Summary
Protocollen worden voor de beoordeling van de toxiciteit van chemicaliën te onvolwassen en volwassen muggen voor ontwikkeling als nieuwe klassen van larvicides, adulticides en endectocides beschreven. De protocollen inschakelen high-throughput testen van meerdere oplossingen op single-point dosis en evaluatie achteraf via dosis reactie assay om toxiciteit op contact te bepalen of via ingestie.
Abstract
Nieuwe klassen van insecticiden met nieuwe wijzen van optreden zijn nodig om te bepalen van insecticide resistente populaties van muggen die Zika, dengue, malaria en ziektes overbrengen. Testen voor snelle, high-throughput analyses van unformulated roman oplossingen tegen muggenlarven en volwassenen worden gepresenteerd. We beschrijven protocollen voor één punt-dosis en dosis reactie testen voor de evaluatie van de toxiciteit van klein molecuul chemicaliën op de Aedes aegypti -vector van Zika, dengue en gele koorts, de vector van malaria, Anopheles gambiae en de noordelijke huis mosquito, Culex quinquefasciatus, op contact en via ingestie. We geëvalueerd als voorbeeld, de toxiciteit van amitriptyline, een klein molecuul antagonist van G eiwit-gekoppelde receptoren, via larvale, volwassen actueel en volwassen bloed-voeding assay. De protocollen vormen een uitgangspunt voor het onderzoek naar mogelijke insecticide. Resultaten worden besproken in het kader van aanvullende experimenten om producttoepassingen en mechanismen voor de levering te verkennen.
Introduction
Muggen zenden het oorzakelijke agens van besmettelijke ziekten die van invloed zijn menselijke gezondheid wereldwijd1. De drie belangrijkste mug geslachten op de menselijke gezondheid zijn Aedes, Anopheles, en Culex. Soorten Aedes -muggen vector de arboviruses waardoor Zika, knokkelkoorts, gele koorts en chikungunya. Anopheles -soorten malariaparasieten vector en Culex soorten doorgeven West-Nijlvirus en filarial aaltjes2. De World Health Organization (WHO) heeft genoemd voor de uitroeiing van tien verwaarloosde tropische ziekten (NTD) door 20203 en mug controle als de meest haalbare strategie vastgesteld. Insecticiden zijn krachtige hulpmiddelen ter beheersing van muggen en vermindering van de4,5van de transmissie van de ziekte. Echter, de opkomst van insecticide-resistente mug bevolking dreigt de voortdurende controle van vele ziekten6,-7,8. De innovatieve Vector controle Consortium (IVCC) heeft de eerste speciale inspanning om vervanging insecticiden voor mosquito control9gelanceerd. Nieuwe insecticiden met nieuwe vormen van actie (MoA) zijn nodig om die doelen te bereiken en ziektebestrijding te bereiken. De ontdekking en ontwikkeling van nieuwe insecticide klassen met roman MoAs vereist hele organisme testen voor snelle, hoge-doorvoer analyse van chemicaliën en in vergelijking met de industrie normen10.
Meerdere testen zijn beschikbaar om de repellente eigenschappen en de toxiciteit van insecticiden larven en de volwassen muggen te evalueren, en sommige zijn geschikt voor de evaluatie van nieuwe geformuleerde of unformulated chemicaliën. De WHO protocol11 is een contact test gebruikt voor het testen van producten tegen vierde instar-larven. Gepubliceerde studies beschrijven ook een verscheidenheid van larval tests gebruikt voor het testen van de toxiciteit van klein molecuul chemicaliën om larven van Aedes aegypti, Anopheles gambiae en Culex quinquefasciatus10,12, 13,14,15,16. De Centers for Disease Control and Prevention (CDC) fles bioassay wordt gebruikt ter beoordeling van insecticide resistentie bij veld gevangen populaties van volwassen muggen via evaluatie van letale concentratie (LC) en dodelijke tijd (LT) in vergelijking met een standaard diagnostische dosis van een commerciële insecticide17. De WHO gevoeligheid test biedt een andere aanpak om te evalueren van insecticide resistentie bij volwassen muggen waarbij muggen worden blootgesteld aan insecticide geïmpregneerd papier in glazen flesjes voor 1 h en sterfte wordt beoordeeld op 24 h18. Andere testen spray formuleringen in verzegelde kooien en record mug knockdown en dood op gewenste timepoints19. Actuele toepassing naar de mug thorax is gebruikt om te evalueren van de werkzaamheid van verschillende bestrijdingsmiddelen20. De Liverpool Insect testen inrichting (LITE)-21 maakt gebruik van operationele standaardproceduresom te evalueren van de topicale van chemicaliën tot volwassen muggen. De LITE volwassen actuele bepaling geldt een kleine hoeveelheid testproduct voor de thorax van volwassen muggen met sterfte scoorde op 48 uur. De bepaling maakt kwantificering van de dosis per individuele mug21ontvangen. De LITE tarsale assay evalueert de giftigheid van testproduct aan volwassen muggen rustend op een chemisch behandelde oppervlak en wordt gebruikt voor het identificeren van chemicaliën met ontwikkelingspotentieel als overdekt residuele spuitbussen (IRS) of worden gebruikt in insecticide behandelde muskietennetten (ITNs) te regelen Anopheles muggen.
De WHO en CDC testen hebben beperkingen voor het testen van de roman, unformulated oplossingen, en het doel van de CDC fles bioassay is evaluatie van gevoeligheid gedurende korte assay perioden (twee uur) in plaats van toxiciteit22,23. Daarnaast testen voor de evaluatie van de toxiciteit van oplossingen geleverd in de bloedmeel en potentieel voor ontwikkeling van systemische-acteren producten (bijvoorbeeld endectocides) ontbreken. Hier beschrijven we testen voor het testen van de activiteit van de mosquitocidal van nieuwe chemicaliën die oplosbaar zijn in water of in een van de verscheidene organische oplosmiddelen worden gebruikt tegen de larven en volwassenen van Aedes, Anopheles en Culex. Ten eerste, we laten zien een larvale assay eerder beschreven door onze fractie10,12,13,16, en hier uitgevoerd als (1) dosis een scherm te snel evalueren meerdere oplossingen op één punt, en (2) een dosis reactie test om te bepalen van de letale concentratie (bijvoorbeeld LC50, LC75 of LC90) van een één chemie. Vervolgens beschrijven we twee volwassen assays voor de bepaling van letale dosis (LD). De eerste is een aanpassing van het LITE protocol voor het testen van topisch toegepast, nieuwe oplossingen tegen volwassen muggen in vergelijking met een positieve controle. De tweede is een voeding assay voor de evaluatie van oplossingen geleverd systemisch via de bloed-maaltijd.
