Murine दिल के अध्ययन के लिए लाइट-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
Summary
इस अध्ययन के एक दोहरे तरफा रोशनी प्रकाश चादर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (LSFM) ऑप्टिकल समाशोधन के साथ संयुक्त तकनीक murine दिल का अध्ययन करने के लिए उपयोग करता है ।
Abstract
प्रकाश चादर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी व्यापक रूप से माइक्रोमीटर मिलीमीटर पैमाने से एक उच्च अक्षीय संकल्प के साथ तेजी से छवि अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया गया है । पारंपरिक प्रकाश चादर तकनीक नमूना ऊतक पर orthogonally निर्देशित एक एकल रोशनी बीम का उपयोग शामिल है । बड़े नमूनों है कि एक एकल दीप्ति बीम का उपयोग कर उत्पादित कर रहे हैं की छवियाँ धारियों या कलाकृतियों होते हैं और ऊतक के द्वारा प्रकाश के बिखरने और अवशोषण के कारण एक कम संकल्प से पीड़ित हैं. इस अध्ययन के एक दोहरे तरफा रोशनी बीम और murine दिल के लिए एक सरल स्पष्टता ऑप्टिकल समाशोधन तकनीक का उपयोग करता है । इन तकनीकों गहरी इमेजिंग के लिए दिल से लिपिड को दूर करने और इमेजिंग, 10 x 10 x 10 मिमी3से अधिक की एक बड़ी क्षेत्र का उत्पादन द्वारा अनुमति देते हैं । नतीजतन, यह रणनीति हमें वेंट्रिकुलर आयामों को बढ़ाता है, कार्डियक वंश को ट्रैक करती है, और हृदय के विशिष्ट प्रोटीन और आयन-चैनलों के स्थानिक वितरण के बाद प्रसव के लिए पर्याप्त कंट्रास्ट के साथ वयस्क माउस दिलों को स्थानीयकृत और संकल्प.
Introduction
लाइट-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एक तकनीक पहले १९०३ में विकसित किया गया था और आज जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए एक विधि के रूप में प्रयोग किया जाता है और यह भी 3 डी या 4 ऊतक नमूने1,2,3के डी मॉडल का उत्पादन करने के लिए. इस इमेजिंग विधि प्रकाश की एक पतली चादर का उपयोग करता है एक नमूना के एक विमान इतना रोशन है कि केवल कि विमान डिटेक्टर द्वारा कब्जा कर लिया है । नमूना तो प्रत्येक परत पर कब्जा करने के लिए अक्षीय-दिशा में ले जाया जा सकता है, एक समय में एक अनुभाग, और प्राप्त4के बाद प्रसंस्करण के बाद एक 3-डी मॉडल रेंडर. हालांकि, अवशोषण और फोटॉनों के बिखरने के कारण, LSFM नमूने है कि या तो कुछ माइक्रोन मोटी या ऑप्टिकली पारदर्शी1रहे है करने के लिए सीमित किया गया है ।
LSFM की सीमाएं जीवों के व्यापक अध्ययन है कि ऊतकों कि ऑप्टिकली पारदर्शी हैं, जैसे zebrafish के लिए नेतृत्व किया है । हृदय विकास और भेदभाव को शामिल अध्ययन अक्सर zebrafish पर आयोजित के बाद से वहां मनुष्यों और zebrafish के बीच जीन संरक्षित कर रहे है5,6। हालांकि इन अध्ययनों से cardiomyopathies6,7से संबंधित कार्डिएक अनुसंधान में प्रगति के लिए नेतृत्व किया है, वहां अभी भी एक ऐसे स्तनधारियों के रूप में उच्च स्तर के जीवों पर इसी तरह के अनुसंधान का संचालन करने की आवश्यकता है ।
स्तनधारी कार्डियक ऊतक मोटाई और ऊतक की अस्पष्टता के कारण एक चुनौती प्रस्तुत करता है, लाल रक्त कोशिकाओं में हीमोग्लोबिन के कारण अवशोषण, और पट्टी कि पारंपरिक LSFM तरीकों के तहत नमूना के एक तरफा रोशनी के कारण होता है1 , 8. इन सीमाओं के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, हम दोहरे तरफा रोशनी और एक अपवर्तन सूचकांक मिलान समाधान (रिम्स) के साथ संयुक्त स्पष्टता तकनीक9 का एक सरलीकृत संस्करण का उपयोग करने का प्रस्ताव. इसलिए, यह सिस्टम एक नमूना है कि 10 x 10 x 10 मिमी3 से अधिक है के लिए इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, जबकि अक्षीय और पार्श्व विमानों में एक अच्छी गुणवत्ता संकल्प बनाए रखने8।
