתושים שאינם מקבלים מבחן בכימיה או הממס. - לרשום את מספר יתושים "המלח/לא מגיב" 30 דקות, 60 דקות, 2, 24 ו 48 שעות לאחר חשיפה (או נקודות זמן חלופי) משתמש ב'גיליון הציון (טבלה 3). ציון יתושים כהגדרתו "המלח/לא מגיב" אם הם מראים חוסר תנועה, כמו הנחת בצד אחד או על הגב, עם חוסר היכולת לעוף.
- אם רצונך בכך, לתקן לתמותה שליטה באמצעות הנוסחה של אבוט שהשתנתה כדלקמן:
התמותה (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),
איפה X = את אחוזי תמותה בשיעור של מדגם שטופלו, ו- Y = את אחוזי תמותה בשיעור של הפקד. - הצגת תוצאות היסטוגרמה או עקומה מעריכית. עבור assay התגובה מינון, חישוב LD50, LD75 או ערך90 LD הכימיה במבחן ביחס הפקד.
- חזור על וזמינותו לפחות פעמיים באמצעות קבוצות נפרדות של יתושים כדי להשיג n = 3 או יותר ביולוגי משכפל.
4. למבוגרים Assay מדם (מינון נקודה בודדת או מינון תגובה Assay)
- לאסוף כ 150 4-5-יום הישן למבוגרים נקבה יתושים, העברת לכלוב נפרד. חזור על להשיג 6 כלובים אם ביצוע וזמינותו התגובה של מנה. להסיר את המקור של סוכר 1-24 שעות לפני ההאכלה וזמינותו.
- להכין פתרון מניות של הכימיה כמתואר לעיל, והיוו הטוהר של הכימיה (פתרון מניות טיפוסי הוא 80 מ מ במים או מאגר מלח), ולהכין לאחר מכן דילולים טורי במאגר מים/כנדרש.
- להוסיף 40 µL של כל אחד דילולים µL 960 defibrinated דם ארנב כדי להשיג את הריכוז המבחן הרצוי. החל ממברנה הסרט ליחידה האכלה, חותם עם טבעת גומי. להעביר 1 מ"ל של דם באמצעות פיפטה, לצרף את יחידת הזנה יחידת חימום.
- בעדינות ספוגית הקרום על פני השטח עם טרי עשה 10% חומצה לקטית הפתרון ואת המקום יחידת הזנה לתוך הכלוב של יתושים בוגרים. לכסות את הכלוב עם בד בצבע כהה או שקית הזבל שחור ולאפשר יתושים להאכיל למשך שעה אחת.
- חזור על שלבים 4.2-4.4 עד לתום של בדיקת פתרונות והפקד שלילי (דם בלבד).
- השלמתה של האכלה, במקום דליים בגיל 4 ° C במקרר במשך 5 דקות כדי עזים ומתנגד יתושים. להסיר את היתושים זכר-fed היתושים הנשי, לספור, להקליט את המספר הכולל של האכלת והאכילה חלקית יתושים בבדיקה של הבטן.
- שומרים על היתושים הנשי מוזן באופן חלקי, באופן מלא, מכוון למינימום 50 יתושים דם-fed למנה.
- להעביר דליים תא פלסטיק או גידול בתנאים קבועה של 28 מעלות צלזיוס ו- 75-85% לחות (על 12 שעות בלילה h יום/12 מחזור עדיפה).
- להקליט את המספר הכולל של יתושים מתים/לא מגיב-0.5, 1, 1.5, 2, 24, 48, 72 h (או חלופי בזמן נקודות לפי הצורך) את הציון באמצעות גיליון (טבלה 4).
- על השלישי היום פוסט דם ההזנה, להציג את גביע של ביצה לתוך הכלוב ולאסוף ביצים על פני תקופה 72 h. לספור את מספר הביצים המיוצר לכל טיפול תחת מיקרוסקופ ויבתר.
- לחשב את אחוז התמותה ואת פוריות כפונקציה של המספר הכולל של יתושים סוכן עבור כל קבוצת הטיפול ואת הפקד. תקן לתמותה שליטה באמצעות הנוסחה של אבוט ששונה במידת הצורך.