Protocol
Opmerking: Alle spanningen en reagentia die nodig zijn voor het werk beschreven in de volgende protocollen en leveranciers worden weergegeven in de Tabel van materialen.
1. cultuur van Mosquito larven en volwassenen
Opmerking: Insecticide voor de ziekte vatbare soorten muggen zijn beschikbaar van de Malaria-onderzoeks- en reagens referentie Repository. Aanbevolen stammen zijn als volgt: Aedes aegypti Liverpool (LVP) stam, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) stam en Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) stam.
- Cultuur muggenlarven van eieren op een 12u dag/12 h nacht cyclus bij 28 ° C en 75-85% relatieve vochtigheid (RH) in 25 x 40 cm kunststof bakjes (~ 400 larven per lade) zoals beschreven door Fuentenueva29. Het voeden van de larven grond gerbil (A. aegypti en Anopheles gambiae) of vlok vis eten (C. quinquefasciatus). Verzamelen voor larval tests, larven stadium de derde larvale (L3) instar.
- Volwassen muggen van de achterzijde van poppen die zijn overgedragen aan plastic bekers en plaats binnen 20 L kunststof kooien in een insectary onder de hierboven beschreven voorwaarden. Houden muggen op 20% suikeroplossing zoals elders beschreven29. Verzamelen volwassenen 3-5 dagen post ontstaan.
2. de larvale Contact Assay (één punt dosis of de dosis reactie Assay)
Opmerking: De test kan worden uitgevoerd met chemicaliën die oplosbaar zijn in water of dimethyl sulfoxide (DMSO), mits de uiteindelijke concentratie van DMSO in test putjes 1% niet overschrijdt. Alternatieve oplosmiddelen wellicht een optie, maar het is essentieel voor het eerst bevestigen dat de uiteindelijke concentratie niet tot meer dan 10% sterfte bij 72 h post blootstelling. De test kan worden uitgevoerd als een aanspreekpunt dosis of de dosis respons assay. Als het uitvoeren van de laatste, is het raadzaam om te testen van een aantal uiteenlopende concentraties (minimaal vijf), verspreid over de verwachte LC-50.
- Label de putjes van de plaat van een helder 24-well weefsel zoals afgebeeld in Figuur 1.
- Voorbereiden van een stamoplossing van de chemie van de test in een 1,5 mL-buis.
- Weeg elke chemie met behulp van een analytische balans, en afhankelijk van de kenmerken van de oplosbaarheid, resuspendeer in steriele ddH2O, DMSO of andere geschikt organisch oplosmiddel van keuze (Zie Figuur 2).
Opmerking: Berekeningen moeten rekening houden met de zuiverheid van de chemie. Bijvoorbeeld, voor een chemie die 99% zuiver, Los 10.1 mg in 1000 µL van aceton te verkrijgen van een 1%-oplossing. Zegel met paraffine film en opgeslagen bij-20 ° C.
- Weeg elke chemie met behulp van een analytische balans, en afhankelijk van de kenmerken van de oplosbaarheid, resuspendeer in steriele ddH2O, DMSO of andere geschikt organisch oplosmiddel van keuze (Zie Figuur 2).
- Het bepalen van de uiteindelijke concentratie van de test-chemie dat zal worden geëvalueerd en maak seriële verdunningen van de stamoplossing dienovereenkomstig, met behulp van de geschikt oplosmiddel.
Opmerking: De concentratie en het volume van de chemie en oplosmiddel kunnen worden berekend met de formule C1* V1= C2* V2 waar C1= concentratie van voorbeeld 1, C,2= concentratie van voorbeeld 2, V1= volume van de proef 1 en V2= hoeveelheid monster 2. Zie de berekeningen van de voorbeeld weergegeven in Figuur 2 en tabel 1.- Bereid een stamoplossing van 10 mM en seriële verdunningen zoals vereist voor het verkrijgen van de gewenste testconcentraties (tabel 1B).
- Vijf L3 larven overbrengen met behulp van een pipet wide-boring kunststof overdracht, in de put van een weefselkweek test plaat; L3 larven kunnen worden herkend door lengte (~ 2.5-3.5 mm) en hoofd capsule breedte van ~ 0,025 mm24. Voorzichtig het water met een pipet 1 mL verwijderen en vervangen met het gewenste volume van ddH2O (zie hieronder). Herhaling voor n = 4 technische replicatieonderzoeken per behandeling (bijvoorbeeld 20 larven totaal per behandeling).
- Voeg het juiste volume van de test chemie aan elk van de vier repliceren putjes in de plaat 24-well test en zachtjes swirl de plaat om ervoor te zorgen dat uniforme mengen van chemie. Plaats de plaat in een test of groei kamer onder constante omstandigheden (bijvoorbeeld 25 ° C en ~ 75-85% RH wordt aanbevolen, en een 12 h licht/12 h donker cyclus indien mogelijk).
Opmerking: Voor reproduceerbaarheid tussen experimenten, zorgen de daaropvolgende tests worden uitgevoerd onder dezelfde milieu omstandigheden. - Registreren van het aantal doden/niet-reagerende larven in elk putje op 30 min, 1, 1.5, 2, 3, 24, 48 en 72 h post-exposure (of alternatieve tijdstippen) op het scoreblad (tabel 2). Tik zachtjes op de kant van de plaat. Als er geen beweging wordt waargenomen, zachtjes aanraken de larve met een steriel tandenstoker. Score van larven die niet reageren om te onttrekken/aanraking als "dood".
