Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (smFISH) ניתוח הנצה גידול וגטטיבי שמרים, מיוזה

Published: May 25, 2018 doi: 10.3791/57774
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Molecular and Cell Biology, Barker Hall, University of California, Berkeley, 2Department of Molecular and Cell Biology, Li Ka Shing Center, University of California, Berkeley

Summary

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת בחיי עיר הכלאה הפרוטוקול ממוטבת כדי לכמת את מספר מולקולות RNA בניצני שמרים במהלך גידול וגטטיבי, מיוזה.

Abstract

קרינה פלואורסצנטית הכלאה בחיי עיר מולקולה בודדת (smFISH) היא טכניקה חזקה ללמוד ביטוי גנים בתאים יחיד בשל יכולתה לזהות ולספור מולקולות RNA בודדים. משלימה לשיטות המבוססת על רצף עמוק, smFISH מספק מידע על וריאציית לתא בשפע התעתיק ולוקליזציה subcellular של RNA נתון. לאחרונה, השתמשנו smFISH ללמוד את הביטוי של הגן NDC80 במהלך המיוזה בניצני שמרים, בתעתיק שני אילו איזופורמים קיים ויש isoform קצר תעתיק רצף כולו שלו שיתף את isoform ארוך. בביטחון לזהות כל isoform התעתיק, אנחנו ממוטב smFISH הידוע הפרוטוקולים והשיג בעקביות גבוהה ואיכות smFISH נתונים על הדגימות שנרכש במהלך ניצני שמרים מיוזה. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול ממוטבת, הקריטריונים שבהם אנו משתמשים כדי לקבוע אם מתקבל באיכות גבוהה של נתונים smFISH ולאחר כמה טיפים ליישום פרוטוקול זה זני שמרים ותנאי גידול אחרים.

Introduction

דינמי בקרת גנים כוננים הפיתוח של אורגניזם, כמו גם את תגובתה עקה, זיהום, שינויים בחילוף החומרים. מחקרים המתמקדים תקנה תעתיק להסתמך על טכנולוגיות המודדים RNA שפע. שיטה אחת כזו, כינה פלורסצנטיות הכלאה בחיי עיר מולקולה בודדת (smFISH), משמשת לצורך זיהוי של מולקולות RNA בודדים תאים בודדים1,2. שיטה זו מאפשרת מדידה של מידת ההשתנות לתא בביטוי הגנים והנחישות של לוקליזציה RNA תאיים.

בשיטה smFISH הנפוצות ביותר, דורש זיהוי מולקולת ה-RNA בודדים מרובים קצר DNA רגשים (לעיתים קרובות ~ 48 20-מר הגששים) כי הם משלימים אל המטרה RNA הם מצומדת כדי לצבוע פלורסנט באותו. איגוד של בדיקה ניאון יחיד התוצאה היא האות חלש, אך האות מהאנסמבל של כל את הגששים חזקים. תכונה זו משפר באופן משמעותי את יחס אות לרעש, כי אף-על-פי בדיקה אחת בנוסח מחייב את המטרה, אות כזה צפוי להיות חלש מאוד לעומת זו של יעד מולקולת רנ א3. בתוך שגיאה של זיהוי, מספר מולקולות RNA יכול להיות נספרים, בהשוואה על פני תנאי הגידול השונות ובקרב מוטציות שונות.

מאז פיתוח הראשון, smFISH הותאם ללמוד היבטים שונים של ג'ין הביטוי4, כגון שעתוק התארכות1,2, החדרת5,6, תעתיק מתפוצץ7 , 8 , 9, תאיים ביטוי allelic10,11,12, ו- RNA לוקליזציה13,14,15. לאחרונה, אנחנו השתמשו בשיטה זו כדי ללמוד את הביטוי של שתי התמליל איזופורמים של אותו גן, שבו התעתיק קצר isoform (NDC80ORF) יש רצף כולו שלו שיתף את isoform ארוך (NDC80luti )16. כדי לזהות באופן ייחודי את איזופורמים mRNA שני, היינו שתי ערכות בדיקה: קבוצה אחת היא ספציפית רצף ייחודי של NDC80luti, ומאגד הסט השני, מצומדת כדי עוד הפלורסנט, לאזור משותף שני איזופורמים. NDC80luti RNA מזוהה כמו כתם colocalized עם שני אותות פלואורסצנט, ואילו NDC80ORF RNA היא זו מכילה רק את האות מ ערכת בדיקה. מאז המספר NDC80ORF תעתיקים מחושבת באמצעות שיטת "חיסור", יעילות גבוהה של בדיקה הכלאה, יחס אות לרעש גבוה יש צורך בביטחון לזהות כתמים smFISH ולהפחית את השגיאה הפצת.