- להציג נתונים רעילות ופוריות, היסטוגרמה מגרש או עקומה מעריכית (אם ביצוע וזמינותו התגובה של מינון) באמצעות תוכנה של בחירה. אם ביצוע וזמינותו התגובה של מינון, חישוב LD50, LD75 או ערך90 LD הכימיה במבחן ביחס הפקד.
- חזור על וזמינותו לפחות פעמיים באמצעות קבוצות נפרדות של יתושים כדי להשיג n = 3 או יותר ביולוגי משכפל.
Representative Results
איור 6 מציג את אחוזי תמותה בשיעור של L3 Ae. aegypti בעקבות חשיפה חמש מנות של דופמין אנטגוניסט, amitriptyline בהשוואה המים בלבד (שלילי) שליטה ב 24, 48, 72 h. בדוגמה זו, הנתונים שנאספו בכל הנקודות הזמן להציג עיקול לוגריתמי טיפוסי, לחשוף את תופעת למינון של amitriptyline על התמותה זחל. ערך50 LC מקטין במרוצת הזמן של הניסוי, ניתן לחשב באמצעות הנתונים 72 h (קרי, האמצע של העקומה לוגריתמי).
איור 7 מציג את אחוזי תמותה בשיעור של 3 - 5 בת הבוגרת Ae. aegypti בעקבות חשיפה מינון 400 מיקרומטר (10 µg/µL) של דופמין אנטגוניסט, amitriptyline ובהשוואה את pyrethroid סינתטי, שליטה bifenthrin-חיוביות (בדרגה טכנית; 500 pg/µL), שליטה שלילי אצטון בלבד, לא מטופל יתושים (ריק). בדוגמה זו, amitriptyline והן bifenthrin לגרום תמותה למבוגרים משמעותיים ביחס הפקד שלילי. שימו לב כי תמותת מבוגרים פוחתת עם הזמן, ככל הנראה עקב ניקוי רעלים מטבוליים של בדיקות המבחן, הביוכימיה.
איור 8 מציג אחוזי תמותה בשיעור (ציר y השמאלי) של אישה מבוגרת בת 3-5 יום Ae. aegypti האכילו ארוחת דם שטופלו אחת של ארבעה מינונים של אנטגוניסט של דופמין, amitriptyline את פוריות (ציר ה-y נכון; ביצה הממוצע ספירה / נקבה) לחשיפה הראשונה gonotrophic מחזור פוסט לעומת שליטה יתושים (דם-fed בלבד; בקרה שלילית). הנתונים חושפים כי אין שום השפעה משמעותית של amitriptyline על תמותת מבוגרים יחסית הפקד אך להדגים amitriptyline. מגביר באופן משמעותי את פוריות במינון הגבוה (400 מיקרומטר).
איור 1 . הסידור של וזמינותו תגובה מינון זחל. תמונה המציגה את הסידור של וזמינותו תגובה מינון זחל המבוצעת באמצעות רימות Aedes aegypti L3 בצלחת 24-. טוב.
איור 2 . סכמטי להופיע נוהל סט של מינון בנקודה אחת (א) או (ב) מנה תגובה assay זחל בצלחת 24-ובכן. בעקבות העברת הזחלים L3 חמש בארות, המים העודפים הוא בעדינות מוסר באמצעות פיפטה, החליף טרי, סטרילי ddH2O. הבא, מניות דילולים טורי של הכימיה הבדיקה הם מוכנים ו להוסיף נפח סופי של 1 מ"ל/טוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . תרבות של יתושים בוגרים. התמונה מראה 20 L פלסטיק דלי המשמש תרבות של יתושים בוגרים, השימוש העצמות כדי להסיר את היתושים.
איור 4 . למבוגרים assay אקטואלי מבוצעים על-ידי הנקבה בת 4-5 יום Aedes aegypti. טיפול הבאים עם כימיה או יתושים הממס, למבוגרים להציב כוסות נייר, הועברה לתא מבחן משך זמן וזמינותו.