Opmerking: Andere morfologische en gedragsmatige fenotypen kunnen worden waargenomen en kunnen worden opgenomen. - Gecorrigeerd voor de sterfte in de controlegroep met behulp van de gewijzigde Abbott's formule indien gewenst, als volgt:
Mortaliteit (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),
waarbij X = het percentage mortaliteit in de behandelde monster, en Y = het percentage mortaliteit in het besturingselement. - Resultaten als een histogram of logaritmische curve met behulp van software van keuze, zoals grafiek-stootkussen prisma 6 of soortgelijke grafiek en letale concentratie (LC) waarden ten opzichte van het besturingselement te berekenen.
- Herhaal de test met een aparte batch van muggen voor n = 3 of meer biologische wordt gerepliceerd.
3. volwassen actuele Assay (één punt dosis of de dosis reactie Assay)
Opmerking: De volwassen actuele test wordt uitgevoerd met behulp van aceton als oplosmiddel. Alternatieve oplosmiddelen wellicht een optie, maar het is essentieel voor het eerst bevestigen dat de uiteindelijke concentratie niet tot meer dan 10% sterfte bij 48u post blootstelling. De test kan worden uitgevoerd als één punt dosis of de dosis respons assay en wordt gebruikt voor het bepalen van letale dosis (LD). Als het uitvoeren van de laatste, is het raadzaam om te testen van een aantal uiteenlopende concentraties (minimaal vijf), verspreid over de verwachte LD-50.
- Bepaal het aantal volwassen vrouwelijke muggen vereist voor het voltooien van de test.
Opmerking: Een punt dosis assay met een enkele chemie vergt een minimum van 90 muggen (30 voor de positieve controle, 30 voor de aceton-alleen negatieve controle en 30 voor de test-chemie). - 3 tot 5 dagen oude volwassen vrouwelijke muggen cultuur en naar een afzonderlijke 20 mL plastic emmer met behulp van een aspirator (Figuur 3).
- Label 9 oz papieren bekers met de naam en de concentratie van de test-chemie. 10 x 10 cm mesh pleinen en elastiekjes voor elk kopje gereserveerd (Zie Figuur 4).
- Selecteer een bestaande insecticide als positieve controle (bijvoorbeeld de synthetische pyrethroïde, bifenthrin) en bereiden een 1%-stockoplossing (10 µg/µL) in aceton.
Opmerking: Berekeningen moeten rekening houden met de zuiverheid van de chemie. Bijvoorbeeld, voor een chemie die 99% zuiver, Los 10.1 mg in 1000 µL van aceton te verkrijgen van een 1%-oplossing. Zegel met paraffine film en opgeslagen bij-20 ° C. - Volgens dezelfde procedure als hierboven, bereiden een stamoplossing van de test-chemie.
Opmerking: Vele test chemicaliën zijn zeer onstabiel, en oplossingen dient bij voorkeur te geschieden vers telkens de bioassay wordt uitgevoerd. - Maak seriële verdunningen van de positieve controle en test van de chemicaliën van stamoplossingen zoals afgebeeld in Figuur 5 20 mL glazen flesjes eerder gespoeld met aceton gebruiken.
- Zuiveren van een spuit van 1 mL glas met aceton, vullen met aceton en veilig in de micro-applicator aangepast om het leveren van een volume van 0,25 µL.
- Werken in batches van tien, 3 - 5 - dagen oude volwassen vrouwelijke muggen van kooien met behulp van een aspirator verwijderen en anesthetize voor maximaal vijf min bij 4 ° C in de koelkast of op ijs. Vervolgens overbrengen muggen een petrischaal en de plaats op het ijs gedurende maximaal 10 minuten.
- Snel werkend, verwijderen van een enkele vrouw met een fijne pincet en breng de dorsale thorax met behulp van de spuit micro-applicator 0,25 µL van de meetoplossing ligt. Bevestigen levering van chemie door observatie met behulp van een Microscoop ontleden om ervoor te zorgen elke mug ontvangt het juiste volume van de chemie van de test.
- De mug overbrengen naar een gelabelde papier kop rusten op ijs, en herhaal dit negen keer ophalen n = 10 behandelde muggen. Het zegel van de muggen in de beker met vierkante mazen beveiligd met een elastiekje, en overdracht aan een kunststof bad of groei kamer onder constante omstandigheden van 28 ° C en 75-85% RH (op een 12 h dag/12 h nacht cyclus is beter).
- Herhaal het bovenstaande experiment tweemaal voor n = 3 technische replicatieonderzoeken (dat wil zeggen, 30 muggen totaal) per behandeling of controle groep.
- Herhaal stap 3.7-3.10 eerst met de chemie van de test en vervolgens de positieve controle.
Opmerking: Een ander nuttig besturingselement op te nemen als er voldoende muggen beschikbaar zijn is een "lege" van 30 narcose muggen die niet of test chemie als oplosmiddel ontvangen. - Registreren het aantal "dode/niet-reagerende" muggen op 60 min, 30 min, 2, 24 en 48 h post-exposure (of alternatieve tijdstippen) met behulp van de scorekaart (tabel 3). Score muggen "dode/niet-reagerende" als ze gebrek aan beweging tonen, die omschreven als leggen aan de ene kant of op de rug en met het onvermogen om te vliegen.
- Indien gewenst, gecorrigeerd voor de sterfte in de controlegroep met behulp van de gewijzigde Abbott's formule als volgt:
Mortaliteit (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),
waarbij X = het percentage mortaliteit in de behandelde monster, en Y = het percentage mortaliteit in het besturingselement. - Resultaten als een histogram of een exponentiële curve weergegeven. Voor een dosis-respons-assay, door de LD50, LD75 of LD90 waarde voor de chemie van de test ten opzichte van het besturingselement te berekenen.
- Herhaal de test ten minste tweemaal afzonderlijke batches van muggen gebruikt voor n = 3 of meer biologische wordt gerepliceerd.