מאמר זה מתאר פרוטוקול ממוטבים לביצוע smFISH של שמרים ניצני האפייה. ב פרוטוקול זה, מספר הטלפון הנייד, קיבוע זמן, זמן עיכול, מערכת העיכול מאגר, בדיקה לריכוז הכלאה מאגר המשמש את הניסויים smFISH אופטימציה להצגה SK1 זן הרקע של cerevisiae ס שעברו וגטטיבי צמיחה או מיוזה. עם זאת, אנחנו גם לציין בכתב יד זה: (1) השיטה כדי לבדוק את איכות הנתונים smFISH לאחר ייבוא תמונות, ושלבים (2) בפרוטוקול שיחייבו נוספים מיטוב עבור רקעים זן שונה, תנאי הגידול.

Protocol

הערה: כל המאגרים ואמצעי התקשורת בשימוש פרוטוקול זה מפורטים בטבלה1. פרטי הספק של ריאגנטים רשום את הטבלה של חומרים.

יום 1/יום 1-2:

הערה: עבור תרבות וגטטיבי, לגדול תאים יתר600 של 0.4-0.6 במדיום המועדפת. תרבות meiotic, לגרום לתאים עוברים מיוזה בשיטה המועדפת (בדרך כלל culturing ב יתר600 של 1.85).

1. לטעום קיבוע ועיכול

  1. לתקן את סך של ~3.5 OD600 של תאים ב- 3% פורמלדהיד.
    1. לתרבות וגטטיבי, להוסיף 5.52 מ"ל של תרבות µL 480 של 37% פורמלדהיד צינורות חרוט 15-mL.
    2. תרבות meiotic, להוסיף 1840 µL התרבות µL 160 פורמלין 37% 2-mL microcentrifuge צינורות. היפוך ~ 5 פעמים כדי לערבב.
      התראה: פורמלדהיד הוא רעיל. לטפל ולחסל לפי תקנות מוסדיים.
  2. במקום צינורות על תוף רולר בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. עבור דגימות meiotic, לאחר תיקון בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות, להמשיך לתקן בן לילה הלעפה תרוטרפמט 4, סיבוב.
    הערה: הקיבעון לילה מגבירה את הפארמצבטית ואיכות הנתונים smFISH השיג עבור דגימות meiotic. צריך להיות מותאם זמן קיבעון.
  3. בעוד הדגימות מטפלים, להפשיר 200 מ"מ Vanadyl Ribonucleoside תסביכים (VRC)-65 הלעפה תרוטרפמט לפחות 10 דקות.
  4. להכין מיקס מאסטר עיכול בשפופרת 15-מ ל: עבור מדגם 1, מערבבים µL 425 מ B מאגר עם 40 µL של 200 מ מ VRC (התחמם עד 65 הלעפה תרוטרפמט); לקבלת דוגמאות 5, מערבבים 2125 µL של B מאגר עם µL 200 מ מ 200 VRC (התחמם עד 65 הלעפה תרוטרפמט). מערבולת ~ 5 s כדי באופן מלא resuspend את VRC לפני הוספת לתערובת הראשית, אשר תופיע ירוק חום בהיר לאחר VRC תוספת.
    הערה: תוספת של VRC במהלך עיכול משפר מרקם של תוצאות smFISH, פוטנציאל על ידי עיכוב את הזיהום נוקלאז שהציג את התערובת zymolyase, אשר מטוהר מכל תמצית גולמי. צריך להיות מותאם כמות VRC נדרש בשלב זה.
  5. לקבלת דוגמאות וגטטיבי, centrifuge הצינורות ב g x ~ 1057 למשך 3 דקות. לקבלת דוגמאות meiotic (לאחר קיבוע לילה), צנטריפוגה-21,000 g x עבור 1.5 מינימלית Decant או תשאף את תגובת שיקוע פורמלדהיד לטמיון.
    הערה: כל השלבים צנטריפוגה מבוצעות בטמפרטורת החדר.
  6. Resuspend התאים ב- 1.5 מ ל B מאגר קר על-ידי pipetting למעלה ולמטה או היפוך הצינורות, כקבוצה – עלים לערבב. העברת דגימות צמח צינורות 2-mL לאחר resuspension.
  7. צנטריפוגה ב 21,000 x g עבור 1.5 מינימלית להסיר את עיקר הנוזל על ידי השאיפה ואקום או pipetting, משאיר מאחור ~ 100 µL.
  8. Resuspend התאים 1.5 מ ב מאגר קר
  9. צנטריפוגה ב 21,000 x g עבור 1.5 מינימלית להסיר את עיקר הנוזל על ידי השאיפה ואקום או pipetting, משאיר מאחור ~ 100 µL.
  10. Resuspend התאים ב- 1.5 מיליליטר קר מאגר ב צנטריפוגה ב 21,000 x g עבור 1.5 מינימלית וביופסיה הנוזל לחלוטין על ידי ואקום או pipetting.
  11. Resuspend תאים µL 425 מיקס מאסטר עיכול, בקצרה מערבולת כדי resuspend. להוסיף 5 µL של zymolyase 10 מ"ג/מ"ל 100T כל שפופרת.
    הערה: מערבולת zymolyase בכל פעם לפני הוספת הצינורות. להוסיף zymolyase כל שפופרת בנפרד, במקום להוסיף לתערובת הראשית. שני צעדים לעזור לשמור על מערכת העיכול עקביות בין צינורות כי zymolyase ארגונייט שוקע במהירות.
  12. מערבולת 2-3 s לערבב. מקם את הצינורות על תוף רולר ולאחר לעכל-30 הלעפה תרוטרפמט למשך 15-30 דקות. תאי צמח, meiotic בשלבים המוקדמים, זה בדרך כלל לוקח ~ 15 דקות, meiotic prophase, meiotic חטיבות, זה בדרך כלל לוקח ~ 30 דקות.
    הערה: לבדוק במיקרוסקופ כל 5 דקות אחרי 15 דקות, ולהפסיק את העיכול כאשר ~ 80% של תאים מופיעות שאינם שקופים-השבירה. מנקודה זו ואילך, התאים הם מאוד שבירים. להתמודד עם תאים בעדינות וכדי להימנע משימוש השאיפה ואקום או vortexing.
  13. Centrifuge הצינורות ב g x ~ 376 במשך 3 דקות להסיר את הנוזל לחלוטין על-ידי pipetting.
  14. בעדינות resuspend תאים עם 1 מ"ל של מאגר B על ידי pipetting 1 - 2 פעמים למעלה ולמטה כדי לערבב.
  15. Centrifuge הצינורות ב g ~ 376 x עבור 3 מינימלית נוזל B מאגר להסיר על-ידי pipetting. Resuspend בעדינות תאים 1 מ"ל אתנול 70% (מדולל עם מים ללא RNase).
  16. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3.5-4 שעות.

