Microscopia de fluorescência de luz-folha para o estudo do coração murino
Summary
Este estudo utiliza uma técnica de microscopia (LSFM) de fluorescência de luz-folha de iluminação dupla face combinada com compensação óptica para estudar o coração murino.
Abstract
Microscopia de fluorescência de luz-folha tem sido amplamente utilizada para aquisição de imagem rápida com uma alta resolução axial de micrômetro milímetro escala. Técnicas tradicionais de luz-folha envolvem o uso de um feixe único de iluminação direcionado ortogonalmente no tecido da amostra. Imagens de grandes amostras que são produzidas usando um feixe de iluminação único contêm listras ou artefatos e sofrem uma resolução reduzida devido à dispersão e absorção da luz pelo tecido. Este estudo utiliza um feixe de iluminação dupla face e uma clareza simplificada óptica técnica para o coração de murino de compensação. Estas técnicas permitem mais profunda de imagem removendo lipídios do coração e produzem um grande campo de imagem, maior que 10 x 10 x 10 mm3. Como resultado, esta estratégia permite-nos quantificar as dimensões ventriculares, a linhagem cardíaca de rastrear e localizar a distribuição espacial de proteínas específicas do cardíaco e canais iônicos do pós-natal para corações de rato adulto com contraste suficiente e resolução.
Introduction
Microscopia de fluorescência de luz-folha foi uma técnica desenvolvida pela primeira vez em 1903 e é usada hoje como um método para estudar a expressão gênica e, também, para produzir modelos 3-d ou 4-D, de amostras de tecido a1,2,3. Este método de imagem usa uma folha fina de luz para iluminar um único avião de uma amostra para que só aquele avião é capturado pelo detector. A amostra então pode ser movida na direção axial para capturar cada camada, uma seção de cada vez e processar um modelo 3D após o pós-processamento das imagens adquiridas4. No entanto, devido à absorção e espalhamento de fótons, LSFM tem sido limitada a amostras ou alguns microns de espessura ou são opticamente transparente1.
As limitações do LSFM têm levado a estudos extensivos de organismos que têm tecidos que são opticamente transparentes, como o peixe-zebra. Estudos envolvendo a diferenciação e desenvolvimento cardíaco são frequentemente realizados em zebrafish desde que existem genes conservados entre humanos e zebrafish5,6. Embora estes estudos conduziram a avanços na investigação cardíaca relacionada com cardiomiopatias6,7, ainda há uma necessidade de realizar pesquisas semelhantes em organismos de nível mais alto como mamíferos.
Mamíferos tecido cardíaco apresenta um desafio devido à espessura e opacidade do tecido, a absorção devido à hemoglobina nos glóbulos vermelhos e a distribuição que ocorre devido a iluminação em um lado da amostra sob tradicionais métodos LSFM1 , 8. para compensar estas limitações, propusemo-na usar uma versão simplificada da clareza técnica9 combinado com um índice de refração correspondente solução (aros) e iluminação de duas faces. Portanto, este sistema permite a imagem de uma amostra que é maior que 10 x 10 x 10 mm3 enquanto manter uma boa qualidade resolução axial e lateral aviões8.
Este sistema foi primeiro calibrado usando grânulos fluorescentes dispostos em diferentes configurações dentro do tubo de vidro. Em seguida, o sistema foi usado a imagem corações murino pós-natal e adultas. Primeiro, o coração de rato pós-natal foi fotografado em 7 dias (P7) para revelar a cavidade ventricular, a espessura da parede ventricular, as estruturas de válvula e a presença de trabeculação. Em segundo lugar, foi realizado um estudo para identificar as células que se diferenciam em cardiomyocytes usando um coração de rato pós-natal no dia 1 (P1) com Cre-rotulado cardiomyocytes e proteína fluorescente amarela (YFP). Finalmente, foram imagens de ratos adultos em 7,5 meses para observar a presença de potássio medular externa renal canais (ROMK) após a terapia de gene8.
Protocol
Representative Results
Discussion
O sistema LSFM e a técnica descrita aqui utiliza um feixe de iluminação dupla face combinado com uma clareira óptica a imagem do coração de rato em pós-natal e adultos fases do seu desenvolvimento. Um feixe de iluminação único tradicional sofre de espalhamento do fóton e absorção através de de1,de amostras de tecido mais grosso e maior3. As duas faces de vigas fornecem uma iluminação mais uniforme da amostra, minimizando assim o efeito de distribu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de expressar gratidão ao Thao Nguyen e Atsushi Nakano da UCLA para o fornecimento da amostra de ratos a imagem. Este estudo foi suportado por estrelas de bolsas NIH HL118650 (para Tzung K. Hsiai), HL083015 (para Tzung K. Hsiai), HD069305 (para N. C. Chi e Tzung K. Hsiai.), HL111437 (para Tzung K. Hsiai e N. C. Chi), HL129727 (para Tzung K. Hsiai) e sistema de Universidade do Texas, financiamento (a Quélen Lee).
Materials
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitation of fluorophores |
| Neutral density filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controls amount of light entering system |
| Achromatic beam expander | Thorlabs | GBE05-A | Expands the beam of light |
| Mechanical slit | Thorlabs | VA100C | Controls width of beam |
| Beam splitter | Thorlabs | BS013 | Forms dual-illumination beam |
| Stereo microscope with 1X objective lense | Olympus | MVX10 | Used for observation of sample |
| ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images |
| Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) | Stratasys | uPrint | Material used to 3-D print a sample holder |
| Fluorescent polystyrene beads | Spherotech Inc | PP-05-10 | Used for imaging system calibration |
| Borosilicate glass tubing | Corning | Pyrex 7740 | Tubing for sample embedding |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Fill for sample chamber |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP39920 | Rinse solution for mouse hearts |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | RT-15700 | First incubation solution |
| Acrylamide | Wako Chemicals | AAL-107 | Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts |
| 2,2'-Azobis dihydrochloride | Wako Chemicals | VA-044 | Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | 71725 | Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts |
| Boric acid | Fischer Scientific | A74-1 | Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution |
| Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Expresses GFP when bound to ROMK |
| DC Servo Motor Actuator | Thorlabs | Z825B | Used for movement of sample in axial direction within light sheet |
| K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Connects to motor actuator and controls movement of the actuator |
| Amira | FEI Software | N/A | Visualization software for producing 2-D and 3-D images |
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