4. volwassen bloed-voeding-Assay (één punt dosis of de dosis reactie Assay)
- Verzamelen ongeveer 150 4-5-daagse oude volwassen vrouwelijke muggen en transfer naar een aparte kooi. Herhaal dit om te verkrijgen van 6 kooien als een dosis-respons-test wilt uitvoeren. Verwijder de bron van suiker 1-24 uur voorafgaand aan de voeding assay.
- Bereiden van een stamoplossing van chemie, zoals hierboven beschreven, administratieve verwerking van de zuiverheid van de chemie (een typische stamoplossing is 80 mM in water of zout buffer) en vervolgens Maak seriële verdunningen in water/buffer zoals vereist.
- Voeg toe 40 µL van elk van de verdunningen aan 960 µL van defibrinated konijn bloed te verkrijgen van de gewenste testconcentratie. Toepassing van membraan film op een voeding eenheid en verzegelen met een rubberring. Overdracht van 1 mL bloed via de pipet en de voeding eenheid hechten aan een verwarming eenheid.
- Swab het membraan oppervlak met vers gemaakt zachtjes 10% melkzuur-oplossing en plaats de eenheid voeding in de kooi van volwassen muggen. Dekken de kooi met een donker doek of zwarte vuilnis zak en laat muggen te voeden gedurende één uur.
- Herhaal stap 4.2-4.4 voor de rest van de testoplossingen en de negatieve (alleen bloed) controle.
- Voltooiing van het voederen, plaatst emmers bij 4 ° C in een koelkast gedurende 5 minuten aan anesthetize muggen. Verwijderen van de mannelijke muggen en vrouwelijke muggen niet gevoed, en tellen en registreren van het totale aantal gevoed en gevoed gedeeltelijk muggen door onderzoek van de buik.
- Behouden gedeeltelijk en volledig gevoed vrouwelijke muggen, streven naar een minimum van 50 bloed-gevoed muggen per dosis.
- Emmers overbrengen in een kunststof bad of groei kamer onder constante omstandigheden van 28 ° C en 75-85% RH (op een 12 h dag/12 h nacht cyclus is beter).
- Opnemen van het totale aantal doden/niet-reagerende muggen op 0,5, 1, 1.5, 2, 24, 48 en 72 uur (of alternatieve tijdstippen zoals gewenst) met behulp van de score blad (tabel 4).
- Op de derde dag post bloed voeden, voeren een ei-cup in de kooi en verzamelen van eieren over een periode van 72 uur. Count het totale aantal eieren geproduceerd per behandeling onder een Microscoop ontleden.
- Bereken het percentage mortaliteit en vruchtbaarheid als een functie van het totale aantal gevoed muggen voor alle behandelde groepen en het besturingselement. Gecorrigeerd voor de sterfte in de controlegroep met behulp van de gewijzigde Abbott's formule indien gewenst.
- Toxiciteit en vruchtbaarheid gegevens weergeven als een histogram perceel of de exponentiële kromme (als het uitvoeren van een dosis-respons-assay) met behulp van software van keuze. Als u een dosis-respons-test uitvoert, berekenen de LD50, LD75 of LD90 waarde voor de chemie van de test ten opzichte van de controle.
- Herhaal de test ten minste tweemaal afzonderlijke batches van muggen gebruikt voor n = 3 of meer biologische wordt gerepliceerd.
Representative Results
Figuur 6 toont het percentage mortaliteit van L3 Ae. aegypti na blootstelling aan vijf doses van de dopamine receptor antagonist, amitriptyline in vergelijking met het water alleen (negatieve) controle op 24, 48 en 72 uur. In dit voorbeeld de op elk van de tijd-punten verzamelde gegevens weergeven van een typische logaritmische curve en onthullen een dosis-afhankelijk effect van amitriptyline op larvale sterfte. De LC50 waarde afneemt in de tijdsverloop van het experiment en kan worden berekend met de gegevens van de 72 h (dat wil zeggen, het middelpunt van de logaritmische curve).
Figuur 7 ziet u het percentage mortaliteit van 3 - 5-dagen oude volwassen vrouwtjes Ae. aegypti gevolg van blootstelling aan een 400 µM dosis (10 µg/µL) van de dopamine receptor antagonist, amitriptyline en in vergelijking met de synthetische pyrethroïde, bifenthrin-positieve controle (technische kwaliteit; 500 pg/µL), dit is een alleen-aceton negatieve controle en onbehandelde muggen (leeg). In dit voorbeeld veroorzaken zowel amitriptyline en bifenthrin aanzienlijke volwassen sterfte ten opzichte van de negatieve controle. Merk op dat volwassen sterfte na verloop van tijd, vermoedelijk als gevolg van metabole ontgifting van proef doorgaan vermindert.
Figuur 8 toont het percentage mortaliteit (linker y-as) van 3-5 dagen oude volwassen vrouwtje Ae. aegypti gevoed een bloedmeel behandeld met een van de vier doses van de dopamine receptor antagonist, amitriptyline en de vruchtbaarheid (y-as rechts; gemiddelde ei graaf / vrouwelijke) voor de eerste blootstelling van het bericht van de cyclus van de gonotrophic in vergelijking met controle muggen (bloed-gevoed alleen; negatieve controle). De gegevens blijkt dat er geen significant effect van amitriptyline op volwassen sterfte ten opzichte van de controle maar aantonen dat amitriptyline aanzienlijk verhoogt de vruchtbaarheid bij de hoogste dosis (400 µM).
Figuur 1 . Opzet van de larvale dosis reactie assay. Afbeelding toont de structuur van de larvale dosis reactie bepaling uitgevoerd met behulp van Aedes aegypti L3 larven in 24-well plaat.
Figuur 2 . Schematische procedure voor set opdagen (A) aanspreekpunt dosis of de dosis (B) reactie larvale assay in 24-well plaat. Na de overdracht van vijf L3 larven aan putjes, overtollig water zachtjes via Pipetteer verwijderd en vervangen door verse, steriele ddH2O. Volgende, voorraad en seriële verdunningen van de chemie van de test worden voorbereid en toegevoegd aan een eindvolume van 1 mL/putje. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Cultuur van volwassen muggen. Afbeelding weergegeven: 20 L kunststof emmer gebruikt voor cultuur van volwassen muggen en het gebruik van een aspirator om muggen.
