ورقة الضوء الفلورية الفحص المجهري لدراسة قلب مورين
Summary
هذه الدراسة يستخدم تقنية مجهرية () ورقة الضوء فلورية إضاءة الوجهين المزدوج جنبا إلى جنب مع مسح بصري لدراسة قلب موريني.
Abstract
الفلورية الضوء-ورقة الفحص المجهري تستخدم على نطاق واسع للحصول على الصور السريع مع ارتفاع قرار محوري من ميكرومتر إلى مقياس ملليمتر. التقنيات التقليدية للضوء–ورقة تنطوي على استخدام شعاع واحد الإضاءة الموجهة أورثوجونالي في عينة الأنسجة. صور لعينات كبيرة التي يتم إنتاجها باستخدام شعاع إضاءة واحدة تحتوي على تخطيطات أو التحف ويعانون من قرار تخفيض بسبب تشتت وامتصاص الضوء بواسطة الأنسجة. تستخدم هذه الدراسة شعاع إضاءة الوجهين المزدوج ومبسطة وضوح بصري مسح تقنية لقلب مورين. هذه التقنيات تسمح لتصوير أعمق عن طريق إزالة الدهون من القلب وإنتاج حقل كبير من التصوير، وأكبر من 10 × 10 × 10 ملم3. ونتيجة هذه الاستراتيجية تمكننا من قياس أبعاد البطين وتتبع نسب أمراض القلب، وتعريب التوزيع المكاني للبروتينات الخاصة بالقلب وقنوات أيون من بعد الولادة إلى قلوب الكبار الماوس مع تباين كافي و القرار.
Introduction
مجهرية الفلورية الضوء-ورقة تقنية وضعت في بادئ الأمر في عام 1903 ويستخدم اليوم كطريقة لدراسة التعبير الجيني وأيضا لإنتاج نماذج ثلاثية الأبعاد أو 4-د من الأنسجة العينات1،،من23. يستخدم هذا الأسلوب التصوير ورقة رقيقة من الضوء لإضاءة طائرة واحدة من عينة حيث أن فقط تلك الطائرة يتم التقاطها بواسطة الجهاز. يمكن ثم نقل العينة باتجاه المحوري لالتقاط كل طبقة، قسم واحد في كل مرة، وتقديم نموذج ثلاثي الأبعاد بعد تجهيز الصور المكتسبة4. ومع ذلك، نظراً لامتصاص وتشتت الفوتونات، كانت محدودة للعينات التي تكون أما بضعة ميكرونات سميكة أو شفافة بصريا1لسفم.
وأدت القيود المفروضة على لسفم لدراسات مستفيضة للكائنات التي لها الأنسجة التي تكون شفافة بصريا، مثل الزرد. غالباً ما تجري دراسات شملت التنمية القلب والتمايز الزرد أن هناك جينات المصانة بين البشر والزرد5،6. على الرغم من أن هذه الدراسات أدت إلى التقدم في مجال أبحاث أمراض القلب المتصلة بالقلب6،7، لا تزال هناك حاجة إجراء بحوث مماثلة على الكائنات ذات مستوى أعلى مثل الثدييات.
أنسجة القلب الثدييات تحديا نظراً لسمك والتعتيم للأنسجة، الاستيعاب سبب الهيموغلوبين في خلايا الدم الحمراء، وشريطية الذي يحدث بسبب الإضاءة على وجه واحد من العينة تحت الأساليب التقليدية في لسفم1 , 8-للتعويض عن هذه القيود، اقترحنا على استخدام الإضاءة الوجهين المزدوج ونسخة مبسطة من تقنية الوضوح9 جنبا إلى جنب مع إنكسار مطابقة الحل (دواليب). ولذلك، يسمح هذا النظام لتصوير عينة التي أكبر من 10 × 10 × 10 ملم3 في حين الحفاظ على قرار ذات نوعية جيدة في محوري والأفقي طائرات8.
