Ljus-ark fluorescensmikroskopi för studien av murina hjärtat
Summary
Denna studie använder en dubbelsidig belysning ljus ark fluorescence mikroskopi (LSFM) teknik kombinerat med optisk clearing för att studera murina hjärtat.
Abstract
Ljus-ark fluorescensmikroskopi har använts för snabb bild förvärv med en hög axiell upplösning från mikrometer till millimeter skala. Traditionella ljus ark tekniker innebär användning av en enda belysning stråle riktad vinkelrätt mot vävnadsprover. Bilder av stora prover som produceras med hjälp av en enda belysning balk innehålla ränder eller artefakter och lider av en minskad upplösning tack vare spridningen och ljus absorberas av vävnaden. Denna studie använder en dubbelsidig belysning balk och en förenklad tydlighet optiska clearing teknik för murina hjärtat. Dessa tekniker möjliggör djupare imaging genom att ta bort lipider från hjärtat och producera ett stort fält av imaging, större än 10 x 10 x 10 mm3. Som ett resultat, denna strategi gör det möjligt att kvantifiera de ventrikulära dimensionerna, spåra hjärt härstamning och lokalisera den rumsliga fördelningen av hjärt-specifika proteiner och jonkanaler från den postnatala till vuxen mus hjärtan med tillräcklig kontrast och upplösning.
Introduction
Ljus-ark fluorescensmikroskopi var en teknik som utvecklades först 1903 och används idag som en metod att studera genuttryck och också att producera 3D- eller 4-D modeller av vävnad prover1,2,3. Detta imaging metoden använder en tunn plåt av ljus att lysa upp ett enda plan ett urval så att endast det planet fångas av detektorn. Provet kan då flyttas i axiell riktning-att fånga varje lager, ett avsnitt i taget, och rendera en 3D-modell efter efterbehandling av förvärvade bilder4. Dock på grund av absorption och spridning av fotoner, har LSFM begränsats till prover som är antingen några mikrometer tjock eller optiskt transparent1.
Begränsningar i LSFM har lett till omfattande studier av organismer som har vävnader som är optiskt transparenta, såsom zebrafiskar. Studier på hjärt utveckling och differentiering genomförs ofta zebrafiskar eftersom det finns bevarade gener mellan människor och zebrafiskar5,6. Även om dessa studier har lett till framsteg i hjärt forskning som rör kardiomyopatier6,7, finns det fortfarande ett behov av att genomföra liknande forskning på högre organismer såsom däggdjur.
Hjärt däggdjursvävnader utmaning en på grund av tjockleken och opacitet av vävnad, upptaget på grund av hemoglobin i röda blodkroppar och den striping som uppstår p.g.a. ensidig belysning av provet enligt traditionell LSFM metoder1 , 8. för att kompensera för dessa begränsningar, vi föreslagit att använda dubbelsidiga belysning och en förenklad version av klarhet teknik9 kombinerat med ett brytningsindex på lösningen (fälgar). Detta system möjliggör därför avbildning av ett prov som är större än 10 x 10 x 10 mm3 samtidigt bibehålla en bra upplösning i axiell och laterala plan8.
Detta system var först kalibreras med hjälp av fluorescerande pärlor arrangerade i olika konstellationer inom glas slangen. Systemet användes sedan till bild efter förlossning och vuxen murina hjärtan. Det första fotograferades postnatal mus hjärtat på 7 dagar (P7) att avslöja den ventrikulära kaviteten, tjockleken på ventrikulära väggen, ventil strukturer och förekomsten av trabeculation. För det andra, en studie genomfördes för att identifiera celler som skulle differentieras till hjärtmuskelcellerna genom en postnatal mus hjärtat på 1 dag (P1) med Cre-märkt hjärtmuskelceller och gula fluorescerande protein (YFP). Slutligen var vuxna möss vid 7,5 månader avbildas för att observera förekomsten av nedsatt yttre medullär kalium (ROMK) kanaler efter gen terapi8.
Protocol
Representative Results
Discussion
LSFM system och teknik som beskrivs här använder tredjeparts en dubbelsidig belysning balk kombineras med en optisk clearing till bild mus hjärtat på postnatal och vuxna stadier av sin utveckling. En traditionell enda belysning balk lider photon spridning och absorption genom tjockare och större vävnad prover1,3. Dubbelsidiga balkar ger en mer jämn belysning av provet, vilket minimerar effekten av striping och andra artefakter som ofta ses i bilder som pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill uttrycka tacksamhet till Thao Nguyen och Atsushi Nakano från UCLA för att tillhandahålla möss provet till bild. Denna studie stöddes av bidrag NIH HL118650 (till Tzung K. Hsiai), HL083015 (till Tzung K. Hsiai), HD069305 (till N. C. Chi och Tzung K. Hsiai.), HL111437 (till Tzung K. Hsiai och N. C. Chi), HL129727 (till Tzung K. Hsiai) och University of Texas stjärnor finansiering (till Juhyun Lee).
Materials
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitation of fluorophores |
| Neutral density filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controls amount of light entering system |
| Achromatic beam expander | Thorlabs | GBE05-A | Expands the beam of light |
| Mechanical slit | Thorlabs | VA100C | Controls width of beam |
| Beam splitter | Thorlabs | BS013 | Forms dual-illumination beam |
| Stereo microscope with 1X objective lense | Olympus | MVX10 | Used for observation of sample |
| ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images |
| Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) | Stratasys | uPrint | Material used to 3-D print a sample holder |
| Fluorescent polystyrene beads | Spherotech Inc | PP-05-10 | Used for imaging system calibration |
| Borosilicate glass tubing | Corning | Pyrex 7740 | Tubing for sample embedding |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Fill for sample chamber |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP39920 | Rinse solution for mouse hearts |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | RT-15700 | First incubation solution |
| Acrylamide | Wako Chemicals | AAL-107 | Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts |
| 2,2'-Azobis dihydrochloride | Wako Chemicals | VA-044 | Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | 71725 | Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts |
| Boric acid | Fischer Scientific | A74-1 | Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution |
| Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Expresses GFP when bound to ROMK |
| DC Servo Motor Actuator | Thorlabs | Z825B | Used for movement of sample in axial direction within light sheet |
| K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Connects to motor actuator and controls movement of the actuator |
| Amira | FEI Software | N/A | Visualization software for producing 2-D and 3-D images |
References
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
- High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).
- Sachinidis, A. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Scientific Reports. 7, 42209 (2017).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).
- National Heart, L., Blood Institute, . Standard Operating Procedures (SOP’s) for Duchenne Animal Models. , (2015).
- Sung, K., et al. Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping. Scientific Reports. 6, 30736 (2016).
- Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes. Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).
- FEI, . Amira User’s Guide. , 59-138 (2017).
- Gao, L., et al. Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit. Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), (2017).