Figuur 4 . Volwassen actuele assay uitgevoerd met behulp van 4-5 dagen oud vrouwtje Aedes aegypti. Volgende behandeling met chemie of oplosmiddel, volwassen muggen zijn geplaatst in papier cups en overgebracht naar een testkamer voor de duur van de test.
Figuur 5 . Voorraad en seriële verdunningen. Schematisch diagram weergegeven: de procedure voor de voorbereiding van de voorraad (A) en (B) seriële testoplossingen voor de volwassen actuele assay. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 . Representatieve gegevens uit een larvale contact dosis-respons-assay. Representatieve gegevens uit een larvale contact dosis-respons assay tonen percentage mortaliteit van Aedes aegypti L3 larven na blootstelling aan de dopamine receptor antagonist, amitriptyline 24, 48 en 72 uur. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt gemiddelde in µM ± SEM. gegevens vertegenwoordigen n = 3 biologische replicatieonderzoeken.
Figuur 7 . Representatieve gegevens van een volwassen actuele dosis reactie assay. Representatieve gegevens van een volwassen actuele dosis reactie assay tonen van de toxiciteit van de dopamine receptor antagonist, amitriptyline (10 µg/µL) tot 3-5 dagen oude vrouwelijke Aedes aegypti ten opzichte van de synthetische pyrethroïde, bifenthrin (500 pg/µL) positieve Control) en negatieve controle (alleen aceton voertuig) 2, 24 en 48 h. Gegevens vertegenwoordigen n = 3 biologische replicatieonderzoeken. Foutbalken geven SEM.
Figuur 8 . Representatieve gegevens van een volwassen inslikken assay. Representatieve gegevens van een volwassen inslikken assay tonen van de toxiciteit van de dopamine receptor antagonist, amitriptyline bij 100 µM, 200 µM en 400 µM dosis naar 3-5 dagen oude volwassen vrouwelijke Aedes aegypti en effect op de vruchtbaarheid (uitgedrukt als de gemiddelde totale ei tellen per vrouw gedurende de eerste cyclus van de gonotrophic). Gegevens vertegenwoordigen n = 3 biologische replicatieonderzoeken ± SEM.
| A. aanspreekpunt dosis testen met drie chemicaliën | |||||
| Chemie | Concentratie (400 uM) | ||||
| Amitriptyline | 80 mM voorraad: 2 mg amitriptyline X 98% (zuiverheid van poeder) X 0,001 g / 1 mg X 1 mol /313.86 g X 1 L/0.08 mol X 106 µL/L = 78.06 µL van water. | ||||
| Seriële verdunningen: Verdun voorraad 1:2 met ddH2O en dan 1:4 tot 10 mM. Voeg 40 µL van 10 mM voorraad aan putje met 960 µL van ddH20 om een eindconcentratie van 400 µM per putje. Maak seriële verdunningen van 10 mM voorraad 1:2 tot 5 mM, 2.5 mM, 1.25 mM en 0.625 mM voorraden. | |||||
| CIS-(z)-flupenthixol | 80 mM voorraad: 2 mg van cis (z) flupenthixol X 98% (zuiverheid van poeder) X 0,001 g / 1 mg X 1 mol/507.44 g cis (z) flupenthixol 1 X L/0.08 X 10-6 mol µL/L = 48.28 µL van water. | ||||
| Seriële verdunningen: Als hierboven. | |||||
| Amitraz | 80 mM voorraad: 2 mg van Amitraz X 0,001 g / 1 mg X 1 mol/293.4 g van amitraz X 1 L/0.08 mol X 106 µL/1 L = 85.21 µL van DMSO (Opmerking: Amitraz is slechts oplosbaar in DMSO). | ||||
| Seriële verdunningen: Als hierboven. | |||||
| B. dosis reactie assay | |||||
| Chemie | Dosis 1 | Dosis 2 | Dosis 3 | Dosis 4 | Dosis 5 |
| 400 ΜM | 200 ΜM | 100 ΜM | 50 ΜM | 25 ΜM | |
| bijvoorbeeld Amitriptyline, cis-(Z)-flupenthixol of amitraz | 40 ΜL | 40 ΜL | 40 ΜL | 40 ΜL | 40 ΜL |
| 10 mM voorraad | 5 mM voorraad | 2.5 mM voorraad | 1.25 mM voorraad | 0.625 mM voorraad | |
Tabel 1. Voorbeeld berekeningen voor Aedes aegypti L3 larvale (A) één punt dosis assay en (B) dosis reactie assay.
Tabel 2. Voorbeeld scorekaart gebruikt gegevens te registreren van de mug larvale dosis reactie assay. Controle, dit is een alleen-water of water met 1% DMSO of andere oplosmiddel alleen. Typische doses worden gebruikt voor het testen van klein molecuul antagonist chemicaliën zoals amitriptyline zijn 25 µM, 50 µM, 100 µM, 200 µM en 400 µM.
| Volwassen mug (3-5 dagen oud) actuele Assay | ||||||
| Datum gestart: | ||||||
| Onderzoeker: | ||||||
| Soort/stam: | ||||||
| Assay Type: Aanspreekpunt dosis/dosis respons | ||||||
| A. sterfte (nr. dode muggen) | ||||||
| (Uren) | Dosis 1 | Dosis 2 | Dosis 3 | Dosis 4 | Dosis 5 | Controle |
| 0,5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
| B. % sterfte | ||||||
| (Uren) | Dosis 1 | Dosis 2 | Dosis 3 | Dosis 4 | Dosis 5 | Controle |
| 0,5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
Tabel 3. Voorbeeld scorekaart gebruikt gegevens te registreren van de volwassen actuele dosis reactie assay.