2. הכלאה

  1. להביא formamide בטמפרטורת החדר (עבור aliquot 50-mL, זה לוקח ~ 30 דקות באמבט מים).
    הערה: אל תפתח את הבקבוק formamide עד הבקבוק מגיע לטמפרטורת החדר כדי למנוע חמצון של formamide.
    התראה: Formamide הוא רעיל. לטפל ולחסל לפי תקנות מוסדיים.
  2. הכינו 10% formamide שטיפת מאגר צינור חרוטי 15-mL.
  3. Centrifuge הצינורות ב g x ~ 376 במשך 3 דקות 500 להסיר µL של 70% אתנול על-ידי pipetting. בעדינות pipet למעלה ולמטה כדי resuspend התאים הנותרים ולאחר מכן להעביר את התאים נמוך-אדהזיה צינורות.
    הערה: באמצעות צינורות אדהזיה נמוך מאוד מפחית איבוד תאים במהלך שוטף עוקבות.
  4. Centrifuge צינורות שוב ב g ~ 376 x עבור 3 מינימלית הסר כל האתנול על-ידי pipetting.
  5. להוסיף 1 מ"ל של 10% formamide שטיפת מאגר, ובעדינות pipet למעלה ולמטה 2 - 3 פעמים כדי resuspend את התאים.
  6. לאפשר את התאים לשבת בטמפרטורת החדר למשך ~ 20 דקות בעת הכנת הפתרון הכלאה. עבור מדגם 1, מערבבים 50 µL הכלאה מאגר (חדר הזמנית), 5 µL של 200 מ מ VRC (התחמם עד 65 הלעפה תרוטרפמט) ו- µL 1 של כל בדיקה (200 ננומטר הסופי). לקבלת דוגמאות 5, מערבבים 250 µL הכלאה מאגר (חדר הזמנית), µL 25 מ מ 200 VRC (התחמם עד 65 הלעפה תרוטרפמט) ו- 5 µL של כל בדיקה (200 ננומטר הסופי).
    1. הפשרת הכלאה מאגר (קפוא ב-20 הלעפה תרוטרפמט) לטמפרטורת החדר לפני פתיחת צינור כדי למנוע חמצון formamide.
    2. לאחר הוספת את 200 מ"מ VRC, מערבולת עבור 5-10 s לפני הוספת את הגששים, אשר תוכנן, שנרכשו באופן מסחרי, מחדש בהתאם להוראות היצרן.
    3. אם שני רגשים שיתוף incubated, להוסיף 1 µL של ה-1:10 לדילול המניות בדיקה #1, כמו גם µL 1 של ה-1:10 דילול של המניה בדיקה #2, כדי לגרום לדילול הסופית ~ שבערך עבור בדיקה או. הריכוז הדרוש עבור יחס אות לרעש בצורה הטובה ביותר צריך להיות מותאם (ראה דיון לפרטים).
  7. Centrifuge הדגימות-g x ~ 376 עבור 3 מינימלית הסר את תגובת שיקוע לתוך. פסולת מסוכנת על-ידי pipetting.
  8. הוסף לפחות 50 µL של הכלאה פתרון כל שפופרת. קפיצי הצינורות לערבב.
  9. תקופת דגירה-30 הלעפה תרוטרפמט על תוף רולר לפחות 16 שעות בחושך.

