Summary

Hoja de luz fluorescencia microscopía para el estudio del corazón murino

Published: September 15, 2018
doi:

Summary

Este estudio utiliza una técnica de microscopía (LSFM) de hoja de luz fluorescencia iluminación doble cara combinada con la compensación óptica para estudiar el corazón murino.

Abstract

Microscopía de fluorescencia de la hoja de luz ha sido ampliamente utilizado para la adquisición rápida de la imagen con una resolución axial de micrómetro a escala milimétrica. Técnicas tradicionales de la hoja de luz incluyen el uso de un haz de iluminación único dirigido ortogonalmente en el tejido de muestra. Imágenes de muestras grandes que se producen con un rayo de iluminación solo contienen rayas o artefactos y sufren una resolución reducida debido a la dispersión y la absorción de luz por el tejido. Este estudio utiliza un haz de iluminación de doble cara y una simplificada claridad óptica compensación técnica al corazón murino. Estas técnicas permiten la proyección de imagen profunda mediante la eliminación de lípidos desde el corazón y producen un gran campo de imágenes, superior a 10 x 10 x 10 mm3. Como resultado, esta estrategia nos permite cuantificar las dimensiones ventriculares, rastrear el linaje cardiaco y localizar la distribución espacial de proteínas cardiacas específicas y canales iónicos de la post-natal a corazones de ratón adulto con suficiente contraste y resolución.

Introduction

Microscopía de fluorescencia de luz-hoja técnica desarrollado en 1903 y se utiliza hoy como un método para el estudio de expresión génica y también para producir modelos 3D o 4D de las muestras de tejido1,2,3. Este método de imagen utiliza una hoja fina de la luz para iluminar un solo plano de una muestra para que sólo ese plano es capturado por el detector. La muestra entonces puede mover en la dirección axial para capturar cada capa, una sección a la vez y renderizar un modelo 3-d después de post-procesamiento de las imágenes adquiridas4. Sin embargo, debido a la absorción y dispersión de fotones, LSFM se ha limitado a las muestras que son ópticamente transparente1o sea unos pocos micrones de espesor.

Las limitaciones de LSFM han conducido a estudios de organismos que tienen los tejidos que son ópticamente transparentes, como el pez cebra. Que implica la diferenciación y desarrollo cardíaco son a menudo estudios en pez cebra ya que hay genes conservados entre los seres humanos y de pez cebra5,6. Aunque estos estudios han llevado a avances en la investigación cardiaca miocardiopatías6,7, todavía hay una necesidad para llevar a cabo investigaciones similares en organismos superiores como los mamíferos.

Tejido cardiaco mamífero presenta un desafío debido al grosor y opacidad de los tejidos, la absorción debido a la hemoglobina en los glóbulos rojos y las bandas que se produce debido a la iluminación de un solo lado de la muestra bajo tradicional LSFM métodos1 , 8. para compensar estas limitaciones, nos propone utilizar iluminación de doble cara y una versión simplificada de la claridad técnica9 combinado con un índice de refracción que solución (bordes). Por lo tanto, este sistema permite la proyección de imagen de una muestra que es mayor que 10 x 10 x 10 mm3 , mientras que mantener una buena calidad de resolución axial y lateral planos8.

Este sistema primero se calibró usando perlas fluorescentes dispuestas en diferentes configuraciones dentro de los tubos de vidrio. Entonces, el sistema fue utilizado para corazones murinos postnatales y adulto de la imagen. En primer lugar, el corazón postnatal del ratón era reflejado en 7 días (P7) a la cavidad ventricular, el espesor de la pared ventricular, las estructuras de la válvula y la presencia de trabeculación. En segundo lugar, se realizó un estudio para identificar las células que se diferencian en cardiomiocitos usando un corazón de ratón después del parto en 1 día (P1) con cardiomiocitos Cre-etiquetados y proteína fluorescente amarilla (YFP). Finalmente, fueron imágenes de ratones adultos a los 7,5 meses para observar la presencia de potasio medular externo renal canales (ROMK) después de la terapia de gene8.