| Volwassen mug (3-5 dagen oud) inname Assay | ||||||
| Datum gestart: | ||||||
| Onderzoeker: | ||||||
| Soort/stam: | ||||||
| Assay Type: Aanspreekpunt dosis/dosis respons | ||||||
| A. aantal gevoed muggen | ||||||
| Dosis 1 | Dosis 2 | Dosis 3 | Dosis 4 | Dosis 5 | Controle | |
| Gevoed | ||||||
| Niet Fed | ||||||
| Totaal | ||||||
| % Fed | ||||||
| % Niet Fed | ||||||
| B. sterfte (nr. dode muggen) | ||||||
| (Uren) | Dosis 1 | Dosis 2 | Dosis 3 | Dosis 4 | Dosis 5 | Controle |
| 2 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
| C. % sterfte | ||||||
| (Uren) | Dosis 1 | Dosis 2 | Dosis 3 | Dosis 4 | Dosis 5 | Controle |
| 2 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
Tabel 4. Voorbeeld scorekaart gebruikt gegevens te registreren van de volwassen bloed-voeding assay. Typische doses worden gebruikt voor het testen van klein molecuul antagonist chemicaliën zoals amitriptyline zijn 50 µM, 100 µM, 200 µM en 400 µM.
Discussion
Insecticiden zijn krachtige instrumenten ter bestrijding van muggen overgebrachte ziekten zoals malaria25, dengue en Zika26. Uitgebreide insecticide gebruik heeft mug populaties dat resistent zijn voor chemische gewasbescherming, wat leidt tot de ontwikkeling van insecticide resistentie, die wordt beschouwd als de grootste interne bedreiging voor ziektebestrijding voortgezet. Het laatste decennium heeft gezien een dramatische toename van de populaties van Anopheles spp. resistent tegen synthetische pyrethroïden (SPs) gebruikt in muskietennetten in Afrika7. Bevolking van Aedes albopictus, een vector van dengue en Zika, zijn gemeld in Florida en New Jersey die resistent zijn tegen organofosfaten6. Weerstand tegen DDT en pyrethroïden is ook gedocumenteerd in populaties van Anopheles en Aedes spp. in Colombia27,28. Er is dringend behoefte aan het ontwikkelen van nieuwe larvicides en adulticides die zich aan diverse orthosteric binden of allosteric sites op bekende moleculaire targets of die verstoren nieuwe doelen (dat wil zeggen, roman MoA chemicaliën)29,30 en minimaal milieueffect hebben. Er is ook sprake van toenemende erkenning van het potentieel rond endectocides voor mug controle31,32,33.
Ter vergemakkelijking van de snelle ontwikkeling van dergelijke producten, beschrijven we een aantal protocollen ter evaluatie van de toxiciteit van klein molecuul doorgaan naar muggenlarven en volwassenen via twee routes van de levering - contact en inslikken. Protocollen zoals de WHO gevoeligheid test en de bepaling van de fles CDC zijn gemeenschappelijk gebruik voor evaluatie van de toxiciteit en repellency van bestaande insecticide formuleringen1,2. Echter, deze tests hebben beperkingen voor analyses van unformulated nieuwe chemische entiteiten (toff) en zijn niet vatbaar voor het testen van grote aantallen chemicaliën in matige of hoge doorvoer.
Hier beschrijven we een standaard larvale assay om te snel evalueren toff in aanspreekpunt dosis die voor hoge doorvoer analyses schalen kan. Ook beschrijven we een aanpassing van een test ontwikkeld door de LITE21 te evalueren van de contact toxiciteit van klein molecuul chemicaliën aan volwassen muggen. Tot slot, we beschrijven van een bepaling van de inname ter evaluatie van de toxiciteit van toff geleverd via de bloed-maaltijd aan volwassen vrouwelijke muggen en verkennen potentiële endectocide. Deze larven en de volwassen testen kunnen worden uitgevoerd op een aantal doses om respectievelijk LC en LD waarden vast te stellen en zowel de larven als de volwassen contact testen kunnen worden uitgevoerd in vergelijking met een of meer bestaande chemische formuleringen. De volwassen actuele bepaling maakt het ook mogelijk de berekening van de LD waarden per individuele mug. De protocollen kunnen worden uitgevoerd met behulp van soorten Aedes, Anopheles en Culex16,29 en kunnen worden gewijzigd voor de specifieke biologische kenmerken van een soort, indien gewenst. In onze ervaring, mosquitocidal chemicaliën vertonen meestal brede activiteit over deze drie geslachten16,29, maar er is waarde aan de beoordeling van de selectiviteit van de soorten.
De testen zijn een startpunt om te sluiten snel meerdere oplossingen voor insecticide activiteit. Deze chemicaliën die vertonen van de toxiciteit in een of meer testen kunnen worden geselecteerd voor verdere analyses via secundaire en tertiaire testen. Voorbeelden zijn de LITE tarsale assay en suiker assays34,35te voeden. De selectie van aanvullende tests wordt meestal bepaald door overwegingen rond verwachte markt en toepassing, met resultaten die inzichten om mogelijke product leveringswijzen. In de representatieve resultaten die hier worden weergegeven, verkennen we de toxiciteit van amitriptyline, een antagonist van zoogdieren en ongewervelde dopamine receptoren die is geëvalueerd voor potentieel als een roman MoA insecticide10,12, 13 , 16. amitriptyline tentoongesteld toxiciteit voor larven en volwassenen van Ae. aegytpi in de μg bereik suggereren larvicidal en adulticidal activiteit, en grondslag wordt geboden voor een verkenning van een amitriptyline gebaseerde chemische serie te identificeren analogen met hoge potentie. Geen enkel significant effect op mortaliteit of de vruchtbaarheid werd waargenomen in Ae. aegypti blootgesteld aan amitriptyline in het bloed-maaltijd. Terwijl de stabiliteit van de chemie in defibrinated bloed en effectieve dosis ontvangen per mug is niet bekend, bekende beperkingen van de test, uit de gegevens blijkt dat amitriptyline en andere GPCR-actieve verbindingen wellicht weinig potentieel als endectocides, op ten minste in unformulated staat.