יום 2/יום 3

3. שטיפת והדמיה

  1. להביא formamide בטמפרטורת החדר.
  2. הכינו 10% formamide שטיפת מאגר (FWB) צינור חרוטי 15-mL.
  3. להסיר את הצינורות רולר התוף ולמקם אותם לתוך תיבת מכוסה בנייר כסף כדי להגן מפני אור.
  4. Centrifuge הדגימות-g x ~ 376 עבור 3 מינימלית הסר את תגובת שיקוע לתוך. פסולת מסוכנת על-ידי pipetting.
  5. Resuspend ב 1 מ"ל של 10% FWB מאת בעדינות pipetting למעלה ולמטה 2 - 3 פעמים.
  6. דגירה-30 הלעפה תרוטרפמט במשך 30 דקות (לא סיבוב) בתיבת מכוסה בנייר כסף.
  7. Centrifuge את הדגימות ב g x ~ 376 במשך 3 דקות להסיר את תגובת שיקוע על פסולת מסוכנת על-ידי pipetting, µL ~ 50 תעזוב.
  8. . בינתיים, מכינים דאפי/FWB צינור חרוטי 15-מ ל: עבור מדגם 1, מערבבים 1000 µL 10% formamide שטיפת מאגר עם µL 1 של 5 מ"ג/מ"ל דאפי. לקבלת דוגמאות 10, מערבבים 10 מ ל 10% formamide שטיפת מאגר עם 10 µL של 5 מ"ג/מ"ל דאפי. Resuspend ב 1 מ"ל של דאפי/FWB מאת בעדינות pipetting למעלה ולמטה 2 - 3 פעמים.
  9. דגירה-30 הלעפה תרוטרפמט במשך 30 דקות (לא סיבוב) בתיבת מכוסה בנייר כסף.
  10. הפשרת אקונומיקה נגד ריאגנטים על קרח.
  11. Centrifuge הדגימות-g x ~ 376 עבור 3 מינימלית הסר את תגובת שיקוע לחלוטין על-ידי pipetting. אם יש צורך, צנטריפוגה שוב כדי להסיר כל תגובת שיקוע.
  12. לקבלת דוגמאות זה לא תמונה מיד, resuspend בגדר ב- 50 µL של מאגר GLOX ללא אנזימים. Pipet למעלה ולמטה 3 - 4 פעמים כדי לערבב.
    1. לשמור כל הדגימות unimaged בתיבת מכוסה בנייר כסף-הלעפה תרוטרפמט 4 עד מוכן לתמונה. כאשר מוכנים תמונה, centrifuge את הדגימות ב g x ~ 376 למשך 2 דקות, להסיר את תגובת שיקוע לחלוטין על-ידי pipetting. Resuspend ב GLOX עם אנזימים כמפורט להלן.
  13. לקבלת דוגמאות להיות עם תמונה באופן מיידי, להוסיף 15-20 µL GLOX מאגר עם אנזימים. בעדינות pipet למעלה ולמטה כדי לערבב.
    הערה: אמצעי האחסון הוסיף יכול להשתנות בהתאם לגודל בגדר התא. אנו ממליצים resuspending בגדר ב µL 15 GLOX מאגר עם אנזימים, לבדוק את צפיפות התאים במיקרוסקופ. אם תאים צפופים מדי (תאים clumping אחד מעל השני), להוסיף מאגר נוסף GLOX עם אנזימים. אם תאים דליל מדי, centrifuge את הדגימה ולהסיר ~ 5 µL של המאגר.
  14. Pipet 5 µL אל coverslip (18 מ מ x 18 מ מ, מס ' 1), ולשים coverslip בשקופית.
  15. לשים מחיקה מעבדה על גבי השקופית איפה מניחים את coverslip. לחץ בעדינות על המחיקה מעבדה כדי להגדיר שקופיות (צריך לראות נוזלי יורד מכל ארבעה קצוות coverslip).
  16. להעביר את השקופית לחדר מיקרוסקופ בתוך קופסה מכוסה על ידי רדיד אלומיניום.
  17. תמונה באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב זריחה עם הגדלה גבוהה (60-100 X) מפתח נומרי גבוהה.
    הערה: כדי לאסוף את המספר המקסימלי של הפוטונים הנפלטים על ידי הגששים smFISH, מיקרוסקופ קונפוקלי אינם מומלצים, כפי שהם להגביל באופן משמעותי את כמות האור להיות שנאספו. כאן, נאספו הנתונים על מיקרוסקופ מצויד 100 X, המטרה נה 1.4, באמצעות מסננים CY5 (EX632/22, EM679/34) עם תמונה-1.3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100% T; ודאפי (EX390/18, EM435/48), 0.05-0.1 s, ט 32-50% כדאי גם לרכוש תמונת ייחוס בהיר-שדה. לרכוש 15-25 פרוסות עם גודל צעד של 0.1-0.2 µm, מ לחלוטין מתחת המוקד של שדה הראייה כדי לחלוטין לעיל, על מנת להבטיח כי כל המקומות RNA התפקדו.