इस प्रणाली को पहले फ्लोरोसेंट मोती कांच टयूबिंग के भीतर विभिंन विंयास में व्यवस्था का उपयोग करने पर तुले थे । फिर, प्रणाली के बाद प्रसव और वयस्क murine दिल छवि के लिए इस्तेमाल किया गया था । सबसे पहले, प्रसव के बाद माउस दिल 7 दिन (P7) में imaged था वेंट्रिकुलर गुहा, वेंट्रिकुलर दीवार की मोटाई, वाल्व संरचनाओं, और trabeculation की उपस्थिति प्रकट करते हैं । दूसरे, एक अध्ययन के लिए कोशिकाओं है कि cardiomyocytes में 1 दिन (P1) Cre के साथ-cardiomyocytes और पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) लेबल के बाद प्रसव का उपयोग करके अंतर होगा की पहचान करने के लिए आयोजित किया गया था । अंत में, ७.५ महीने में वयस्क चूहों जीन थेरेपी8के बाद गुर्दे की बाहरी दिमाग़ी पोटेशियम (ROMK) चैनलों की उपस्थिति का पालन करने के लिए imaged थे ।
Protocol
Representative Results
Discussion
LSFM प्रणाली और तकनीक यहां वर्णित एक दोहरे तरफा रोशनी छवि को ऑप्टिकल समाशोधन के साथ संयुक्त बीम के बाद प्रसव और उसके विकास के वयस्क चरणों का इस्तेमाल करता है । एक पारंपरिक एकल रोशनी बीम मोटा और बड़ा ऊतक नम?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों छवि के लिए चूहों के नमूने प्रदान करने के लिए UCLA से थाओ गुयेन और अतसुशी Nakano के लिए आभार व्यक्त करना चाहते हैं । इस अध्ययन को पलाश NIH HL118650 (Tzung K. Hsiai) द्वारा समर्थित किया गया था, HL083015 (ते Tzung k. Hsiai), HD069305 (to N. C. ची आणि Tzung k. Hsiai.), HL111437 (to Tzung k. Hsiai और n. c. ची), HL129727 (to Tzung k. Hsiai), और टेक्सास प्रणाली के सितारे वित्त पोषण (को Juhyun ली).
Materials
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitation of fluorophores |
| Neutral density filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controls amount of light entering system |
| Achromatic beam expander | Thorlabs | GBE05-A | Expands the beam of light |
| Mechanical slit | Thorlabs | VA100C | Controls width of beam |
| Beam splitter | Thorlabs | BS013 | Forms dual-illumination beam |
| Stereo microscope with 1X objective lense | Olympus | MVX10 | Used for observation of sample |
| ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images |
| Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) | Stratasys | uPrint | Material used to 3-D print a sample holder |
| Fluorescent polystyrene beads | Spherotech Inc | PP-05-10 | Used for imaging system calibration |
| Borosilicate glass tubing | Corning | Pyrex 7740 | Tubing for sample embedding |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Fill for sample chamber |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP39920 | Rinse solution for mouse hearts |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | RT-15700 | First incubation solution |
| Acrylamide | Wako Chemicals | AAL-107 | Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts |
| 2,2'-Azobis dihydrochloride | Wako Chemicals | VA-044 | Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | 71725 | Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts |
| Boric acid | Fischer Scientific | A74-1 | Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution |
| Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Expresses GFP when bound to ROMK |
| DC Servo Motor Actuator | Thorlabs | Z825B | Used for movement of sample in axial direction within light sheet |
| K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Connects to motor actuator and controls movement of the actuator |
| Amira | FEI Software | N/A | Visualization software for producing 2-D and 3-D images |
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