Voorzorgsmaatregelen te beperken van biologische variatie tussen testen zijn essentieel. Alle tests moeten worden uitgevoerd onder standaardvoorwaarden van temperatuur en vochtigheid, bij voorkeur in een insect groei kamer, met het oog op de reproduceerbaarheid. Het is noodzakelijk om te standaardiseren van de procedures voor het scoren van fenotypische eindpunten als dit kunnen zeer subjectief, wat leidt tot aanzienlijke variatie in gegevens opgenomen door verschillende laboratoriumpersoneel. De larvale assay is best geschikt voor evaluatie van oplossingen die oplosbaar in water, zijn hoewel de bepaling kan worden uitgevoerd met behulp van organische oplosmiddelen zoals DMSO, mits de eindconcentratie minder dan 1% per putje is. Wij erkennen de verschillende beperkingen van de volwassen actuele assay. Eerst, er moet snel werk bij het opstellen van seriële verdunningen en leveren van doses zoals de vervoerder (aceton) zeer vluchtige en verdamping kan variatie in de hoeveelheid chemie geleverd. Ten tweede, moet worden gewaakt voor de termijn van de verdoving, aangezien dit ertoe tot sterfte bijdragen kan. Ook opgemerkt moet worden dat de oplosmiddelen zoals aceton een snelle "knock-down"-effect in de eerste enkele uren van de actuele assay, die moet niet worden verward met effecten als gevolg van de chemie test kunnen produceren. Wij stellen vast dat het volume van de mug bloedmeel tussen individuen varieert, een evaluatie van de dosis ontvangen per volwassene in de volwassen inslikken assay complicerende. Ten slotte assay gegevens niet beschouwd in gevallen waar de sterfte in de negatieve controle meer dan 10% bedraagt.
Producten die synergetisch werken steeds erkend voor hun potentieel uit te breiden van het nut van bestaande producten en bepalen van insecticide resistente pest populaties15,16,36. Larval tests zijn gebruikt om de onderzoeken van de synergie tussen het formamidine-bestrijdingsmiddel, amitraz en een scala aan oplossingen die ongewervelde octopamine receptoren14,15 verstoren. De larvale assay en volwassen actuele assay beschreven zijn geschikt voor de beoordeling van de synergetische of additieve effecten tussen combinaties van proef doorgaan. Wij stellen vast dat de synergistische middelen zoals piperonyl butoxide (PBO) kunnen worden opgenomen in elk van de drie tests die hier worden beschreven.
De hierboven beschreven tests bieden een gestandaardiseerde experimentele reeks voor evaluatie van unformulated, kleine molecuul geneesmiddelen tegen levensstadia van aquatische en terrestrische mug. Deze testen zijn speciaal ontworpen om te evalueren van de toxiciteit en bieden verschillende voordelen ten opzichte van bestaande testen in gemeenschappelijk gebruik. Nog belangrijker is, de testen zijn vatbaar voor automatisering en kunnen worden uitgevoerd op industriële schaal om evaluatie van duizenden test verbindingen. Tot slot, het veld beschouwt de ontwikkeling van producten die via nieuwe MoAs fungeren, inclusief via verstoring van nieuwe moleculaire doelwitten en biochemische pathways, zullen essentieel te scoren meerdere fenotypische eindpunten naast degenen zoals sterfte en verlamming. De bovenstaande tests toestaan dat dergelijke onderzoeken, waardoor een stap in de richting van morgen sterk innoverende insecticide technologieën.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
De auteurs bedanken H. Ranson, Liverpool School of Tropical Medicine voor hulp bij assay ontwikkeling en bepaling van de LITE protocol, en M. Scharf, Purdue University voor advies over assay ontwerp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insecticide susceptible mosquito strains | Malaria Research and Reagent Reference Repository | https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Recommended strains: Aedes aegypti Liverpool (LVP) strain, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) strain and Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) strain | |
| Acetone | Mallinckrodt Chemical | CAS 67-64-1 | Use for dilutions and control |
| Amitraz | Sigma-Aldrich | CAS 33089-61-1 | Requires dilution in DMSO |
| Amitriptyline | Sigma-Aldrich | CAS: 549-18-8 | Can be diluted in acetone |
| Bifenthrin | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Synthetic pyrethorid used as positive control |
| Cis-(Z)-flupenthixol | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Pharmacologically tested as disruptor of dop-like receptors |
| Defibrinated rabbit blood | Hemostat | DRB0100 | Blood source for adapted mosquitoes to artificial feeding |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | MKBF2985 | Organic solvent used to disolve amitraz |
| Hemotek membrane feeding system | Hemotek Ltd | Serial no. 1303 | Used for feeding mosquitoes |
| Micro-applicator | Burkard Manufacturing Co. | - | Tool needed for topical application experiments |
| 24-well cell culture plate with lid | Corning Incorporated | 3526 | - |
| Advantage rubber bands | Alliance Rubber Co. | - | Used to seal the paper cups |
| Glass syringe (1 ml) | Becton Dickinson and Co. | 512004 | Needed for the micro-applications. Glass is better than plastic |
| Disposable scintillation vials (20 ml) | Fisher Scientific | 74505-20 | Glass vials prevent evaporation |
| Tulle fabric, white | Walmart | - | - |
| Paper cups | Dixie Consumer Products LLC. | PF15675/13D | Used to keep adult mosquitoes in adult topical assays |
| Petri dishes (150 mm) | Corning Life Sciences | - | Used to maintain the mosquitoes "slept" on cold without direct contact with ice |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | Used to sort larvae |
| Stereo microscope | Olympus | SZ6045 | Used to score larval assays and perform micro-applications |
| Tweezers (fine) | Fontax | - | Used to handle adult mosquitoes |
References
- World Health Organization. A global brief on vector-borne diseases. , Available from: www.who.int/about/Licensing/copyright_form/en (2014).
- World Health Organization. Vector-borne diseases. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs387/en (2016).
- World Health Organization. Report by the Secretariat. Neglected tropical diseases; Prevention, control, elimination and eradication. , Available from: http://www.who.int/neglected_diseases/A66_20_Eng.pdf (2013).