Protocol

Todos los procedimientos que implican el uso de animales han sido aprobados por los comités de revisión institucional (IACUC) en la Universidad de California, Los Ángeles, California. 1. proyección de imagen de configuración del sistema Nota: Ver figura 1 y figura 2. Recuperar láser onda continua (CW) con 3 longitudes de onda: 405 nm, 473 nm y 532 nm. Poner 2 espejos (M1 y M2) 150 mm aparte …

Representative Results

La técnica descrita aquí utiliza un haz de iluminación de doble cara, combinado con una compensación óptica de las muestras de tejido de corazón de ratón para lograr una profundidad de imagen más profunda y mayor volumen de imágenes con suficiente resolución de imagen (figura 1). Para calibrar el sistema, perlas fluorescentes fueron colocados dentro del tubo de vidrio y dentro del sistema de proyección de imagen. Los granos fueron luego reflejados …

Discussion

El sistema de LSFM y técnica descrita aquí utiliza un haz de iluminación de doble cara, combinado con una compensación óptica a imagen del corazón de ratón en etapas de su desarrollo postnatales y adulto. Un haz de iluminación única tradicional sufre de dispersión del fotón y la absorción a través de las muestras de tejido más grueso y más grande de1,3. Las vigas de doble cara ofrecen una iluminación más uniforme de la muestra, reduciendo así el…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a Thao Nguyen y Atsushi Nakano de UCLA para proporcionar la muestra de ratones a la imagen. Este estudio fue apoyado por subvenciones NIH HL118650 (a Tzung K. Hsiai), HL083015 (a Tzung K. Hsiai), HD069305 (y N. C. Chi Tzung K. Hsiai.), HL111437 (a Tzung K. Hsiai y N. C. Chi), HL129727 (a Tzung K. Hsiai), sistema universitario de Texas estrellas financiación (Juhyun Lee).

Materials

CW Laser Laserglow Technologies LMM-GBV1-PF3-00300-05 Excitation of fluorophores
Neutral density filter Thorlabs NDC-50C-4M Controls amount of light entering system
Achromatic beam expander Thorlabs GBE05-A Expands the beam of light
Mechanical slit Thorlabs VA100C Controls width of beam
Beam splitter Thorlabs BS013 Forms dual-illumination beam
Stereo microscope with 1X objective lense Olympus MVX10 Used for observation of sample
ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera Hamamatsu Photonics C11440-42U Used to capture Images
Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) Stratasys uPrint Material used to 3-D print a sample holder
Fluorescent polystyrene beads Spherotech Inc PP-05-10 Used for imaging system calibration
Borosilicate glass tubing Corning Pyrex 7740 Tubing for sample embedding
Glycerol Fisher Scientific BP229-4 Fill for sample chamber
Phosphate-buffered saline Fisher Scientific BP39920 Rinse solution for mouse hearts
Paraformaldehyde Electron microscopy sciences RT-15700 First incubation solution
Acrylamide Wako Chemicals AAL-107 Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts
2,2'-Azobis dihydrochloride Wako Chemicals VA-044 Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts
Sodium dodecyl sulfate  Sigma Aldrich 71725 Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts
Boric acid Fischer Scientific A74-1 Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts
Sigma D2158 Sigma Aldrich D2158 Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution
Tween-20 Sigma Aldrich 11332465001 Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution
Sodium azide Sigma Aldrich S2002 Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution
Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP Vector Biolabs VB2045 Expresses GFP when bound to ROMK
DC Servo Motor Actuator Thorlabs Z825B Used for movement of sample in axial direction within light sheet
K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller Thorlabs KDC101 Connects to motor actuator and controls movement of the actuator
Amira FEI Software N/A Visualization software for producing 2-D and 3-D images

References

  1. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  2. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
  3. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  4. Huisken, J., Stainier, D. Y. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
  5. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
  6. High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).
  7. Sachinidis, A. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
  8. Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Scientific Reports. 7, 42209 (2017).
  9. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  10. Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).
  11. National Heart, L., Blood Institute, . Standard Operating Procedures (SOP’s) for Duchenne Animal Models. , (2015).
  12. Sung, K., et al. Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping. Scientific Reports. 6, 30736 (2016).
  13. Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes. Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).
  14. FEI, . Amira User’s Guide. , 59-138 (2017).
  15. Gao, L., et al. Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit. Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).
  16. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
  17. Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), (2017).

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Cite This Article
Ding, Y., Bailey, Z., Messerschmidt, V., Nie, J., Bryant, R., Rugonyi, S., Fei, P., Lee, J., Hsiai, T. K. Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart. J. Vis. Exp. (139), e57769, doi:10.3791/57769 (2018).

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