איור 5 . מניות and דילולים טורי. תרשים סכמטי מציג את ההליך עבור הכנה של מניות (A) ופתרונות (B) מבחן טורי וזמינותו אקטואלי למבוגרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 . נציג נתונים assay התגובה הזחל במינון קשר. נציג נתונים מ תגובה מינון קשר זחל assay מציג אחוזי תמותה בשיעור של הזחלים Aedes aegypti L3 בעקבות חשיפה דופמין אנטגוניסט, amitriptyline ב 24, 48, 72 h. כל נקודת נתונים מייצג בכל מקום מיקרומטר ± n מייצגים נתונים ב- SEM. = 3 משכפל ביולוגי.
איור 7 . נציג נתונים assay התגובה מינון אקטואלי למבוגרים. נציג נתונים assay התגובה מינון אקטואלי למבוגרים מציג רעילות של דופמין אנטגוניסט, amitriptyline (10 µg/µL) ל 3-5 ימים נקבה בת Aedes aegypti יחסית pyrethroid סינתטי, bifenthrin (500 pg/µL) חיובי פקד) ושלילי שליטה (הרכב אצטון בלבד) ב 2, 24 ו 48 h. נתונים מייצגים n = 3 משכפל ביולוגי. קווי שגיאה מציינים ב- SEM.
איור 8 . נציג נתונים וזמינותו בליעה למבוגרים. נציג נתונים וזמינותו בליעה למבוגרים מציג רעילות של דופמין אנטגוניסט, amitriptyline מיקרומטר 100, 200 מיקרומטר ו 400 מיקרומטר מנה ליום 3-5 הישן למבוגרים נקבה Aedes aegypti ואת ההשפעה על פוריות (המבוטא הביצה הכולל ממוצע ספירה לכל נקבה מעל מחזור gonotrophic הראשונה). נתונים מייצגים n = ± משכפל ביולוגית 3 ב- SEM.
| א בנקודה אחת מבחני מנה עם שלוש בדיקות, הביוכימיה | |||||
| כימיה | ריכוז (400 אמ) | ||||
| Amitriptyline | 80 מ מ במלאי: 2 מ ג % 98 amitriptyline X (טוהר אבקה) X 0.001 גר' / 1 מ ג X 1 מול /313.86 g X 1 ליטר/0.08 מול X 106 µL/L = µL 78.06 של מים. | ||||
| דילולים טורי: למהול 1:2 מניות עם ddH2O ואז 1:4 על מנת להשיג 10 מ מ. להוסיף טוב המכיל µL 960 ddH20 כדי להשיג ריכוז סופי של מיקרומטר 400/טוב µL 40 מ מ 10 מניות. להכין דילולים טורי של מניות 10 מ מ 1:2 על מנת להשיג 5 מ מ, 2.5 מ"מ, 1.25 מ מ, מ מ 0.625 מניות. | |||||
| Cis-(z)-flupenthixol | 80 מ מ במלאי: 2 מ ג של חבר העמים (z) flupenthixol X 98% (טוהר אבקה) X 0.001 גר' / 1 מ ג X 1 mol/507.44 g חבר העמים (z) flupenthixol mol X 106 X 1 L/0.08 µL/L = 48.28 µL של מים. | ||||
| דילולים טורי: כמו לעיל. | |||||
| Amitraz | 80 מ מ במלאי: 2 מ ג של 0.001 גר' / 1 מ ג X 1 Amitraz X mol/293.4 גר' amitraz L/0.08 X 1 מול X 106 µL/1 L = µL 85.21 של דימתיל סולפוקסיד (הערה: Amitraz הוא רק מסיס דימתיל סולפוקסיד). | ||||
| דילולים טורי: כמו לעיל. | |||||
| B. מינון תגובה assay | |||||
| כימיה | מנה 1 | במינון 2 | מנה 3 | מנה 4 | מנה 5 |
| מיקרומטר 400 | מיקרומטר 200 | 100 מיקרומטר | 50 מיקרומטר | מיקרומטר 25 | |
| למשל, Amitriptyline, cis-(Z)-flupenthixol או amitraz | 40 ΜL | 40 ΜL | 40 ΜL | 40 ΜL | 40 ΜL |
| המניות 10 מ מ | מניות 5 מ מ | מניות 2.5 מ מ | מניות 1.25 מ מ | מ מ 0.625 מניות | |
טבלה 1. דוגמה שהחישובים Aedes aegypti L3 זחל (א) יחיד הצבע במינון assay ואת וזמינותו התגובה (ב) במינון.