4. תמונות ניתוח

  1. לנתח את הנתונים smFISH עם כלי ניתוח smFISH שפורסמו כגון דגים-חשבים17 ו- StarSearch2, או עם תוכניות בהזמנה אישית, בהתאם לדרישות המדויקות של הניסוי.
    הערה: צינור ניתוח טוב צריך לאפשר למשתמשים לקבוע סף כדי להפריד בין המקומות RNA נכון מהרקע, פלט נתונים סטטיסטיים כגון הקואורדינטות X, Y ו- Z (אופציונלי), את העוצמה של כל מקום, מספר המקומות בכל תא , והתאמת ואולי פרמטרים כדרך לסנן גילויים שווא.

Representative Results

כדי להעריך עד כמה smFISH פרוטוקול עבד (מחולקת לרמות ב איור 1), עיצבנו ערכה של הגששים 54 זה אריח את מסגרת קריאה פתוחה של הגן NDC80 (איור 2 א, העליון). המכשיר ממוקם בקצה ביותר 5' נחשבת בדיקה 1; בפעם הבאה, בדיקה 2; והשלישית, בדיקה 3, ועוד. הגששים 27 שהוקצו מוזר מספר (בדיקה 1, 3, 5...) הם כל מצומדת כדי הפלורסנט קאל עבור חיל הים 590 (CF590); הגששים 27 מוקצה מספר זוגי (בדיקה 2, 4, 6...), מצומדת כדי הפלורסנט קוואזר 670 (Q670). לפיכך, ערכות בדיקה לסירוגין אלה מכונים לעתים קרובות כמו הגששים "זוגי/אי זוגי". על הכלאה, שתי קבוצות בדיקה צריך לסמן את התעתיק אותו.

לאחר זיהוי ספוט, השתמשנו כמה מדידות לשפוט את האיכות של ערכת הנתונים smFISH. הראשון היה התואר ואיכות colocalization עבור הגששים זוגי/אי זוגי. במקרה שלנו, כאשר 88% ממחזור כל המקומות smFISH colocalized (2A ו- 2B), עם יותר מ 95% של כתמים לזווג 2 פיקסלים מקו אחד לשני (איור 2C, מזווג), אשר נמצאים ערך צפוי לתת בכל כרומטית, זיהוי סטייה בין שני הערוצים פלורסנט. לשם השוואה, פחות מ 10% מקומות אינטראקצית היו הקרוב-השכן במרחק של פחות מ-2 פיקסלים, מראה כי ההסתברות של misidentifying זוג ספוט הוא נמוך (איור 2C). % 12 מקומות אינטראקצית חולקו באופן שווה בין שני הערוצים (איור 2B, השווה CF590 בלבד עם Q670 בלבד); לכן, הגענו למסקנה כי עבור גן 2.4 kb זה עם מגוון של הביטוי בין אפס תעתיקים 45 בכל תא, ~ 94% של מולקולות RNA זוהו באופן מדויק בכל אחד מהערוצים פלורסנט. אם פרוטוקול smFISH שיוצרת, אחד תתבונני (1) חלק גדול יותר של המקומות smFISH רק לאחד שני אותות פלואורסצנט (לא colocalized), ו/או (2) תאים עם יחס אות לרעש נמוך מאוד או שאין אותות בכלל.