- Tolle, M. A., et al.
- Chen, C. D., et al. Dengue vectors surveillance in endemic areas in kuala lumpur city centre and selangor state, malaysia. Dengue Bulletin. 30, (2006).
- Marcombe, S., et al. Insecticide resistance status of united states populations of Aedes albopictus and mechanisms involved. PLoS ONE. 9 (7), e101992 (2014).
- Ranson, H., et al. Pyrethroid resistance in African anopheline mosquitoes: what are the implications for malaria control? Trends in Parasitology. , 1-8 (2010).
- Hemingway, J., Ranson, H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease. Annual Review of Entomology. 45, 371-391 (2000).
- Hemingway, J., Beaty, B. J., Rowland, M., Scott, T. W., Sharp, B. L. The Innovative Vector Control Consortium: improved control of mosquito-borne diseases. Trends in Parasitology. 22 (7), 308-312 (2006).
- Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: Pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D 1-like dopamine receptors. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6 (1), e1478 (2012).
- World Health Organization. Instructions for determining the susceptibility or resistance of mosquito larvae to insecticides. , Available from: http://apps.who.int/iris/handle/10665/69615 (1981).
- Hill, C. A., et al. Re-invigorating the insecticide discovery pipeline for vector control: GPCRs as targets for the identification of next gen insecticides. Pestide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 141-148 (2013).
- Conley, J. M., et al. Evaluation of AaDOP2 Receptor antagonists reveals antidepressants and antipsychotics as novel lead molecules for control of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeautics. 352 (1), 53-60 (2015).
- Ahmed, M. A. I., Matsumura, F. Synergistic actions of formamidine insecticides on the activity of pyrethroids and neonicotinoids against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 49 (6), 1405-1410 (2012).
- Ahmed, M. A. I., Vogel, C. F. A. Synergistic action of octopamine receptor agonists on the activity of selected novel insecticides for control of dengue vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) mosquito. Pesticide Biochemistry and Physiology. 120, 51-56 (2015).
- Hill, C. A., et al. Comparative pharmacological characterization of D1-like dopamine receptors from Anopheles gambiae, Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus suggests pleiotropic signaling in mosquito vector lineages. Parasites Vectors. 9 (1), 192 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for evaluating insecticide resistance in vectors using the CDC bottle bioassay. , Available from: https://www.cdc.gov/malaria/resources/pdf/fsp/ir_manual/ir_cdc_bioassay_en.pdf (2011).
- World Health Organization. Test procedures for insecticide resistance monitoring in malaria vector mosquitoes. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/250677/1/9789241511575-eng.pdf (2013).
- Geneva: World Health Organization. Guidelines for efficacy testing of insecticides for indoor and outdoor ground-applied space spray applications control of neglected tropical diseases who pesticide evaluation scheme. , Available from: http://www.who.int/iris/handle/10665/70070 2-53 (2009).
- Pridgeon, J. W., et al. Susceptibility of Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus Say, and Anopheles quadrimaculatus Say to 19 pesticides with different modes of action. Journal of Medical Entomolog. 45 (1), 82-87 (2008).
- Liverpool Insect Testing Establishment. , Available from: http://www.lite-testing-facility.com (2018).
- Aïzoun, N., et al. Comparison of the standard WHO susceptibility tests and the CDC bottle bioassay for the determination of insecticide susceptibility in malaria vectors and their correlation with biochemical and molecular biology assays in Benin, West Africa. Parasites Vectors. 6, 147 (2013).
- Owusu, H. F., Jančáryová, D., Malone, D., Müller, P. Comparability between insecticide resistance bioassays for mosquito vectors: time to review current methodology? Parasites Vectors. 8, 357 (2015).
- Savignac, R., Maire, A. A simple character for recognizing second and third instar larvae of five Canadian mosquito genera (Diptera: Culicidae). , (1981).
- Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. eLife. 4, 174 (2015).
- Zaim, M., et al. Alternative insecticides: an urgent need. Trends in Parasitology. 18 (4), 161-163 (2002).
- Fonseca, I., Quinoñes, M. L. Resistencia a insecticidas en mosquitos (Diptera: Culicidae): mecanismos, deteccion y vigilancia en salud publica. Revista Colombiana de Entomologia. 31 (2), 107-115 (2005).
- Fonseca-Gon Alez, I., Qu, M. L., Lenhart, A., Brogdon, W. G. Insecticide resistance status of Aedes aegypti (L.) from Colombia. Pest Management Science. 67, 430-437 (2011).
- Nuss, A. B., et al. Dopamine receptor antagonists as new mode-of-action insecticide leads for control of Aedes and Culex mosquito vectors. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 1-19 (2015).
- Shidrawi, G. R. A WHO Global Programme for monitoring vector resistance to pesticides. Bulletin of the World Health Organization. 68 (4), 403 (1990).
- Sylla, M., Kobylinski, K. C., Foy, B. D. Gates grand challenges explorations award: endectocides for controlling transmission of mosquito-borne diseases. Malariaworld Journal. 4 (5), (2013).
- Foy, B. D., Kobylinski, K. C., da Silva, I. M., Rasgon, J. L., Sylla, M.
- Chaccour, C. J., et al. Ivermectin to reduce malaria transmission: a research agenda for a promising new tool for elimination. Malaria Journal. 12 (1), 153 (2013).
- Olson, D. M., Fadamiro, H., Lundgren, J. G., Heimpel, E. Effects of sugar feeding on carbohydrate and lipid metabolism in a parasitoid wasp. Physiol Entomol. 25, 17-26 (2000).
- World Health Organization. Report of the WHO Informal Consultation. Evaluation and testing of insecticides. , Available from: http://www.who.int/whopes/resources/ctd_whopes_ic_96.1/en/ (1996).
- Huang, Q., Deng, Y., Zhan, T., He, Y. Synergistic and antagonistic effects of piperonyl butoxide in fipronil-susceptible and resistant rice stem borrers, Chilo suppressalis. Journal of Insect Science. 10, 182 (2010).