בטבלה 2. גיליון הניקוד דוגמה בשימוש כדי לרשום נתונים מתוך וזמינותו תגובה מינון זחל יתוש. שליטה, מים בלבד או מים עם 1% דימתיל סולפוקסיד או ממיס אחר בלבד. מנות אופייניות שנועדה לבדוק בדיקות אנטגוניסט, מולקולה קטנה הביוכימיה כגון amitriptyline הן מיקרומטר 25, 50 מיקרומטר, 100 מיקרומטר, מיקרומטר 200, 400 מיקרומטר.
| Assay אקטואלי יתושים בוגרים (בת 3-5 יום) | ||||||
| תאריך יזם: | ||||||
| חוקרת: | ||||||
| מינים/מתח: | ||||||
| Assay סוג: תגובה מינון/מנה בנקודה אחת | ||||||
| א התמותה (מס ' יתושים מתים) | ||||||
| זמן (בשעות) | מנה 1 | במינון 2 | מנה 3 | מנה 4 | מנה 5 | שליטה |
| 0.5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
| B. אחוז התמותה | ||||||
| זמן (בשעות) | מנה 1 | במינון 2 | מנה 3 | מנה 4 | מנה 5 | שליטה |
| 0.5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
טבלה 3- גיליון הניקוד דוגמה בשימוש כדי לרשום נתונים מתוך וזמינותו התגובה למבוגרים המינון אקטואלי.
| Assay בליעה יתושים בוגרים (בת 3-5 יום) | ||||||
| תאריך יזם: | ||||||
| חוקרת: | ||||||
| מינים/מתח: | ||||||
| Assay סוג: תגובה מינון/מנה בנקודה אחת | ||||||
| א מספר האכיל יתושים | ||||||
| מנה 1 | במינון 2 | מנה 3 | מנה 4 | מנה 5 | שליטה | |
| נמאס | ||||||
| לא הפדרציה | ||||||
| סה | ||||||
| % פד | ||||||
| % לא הפדרציה | ||||||
| B. התמותה (מס ' יתושים מתים) | ||||||
| זמן (בשעות) | מנה 1 | במינון 2 | מנה 3 | מנה 4 | מנה 5 | שליטה |
| 2 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
| ג. אחוז התמותה | ||||||
| זמן (בשעות) | מנה 1 | במינון 2 | מנה 3 | מנה 4 | מנה 5 | שליטה |
| 2 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
בטבלה 4. גיליון הניקוד דוגמה בשימוש כדי לרשום נתונים מתוך וזמינותו מדם למבוגרים. מנות אופייניות שנועדה לבדוק בדיקות אנטגוניסט, מולקולה קטנה הביוכימיה כגון amitriptyline הן 50 מיקרומטר, 100 מיקרומטר, מיקרומטר 200, 400 מיקרומטר.
Discussion
קוטלי חרקים הינם כלים רבי-עוצמה כדי להילחם בעקיצות יתוש מחלות כמו מלריה25, קדחת דנגה, Zika26. השימוש בקוטלי חרקים נרחב הפיק אוכלוסיות יתוש כי הם עמידים בפני הדברה כימית, המוביל ההתפתחות של עמידות חרקים, אשר נחשב האיום הגדול ביותר יחיד על המשיכה מחלות. בעשור האחרון חלה עלייה דרמטית באוכלוסיות של אנופלס spp. עמידים בפני pyrethroids סינתטי (SPs) בשימוש יתושים ב אפריקה7. אוכלוסיות של אדס, וקטור של קדחת דנגה, Zika, דווחו ב פלורידה ו ניו ג'רזי העמידים בפני מסוג זרחנים אורגנים6. באופן דומה, התנגדות DDT ו pyrethroids תועד באוכלוסיות של spp. אנופלס , אאדס קולומביה27,28. יש צורך דחוף כדי לפתח את larvicides החדש adulticides זה לאגד orthosteric מגוונות או אתרים allosteric על מטרות מולקולריות ידוע או לשבש מטרות (קרי, בדיקות מואה הרומן, הביוכימיה) חדש29,30 ו יש השפעה סביבתית מינימלית. שם היא גם הגדלת זיהוי של הפוטנציאל סביב endectocides עבור יתושים שליטה31,32,33.