בהמשך ביקשנו אם זיהוי האות smFISH היה משוחד לגבי המספר הכולל של מולקולות RNA בכל תא. בקרב אוכלוסיה, המספר הכולל של RNA מסוים בכל תא טמון הפצה, עם כמה תאים מחסה מולקולות RNA יותר מאחרים. פרוטוקול smFISH טוב צריך robustly לזהות את הרנ א בכל מקרה בין אם מספר גבוה או נמוך מספר מולקולות RNA הוא נוכח בכל תא. כדי לבדוק זאת, עבור כל תא, אנחנו מחושב השבר של המקומות smFISH עם אותות colocalized לבין השבר רק לאחד שני אותות פלואורסצנט. לאחר קיבוץ התאים היו מספר זהה של נקודות סה כ כל תא, אנחנו מחושבים השבר הממוצע של colocalized (מזווג) או שאינו colocalized נקודות (CF590 בלבד או Q670 בלבד) בקבוצה נתונה, ואת בגרף זה הממוצע כפונקציה של המספר הכולל של נקודות בכל תא (איור 3). עבור כל קטגוריה של כתמים, השברים היו דומים על-פני הטווח כולו של המספר הכולל של נקודות בכל תא. למשל, השוואה בין התאים עם סך של 20 נקודות פלורסנט בכל תא לעומת אלה עם סך של 30 נקודות, שברים הממוצע של המקומות colocalized היו דומים. תוצאה זו הציע כי הפרוטוקול שלנו היתה לזהות מולקולות של טווח של RNA בתא (עד לפחות 40 ~ מולקולות בכל תא). אם הפרוטוקול עבד suboptimally, אחד יכול להתבונן דעה קדומה. לדוגמה, השבר של המקומות עם היחידה. שני אותות פלואורסצנט עשוי להגדיל המספר הכולל של נקודות עבור כל תא גדל.

באמצעות פרוטוקול זה אופטימיזציה, בדקנו את הביטוי של הגן NDC80 , שמקודד חלבון קינטוכור, תנאי גידול שונים. הגן NDC80 מבטא איזופורמים mRNA שני: התעתיק זמן undecoded isoform, NDC80luti, בעל סיומת ~ 400 בסיסי זוגות בקצה 5' בהשוואה הקצרה NDC80ORF isoform, אבל שני תעתיקים לשתף האזור קידוד של הגן NDC80 (ראה מפרטים טכניים ב איור 4A). עיצבנו שתי ערכות של הגששים: סט CF 590 נקשר לאזור ייחודי 5' של NDC80luti; קבוצת Q 670 ומאגד לאזור משותף של NDC80luti , NDC80ORF. התרשימים NDC80luti התגלו כמו המקומות smFISH בו האותות לשניהם בדיקה ערכות colocalized, ואילו NDC80ORF התמלילים היו אלה עם האות רק מתוך Q 670. בשל גודל המקטע הייחודי של NDC80luti, אנחנו יכולים רק אריח הגששים 20 oligonucleotide לאורך אזור זה, המהווה פחות מ הגששים המומלצת של 30 עד 48. לפיכך, אנו קודם נקבע אם ערכת בדיקה זו היתה robustly לזהות רנ א בפרוטוקול ממוטבת שלנו. גם מהערוצים פלורסנט, אנחנו בגרף את יחס אות לרעש (SNR, הגדיר את הסטיה של הפיקסלים סביב נקודה ביחס עוצמת ספוט) כנגד האות אותר על כל מקום smFISH, שנוצר scatterplot עבור כל נקודות שזוהו כל שדה הראייה (למשל תמונות באיור 4A ) וחלקות ב- 4B איור. שתי אוכלוסיות נפרדות זוהו בבירור עבור שני 670 Q ומגדיר החללית CF 590 (ממוטב, איור 4B), רומז כי המקומות smFISH אמיתית (בתוך האזור האפור) יכול ניתן להפריד את האות רקע. שימו לב כי בתנאי שיוצרת, הפרדה כזו היה פחות ברורה (Suboptimal, איור 4B).

נהגנו ערכות בדיקה שני אלה ללמוד את הביטוי של NDC80luti , NDC80ORFבמהלך גידול וגטטיבי, מיוזה. בתאי צמח, חזקים האיתות ערכת בדיקה Q 670 זוהה אך לא מתוך 590 CF החללית הגדר (איור 5A, וגטטיבי), מסכים עם התצפית על ידי סופג הצפוני שבא לידי ביטוי רק isoform קצרה במהלך פליגה16 . תוצאה זו גם הציע כי ערכת בדיקה CF 590 הוא ספציפי, מניב רקע נמוך בפרוטוקול ממוטב smFISH שלנו. לעומת זאת, אות חזקים בשתי ערכות בדיקה זוהה meiotic prophase, הרוב המכריע של המקומות היו colocalized אות (איור 5A, meiotic prophase). יחד עם ניתוח חשופה הצפוני (איור 5B), התבוננות זו אישר isoform זמן NDC80luti בא לידי ביטוי בפרט מיוזה. אלו שני סוגים של mRNAs אותרו בציטופלסמה (מחוץ לאזור דאפי), רומז כי שניהם יוצאו מהגרעין, בקנה אחד עם הריבוזום פרופיל נתונים18.