أولاً معايرة هذا النظام استخدام الخرز الفلورسنت مرتبة في تكوينات مختلفة داخل أنابيب زجاجية. ثم، استخدم النظام لصورة قلوب مورين بعد الولادة والكبار. أولاً، تم تصويرها قلب الماوس بعد الولادة في 7 أيام (P7) للكشف عن تجويف البطين، وسمك جدار البطين وهياكل صمام، ووجود ترابيكوليشن. ثانيا، أجريت دراسة لتحديد الخلايا التي تفرق في cardiomyocytes باستخدام قلب ماوس بعد الولادة في اليوم 1 (P1) مع لجنة المساواة العرقية المسمى كارديوميوسيتيس وبروتين فلوري الصفراء (يفب). وأخيراً، تم تصويرها الفئران الكبار في أشهر 7.5 مراعاة وجود البوتاسيوم النخاع الخارجي الكلي قنوات (رومك) بعد العلاج الجيني8.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظام لسفم والأسلوب الموصوفة هنا يستخدم شعاع إضاءة الوجهين المزدوج جنبا إلى جنب مع تطهير ضوئية للصورة قلب الماوس في مراحل ما بعد الولادة والكبار من تطورها. شعاع إضاءة تقليدية واحد يعاني من تشتت فوتون والاستيعاب من خلال عينات الأنسجة أكثر سمكا وأكبر1،3. توفر ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفون يود أن يعرب عن امتنانه نغوين ثاو وناكانو أتسوشي من جامعة كاليفورنيا لتقديم نموذج الفئران للصورة. هذه الدراسة وأيده النجوم المنح HL118650 المعاهد الوطنية للصحة (إلى Tzung ك. هسياي)، HL083015 (إلى Tzung ك. هسياي)، HD069305 (لتشي جيم نون وهسياي ك. Tzung.)، HL111437 (إلى هسياي ك. Tzung وا. جيم تشي)، HL129727 (إلى Tzung ك. هسياي)، وجامعة تكساس نظام التمويل (جوهيون لي).
Materials
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitation of fluorophores |
| Neutral density filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controls amount of light entering system |
| Achromatic beam expander | Thorlabs | GBE05-A | Expands the beam of light |
| Mechanical slit | Thorlabs | VA100C | Controls width of beam |
| Beam splitter | Thorlabs | BS013 | Forms dual-illumination beam |
| Stereo microscope with 1X objective lense | Olympus | MVX10 | Used for observation of sample |
| ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images |
| Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) | Stratasys | uPrint | Material used to 3-D print a sample holder |
| Fluorescent polystyrene beads | Spherotech Inc | PP-05-10 | Used for imaging system calibration |
| Borosilicate glass tubing | Corning | Pyrex 7740 | Tubing for sample embedding |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Fill for sample chamber |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP39920 | Rinse solution for mouse hearts |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | RT-15700 | First incubation solution |
| Acrylamide | Wako Chemicals | AAL-107 | Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts |
| 2,2'-Azobis dihydrochloride | Wako Chemicals | VA-044 | Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | 71725 | Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts |
| Boric acid | Fischer Scientific | A74-1 | Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution |
| Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Expresses GFP when bound to ROMK |
| DC Servo Motor Actuator | Thorlabs | Z825B | Used for movement of sample in axial direction within light sheet |
| K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Connects to motor actuator and controls movement of the actuator |
| Amira | FEI Software | N/A | Visualization software for producing 2-D and 3-D images |
References
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
- High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).
- Sachinidis, A. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Scientific Reports. 7, 42209 (2017).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).
- National Heart, L., Blood Institute, . Standard Operating Procedures (SOP’s) for Duchenne Animal Models. , (2015).
- Sung, K., et al. Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping. Scientific Reports. 6, 30736 (2016).
- Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes. Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).
- FEI, . Amira User’s Guide. , 59-138 (2017).
- Gao, L., et al. Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit. Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), (2017).