כדי להקל על ההתפתחות המהירה של מוצרים אלה, אנו מתארים סדרה של פרוטוקולים שנועדה להעריך את הרעילות של בדיקות, מולקולה קטנה הביוכימיה רימות היתוש ומבוגרים בשני נתיבים משלוח - קשר ו בליעה. פרוטוקולים כגון מי רגישות הבדיקה ואת וזמינותו בקבוק CDC הם במשותף בשימוש להערכת רעילות של repellency של ניסוחים חרקים קיימים1,2. עם זאת, מבחני אלה יש מגבלות עבור ניתוחים של ישויות כימיות רומן unformulated (nces המגוון) ואינם לבצע בדיקות מספר גדול של בדיקות, הביוכימיה תפוקה בינונית או גבוהה.
כאן נתאר assay זחל סטנדרטי להעריך במהירות nces המגוון במינון בנקודה אחת זה ניתן לשנות עבור ניתוחים תפוקה גבוהה. אנו מתארים גם של לאגדת assay שפותחה על ידי ה LITE21 להערכת רעילות קשר של בדיקות, הביוכימיה מולקולה קטנה כדי היתושים הבוגרים. לבסוף, אנו מתארים וזמינותו של בליעה להערכת רעילות nces המגוון נמסר דרך הארוחה דם יתושים נקבה בוגרת ולחקור endectocide פוטנציאליים. מבחני זחל ומבוגרים אלה יכול להתבצע על מגוון של מנות כדי לקבוע ערכי LC ו LD, בהתאמה, ניתן לבצע מבחני הקשר זחל והן למבוגרים בהשוואה ניסוחים כימיים קיים אחד או יותר. וזמינותו אקטואלי למבוגרים מאפשרת גם החישוב של LD ערכים עבור יתושים בודדים. הפרוטוקולים יכול להתבצע באמצעות מינים של16, אאדס, אנופלס , כולכית29 , יכול להיות שונה כדי להתאים את מאפייני ביולוגי מסוים של זן, אם רצונך בכך. מניסיוננו, בדיקות mosquitocidal, הביוכימיה מוצג בדרך כלל פעילות רחבה על פני שלושה סוגים אלה,16,29, אבל שיש ערך הערכה של מינים סלקטיביות.
מבחני הם נקודת מוצא במהירות מסך מספר בדיקות, הביוכימיה עבור פעילות חרקים. בדיקות אלה, הביוכימיה כי התערוכה רעילות מבחני אחד או יותר יכול לבחור עוד ניתוחים באמצעות מבחני משניות ושלישוניות. דוגמאות כוללות את LITE tarsal assay ואת הסוכר האכלה מבחני34,35. הבחירה של מבחני נוספים נקבעת בדרך כלל לפי שיקולים סביב השוק הצפוי, יישום, עם תוצאות לספק תובנות על מצבי משלוח מוצר אפשרי. בתוצאות נציג המוצגת כאן, אנו חוקרים הרעילות של amitriptyline, אנטגוניסט של קולטני דופמין יונקים, הגעה זה יוערכו על פוטנציאל כמו רומן מואה בקוטלי חרקים10,12, 13 , 16. amitriptyline הציג רעילות הזחלים, המבוגרים של Ae. aegytpi בהציעו טווח μg larvicidal adulticidal פעילות ושל מתן רציונל חקירה של סדרות הכימי מבוסס amitriptyline לזיהוי מקבילים עם עוצמה גבוהה. אין השפעה משמעותית על תמותה או פוריות נצפתה ב Ae. aegypti נחשפים amitriptyline במהלך הארוחה דם. בזמן היציבות של הכימיה defibrinated דם, מנה אפקטיבית שהתקבלו לפי יתוש אינו ידוע, מגבלות הבולטים של וזמינותו, הנתונים מראים amitriptyline ותרכובות אחרות GPCR-פעיל עשוי שיש סיכוי קטן כמו endectocides, ב לפחות בתוך המדינה unformulated.