כדי לקבוע אם מספיק נתונים שנאספו לחשבון באופן מדויק עבור הווריאציה ביולוגי מהותי ערכת הנתונים שלנו, ביצענו ניתוח האתחול באמצעות הנתונים הסטטיסטיים של כל תא, שכללה (1) השבר של המקומות colocalized לכל תא ו- (2) השבר של המקומות לאחד שני אותות פלואורסצנט (רק 590 CF ו- Q 670 בלבד). ניתוח זה, תוכנית נבחר באקראי תא אחד מתאי כימות 437 עבור 500 חזרות. בשלב הבא, חושבו הממוצע ואת השונות של סטטיסטיקות בהתאמה המשויכת אלה התאים הנבחרים 500. תהליך זה היה חוזר על עצמו שוב לבחירת שני תאים באופן אקראי מתוך כל התאים, ללא החלפה; ואז לבחירת באופן אקראי 3 תאים, וכו '. עד שאחד חצי מהגודל הכולל ערכת נתונים הושגה. השונות בערכת הנתונים plateaued לאחר ~ 40 תאים, רומז כי לאחר הנקודה הזו רוב השוני הממוצע הוא מהותי הנתונים מאשר חפץ של undersampling (איור 6, הזחה). אפקט זה הפך ברור יותר כאשר אנחנו בגרף את השונות המדגם מחולק המדגם, כפונקציה של מספר התאים שנדגמו במחזור כל איטרציה (איור 6). עם הנתונים המוצגים, בשינוי השונות הפכה diminishingly קטן לאחר ~ 60 תאים. מספר התאים לכמת בניסוי smFISH יעלה את המספר המינימלי של תאים הדרוש להשגת ממוצע יציבה ומישור של השונות. במקרה שלנו, אנחנו לכמת תאים מעל 95 עבור דגימה, לכל שכפול. המספר הכולל של תאים (תאים > 400) חריגה גם את המספר המינימלי של תאים (תאים ~ 60) הנדרש כדי לשקף את האוכלוסיה.

עם מחוייט Matlab תוכנית16, תאי צמח נמצאו החציוני של 5 NDC80ORF תעתיקים בכל תא, בעוד meiotic prophase תאים, החציון באופן משמעותי ירד ל 4 תעתיקים בכל תא (Wilcoxon דו-זנבית מבחן דרגה Sum, p = 0.026) (איור 7). המספר הנפוץ של NDC80luti הפרוטוקולים בכל תא הייתה תעתיקים 21, 100% של תאי ביטא את התמלילים NDC80luti . אנחנו בגרף את השבר של התאים עם מספר נתון של תעתיקים כמו היסטוגרמה תדירות הדרגתיים, יחסית כי המספר של מולקולות ה-mRNA הוא כמות דיסקרטית. סל הגדול ביותר של כל היסטוגרמה היה מנורמל לאותו גובה.