אמצעי זהירות כדי להגביל וריאציה ביולוגי בין מבחני חיוניים. כל מבחני צריכה להתבצע תחת תנאים סטנדרטיים של טמפרטורה ולחות, רצוי בתוך חדר לגידול חרקים, על מנת להבטיח הפארמצבטית. זה הכרחי לתקנן את נהלי הבקיע והגישור פנוטיפי כמו אלה יכולים להיות סובייקטיבית, המוביל וריאציה משמעותית בנתוני שהוקלט על ידי עובדי מעבדה שונות. הזחל וזמינותו היא המתאימה ביותר להערכה של בדיקות, הביוכימיה שאינם מסיסים במים, למרות וזמינותו יכול להתבצע באמצעות ממיסים אורגניים כגון דימתיל סולפוקסיד ובלבד הריכוז הסופי הוא פחות מ 1% לכל טוב. אנו מכירים מספר מגבלות על וזמינותו אקטואלי למבוגרים. ראשית, יש צורך לעבוד במהירות בעת הכנת דילולים טורי ומסר אספקת מנות כמו המוביל (אצטון) המרבץ אידוי עשויה לייצר וריאציה של כימיה. שנית, צריך לקחת כדי להגביל את תקופת הרדמה כמו זה יכול לתרום התמותה. יש גם לציין כי ממיסים כגון אצטון ויכול ליצור אפקט "דפיקה למטה" מהירה במספר השעות הראשונות של וזמינותו אקטואלי, אשר לא צריך להיות מבולבל עם השפעות בשל הכימיה הבדיקה. נציין כי הנפח של הארוחה דם יתושים משתנה בין אנשים, וכדי לסבך את הערכה של המינון התקבל למבוגר ב וזמינותו בליעה למבוגרים. לבסוף, וזמינותו נתונים אין להתייחס במקרים שבו התמותה בפקד שלילי עולה על 10%.
מוצרים ולאבץ מזוהים יותר ויותר על הפוטנציאל שלהם כדי להרחיב את התועלת של מוצרים קיימים, לספק שליטה של מזיקים חרקים עמידים אוכלוסיות15,16,36. מבחני דרגות זחל שימשו כדי לבחון הסינרגטיות בין חומרי הדברה formamidine, amitraz, מגוון רחב של בדיקות, הביוכימיה לשבש octopamine הגעה קולטנים14,15. הזחל assay ואת וזמינותו אקטואלי למבוגרים תיאר מתאימים להערכת ההשפעות סינרגטי או כתוסף בין שילובים של בדיקות המבחן, הביוכימיה. נציין כי synergists כמו piperonyl butoxide (PBO) ניתן לשלב כל אחד מבחני שלושה המתוארים כאן.
מבחני שתוארו לעיל לספק סדרה ניסויית מתוקננת להערכה של מולקולת unformulated, קטן תרופות נגד יתושים מימיים והן הארציים החיים בשלבים. מבחני אלה נועדו במיוחד כדי להעריך את רעילות, מציעים כמה יתרונות על פני קיימים מבחני במשותף שימוש. חשוב, מבחני נתונות אוטומציה, יכול להתבצע בקנה מידה תעשייתי כדי לאפשר הערכה של אלפי תרכובות הבדיקה. לבסוף, כמו השדה מתייחס לפיתוח מוצרים שפועלים באמצעות MoAs חדש, לרבות באמצעות שיבוש מטרות מולקולריות הרומן מסלולים ביוכימיים, זה יהיה חיוני כדי לצבור נקודות קצה פנוטיפי מרובים בנוסף לאלה כגון תמותה, שיתוק. מבחני לעיל היתר חקירות אלה, ובכך מספק צעד לקראת המחר חרקים טכנולוגיות חדשניות ביותר.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
המחברים תודה ה' Ranson, ליברפול הספר לרפואה טרופית לקבלת סיוע עם assay לפיתוח ואספקה של פרוטוקול לייט, ועיצוב מ שרף, אוניברסיטת פרדו עבור ייעוץ וזמינותו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insecticide susceptible mosquito strains | Malaria Research and Reagent Reference Repository | https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Recommended strains: Aedes aegypti Liverpool (LVP) strain, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) strain and Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) strain | |
| Acetone | Mallinckrodt Chemical | CAS 67-64-1 | Use for dilutions and control |
| Amitraz | Sigma-Aldrich | CAS 33089-61-1 | Requires dilution in DMSO |
| Amitriptyline | Sigma-Aldrich | CAS: 549-18-8 | Can be diluted in acetone |
| Bifenthrin | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Synthetic pyrethorid used as positive control |
| Cis-(Z)-flupenthixol | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Pharmacologically tested as disruptor of dop-like receptors |
| Defibrinated rabbit blood | Hemostat | DRB0100 | Blood source for adapted mosquitoes to artificial feeding |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | MKBF2985 | Organic solvent used to disolve amitraz |
| Hemotek membrane feeding system | Hemotek Ltd | Serial no. 1303 | Used for feeding mosquitoes |
| Micro-applicator | Burkard Manufacturing Co. | - | Tool needed for topical application experiments |
| 24-well cell culture plate with lid | Corning Incorporated | 3526 | - |
| Advantage rubber bands | Alliance Rubber Co. | - | Used to seal the paper cups |
| Glass syringe (1 ml) | Becton Dickinson and Co. | 512004 | Needed for the micro-applications. Glass is better than plastic |
| Disposable scintillation vials (20 ml) | Fisher Scientific | 74505-20 | Glass vials prevent evaporation |
| Tulle fabric, white | Walmart | - | - |
| Paper cups | Dixie Consumer Products LLC. | PF15675/13D | Used to keep adult mosquitoes in adult topical assays |
| Petri dishes (150 mm) | Corning Life Sciences | - | Used to maintain the mosquitoes "slept" on cold without direct contact with ice |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | Used to sort larvae |
| Stereo microscope | Olympus | SZ6045 | Used to score larval assays and perform micro-applications |
| Tweezers (fine) | Fontax | - | Used to handle adult mosquitoes |
References
- World Health Organization. A global brief on vector-borne diseases. , Available from: www.who.int/about/Licensing/copyright_form/en (2014).
- World Health Organization. Vector-borne diseases. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs387/en (2016).
- World Health Organization. Report by the Secretariat. Neglected tropical diseases; Prevention, control, elimination and eradication. , Available from: http://www.who.int/neglected_diseases/A66_20_Eng.pdf (2013).
- Tolle, M. A., et al.
- Chen, C. D., et al. Dengue vectors surveillance in endemic areas in kuala lumpur city centre and selangor state, malaysia. Dengue Bulletin. 30, (2006).
- Marcombe, S., et al. Insecticide resistance status of united states populations of Aedes albopictus and mechanisms involved. PLoS ONE. 9 (7), e101992 (2014).
- Ranson, H., et al. Pyrethroid resistance in African anopheline mosquitoes: what are the implications for malaria control? Trends in Parasitology. , 1-8 (2010).
- Hemingway, J., Ranson, H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease. Annual Review of Entomology. 45, 371-391 (2000).
- Hemingway, J., Beaty, B. J., Rowland, M., Scott, T. W., Sharp, B. L. The Innovative Vector Control Consortium: improved control of mosquito-borne diseases. Trends in Parasitology. 22 (7), 308-312 (2006).
- Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: Pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D 1-like dopamine receptors. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6 (1), e1478 (2012).
- World Health Organization. Instructions for determining the susceptibility or resistance of mosquito larvae to insecticides. , Available from: http://apps.who.int/iris/handle/10665/69615 (1981).
- Hill, C. A., et al. Re-invigorating the insecticide discovery pipeline for vector control: GPCRs as targets for the identification of next gen insecticides. Pestide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 141-148 (2013).
- Conley, J. M., et al. Evaluation of AaDOP2 Receptor antagonists reveals antidepressants and antipsychotics as novel lead molecules for control of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeautics. 352 (1), 53-60 (2015).
- Ahmed, M. A. I., Matsumura, F. Synergistic actions of formamidine insecticides on the activity of pyrethroids and neonicotinoids against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 49 (6), 1405-1410 (2012).
- Ahmed, M. A. I., Vogel, C. F. A. Synergistic action of octopamine receptor agonists on the activity of selected novel insecticides for control of dengue vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) mosquito. Pesticide Biochemistry and Physiology. 120, 51-56 (2015).
- Hill, C. A., et al. Comparative pharmacological characterization of D1-like dopamine receptors from Anopheles gambiae, Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus suggests pleiotropic signaling in mosquito vector lineages. Parasites Vectors. 9 (1), 192 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for evaluating insecticide resistance in vectors using the CDC bottle bioassay. , Available from: https://www.cdc.gov/malaria/resources/pdf/fsp/ir_manual/ir_cdc_bioassay_en.pdf (2011).
- World Health Organization. Test procedures for insecticide resistance monitoring in malaria vector mosquitoes. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/250677/1/9789241511575-eng.pdf (2013).
- Geneva: World Health Organization. Guidelines for efficacy testing of insecticides for indoor and outdoor ground-applied space spray applications control of neglected tropical diseases who pesticide evaluation scheme. , Available from: http://www.who.int/iris/handle/10665/70070 2-53 (2009).
- Pridgeon, J. W., et al. Susceptibility of Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus Say, and Anopheles quadrimaculatus Say to 19 pesticides with different modes of action. Journal of Medical Entomolog. 45 (1), 82-87 (2008).
- Liverpool Insect Testing Establishment. , Available from: http://www.lite-testing-facility.com (2018).
- Aïzoun, N., et al. Comparison of the standard WHO susceptibility tests and the CDC bottle bioassay for the determination of insecticide susceptibility in malaria vectors and their correlation with biochemical and molecular biology assays in Benin, West Africa. Parasites Vectors. 6, 147 (2013).
- Owusu, H. F., Jančáryová, D., Malone, D., Müller, P. Comparability between insecticide resistance bioassays for mosquito vectors: time to review current methodology? Parasites Vectors. 8, 357 (2015).
- Savignac, R., Maire, A. A simple character for recognizing second and third instar larvae of five Canadian mosquito genera (Diptera: Culicidae). , (1981).
- Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. eLife. 4, 174 (2015).
- Zaim, M., et al. Alternative insecticides: an urgent need. Trends in Parasitology. 18 (4), 161-163 (2002).
- Fonseca, I., Quinoñes, M. L. Resistencia a insecticidas en mosquitos (Diptera: Culicidae): mecanismos, deteccion y vigilancia en salud publica. Revista Colombiana de Entomologia. 31 (2), 107-115 (2005).
- Fonseca-Gon Alez, I., Qu, M. L., Lenhart, A., Brogdon, W. G. Insecticide resistance status of Aedes aegypti (L.) from Colombia. Pest Management Science. 67, 430-437 (2011).
- Nuss, A. B., et al. Dopamine receptor antagonists as new mode-of-action insecticide leads for control of Aedes and Culex mosquito vectors. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 1-19 (2015).
- Shidrawi, G. R. A WHO Global Programme for monitoring vector resistance to pesticides. Bulletin of the World Health Organization. 68 (4), 403 (1990).
- Sylla, M., Kobylinski, K. C., Foy, B. D. Gates grand challenges explorations award: endectocides for controlling transmission of mosquito-borne diseases. Malariaworld Journal. 4 (5), (2013).
- Foy, B. D., Kobylinski, K. C., da Silva, I. M., Rasgon, J. L., Sylla, M.
- Chaccour, C. J., et al. Ivermectin to reduce malaria transmission: a research agenda for a promising new tool for elimination. Malaria Journal. 12 (1), 153 (2013).
- Olson, D. M., Fadamiro, H., Lundgren, J. G., Heimpel, E. Effects of sugar feeding on carbohydrate and lipid metabolism in a parasitoid wasp. Physiol Entomol. 25, 17-26 (2000).
- World Health Organization. Report of the WHO Informal Consultation. Evaluation and testing of insecticides. , Available from: http://www.who.int/whopes/resources/ctd_whopes_ic_96.1/en/ (1996).
- Huang, Q., Deng, Y., Zhan, T., He, Y. Synergistic and antagonistic effects of piperonyl butoxide in fipronil-susceptible and resistant rice stem borrers, Chilo suppressalis. Journal of Insect Science. 10, 182 (2010).