Figure 1
איור 1: תזרים עבור פרוטוקול smFISH. תאים קבועות עם פורמלין בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות, או 4 הלעפה תרוטרפמט בן לילה, עבור גידול וגטטיבי דוגמאות ודוגמאות meiotic, בהתאמה. אחרי כביסה ב B מאגר שלוש פעמים, תאים מתעכלים מאת zymolyase עד ~ 70% - 90% של תאים מתעכלים. הדגימות מתעכל ואז לשטוף פעם אחת עם מאגר B כדי להסיר את zymolyase, לאחר מכן permeabilized 70% אתנול (EtOH) ~3.5 שעות. כדי להתכונן הכלאה, דגימות מודגרת לראשונה ב- 10% formamide שטיפת מאגר (FWB) ~ 20 דקות. בשלב הבא, הדגימות הן resuspended ב ~ 50 µL של הכלאה פתרון, אשר מכיל את פלורסנט זונדי, דגירה לילה בחושך-30 הלעפה תרוטרפמט. לאחר הכלאה, הדגימות מודגרות ב- FWB 10% למשך 30 דקות כדי לשטוף את הגששים עודף, ואז מתפשט ב 10% FWB עם 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) כדי להכתים את ה-DNA. עבור הדוגמה עם תמונה מיד לאחר הדגירה FWB/דאפי, המדגם הוא resuspended במאגר GLOX בתוספת קטלאז, Trolox וגלוקוז אוקסידאז (GLOX + אנז); ואילו, הדגימות אחרות הן resuspended במאגר GLOX ללא אנזימים, המאוחסנים הלעפה תרוטרפמט 4 עד ~ 3 שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: הערכה של איכות smFISH באמצעות הגששים זוגי/אי זוגי- (א) למעלה: מפרטים טכניים עבור ערכות בדיקה זוגי/אי זוגי. חמישים וארבע oligonucleotide הגששים ריצוף הגן NDC80 תוכננו. הגששים אי-זוגיים הודבקו תוויות עם אחד fluorophore (CF590, שמוצג מגנטה), וכן את הגששים זוגיים, עם עוד fluorophore (Q670, מוצג בצבע ירוק). למטה: נציג smFISH תמונות של תאים meiotic prophase רכשה באמצעות ערכות בדיקה זוגי/אי זוגי. הדגימות נלקחו 6 שעות לאחר תאים (UB8144) הועברו הנבגה בינוני, זמן כאשר תאים אלה נעצרו ב- meiotic prophase. ה-DNA הוכתם דאפי (מוצג בצבע כחול). תמונות מוצגים ההשתקפויות בעוצמה מקסימלית של z-במחסן. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. אחוז (B) של המקומות smFISH לזווג או אינטראקצית שהושג באמצעות ערכות בדיקה זוגי/אי זוגי. סך של תאים meiotic prophase 428 נותחו, צירוף של שני ניסויים עצמאית. נתון זה משתנה מאיור 2-תוספת איור 4 של צ'ן. et al. 16 (ג) A המצטבר צפיפות פונקציה (CDF) המרחק בין כל זוג של נקודות לזווג המרחק בין השכן הקרוב ביותר של נקודת אינטראקצית. עבור כל שזוהו במקום ערוץ אחד פלורסנט, האלגוריתם "k הקרוב השכן" הוחל כדי לזהות את המקום הקרוב ביותר שזוהו — ואת המרחק למקום הזה — בערוץ משלימים. הגרסא המקומית שהיו הדדית הקרוב השכנים נחשבו לזווג, רשימה חדשה נוצרה ההקלטה של גילויים לזווג CF590 בלבד, Q670 בלבד. עבור כל קטגוריה של גילויים, CDF היסטוגרמה של המרחקים סומן ב- Matlab, המאשר כי כתמים כראוי לזווג אכן היו הרבה יותר קרוב המרחק יותר מאלה ללא מקביל במקום בערוץ השני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: שברים המקומות לזווג ו אינטראקצית, כפונקציה של RNA הכולל מספר בכל תא. כדי לבדוק אם הזיהוי, זיווג של המקומות smFISH היה מוטה ברמות ביטוי אחר, תאים בודדים קובצו על-ידי ביטוי RNA הכולל. שברים אכזרי של גילויים לזווג CF590 בלבד, Q670 בלבד חושבו עבור כל קבוצה של תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: הערכת איכות הנתונים smFISH שנוצר באמצעות את הגששים מיועד NDC80luti , NDC80ORF mRNAs. הגששים Q 670 (מוצג בצבע ירוק) hybridize נפוצים באזור משותף בין NDC80luti , NDC80ORF mRNAs, ואילו הגששים CF 590 (מוצג במגנטה) hybridize באזור ייחודי 5' של NDC80luti . (א) smFISH נציג תמונות של NDC80luti , NDC80ORF meiotic prophase, רכשה אופטימיזציה תחת לעומת התנאים שיוצרת. זנים UB8144 (ממוטב תנאי) ו UB1337 (תנאי שיוצרת) היו המושרה בתהליך המיוזה, קבוע במהלך meiotic prophase. אלה שני זנים הנמל מערכות סינכרון שונה לזירוז מיוזה, אך השימוש במערכת גם אינו משפיע על איכות smFISH (נתונים לא מוצג). בתנאי שיוצרת, התאים היו קבוע בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות (אין קיבוע לילה), מתעכל עם zymolyase ללא VRC שיושלם, ו hybridized ב ריכוז נמוך יותר של VRC. תמונות מוצגים ההשתקפויות בעוצמה מקסימלית של z-במחסן. ה-DNA הוכתם דאפי (מוצג בצבע כחול). סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. Scatterplots (B) להציג את יחס אות לרעש (SNR) את האות של כל smFISH ספוט זוהה שדה הראייה מוצג איור 4A, אחד מהערוצים פלורסנט, כמו גם התנאים ממוטבת או שיוצרת. בתנאי ממוטבת, נכחו שתי האוכלוסיות נקודות smFISH. המקומות smFISH נכון היו ממוקמים בתוך השטח האפור, המפריד בין האות רקע. בתנאי שיוצרת, mRNAs בודדים היה קשה להבחין לפי העין, ההפרדה בין כתמים האמיתי לבין הרקע לאחר הפעלת בתוכנת איתור המקום היה פחות ברורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: ביטוי של NDC80luti , NDC80ORF תעתיקים נשלטים חנותם. (א) smFISH נציג תמונות של NDC80luti , NDC80ORF במהלך גידול וגטטיבי, מיוזה. נלקחו דגימות צמח כאשר תאים (UB8144) היו גדלה אקספוננציאלית במדיום עשיר מזין. Meiotic prophase דגימות נלקחו 6 שעות לאחר תאים (UB8144) הועברו הנבגה בינוני, זמן כאשר תאים אלה נעצרו ב- meiotic prophase. הגששים Q 670 (מוצג בצבע ירוק) hybridize נפוצים באזור משותף בין NDC80luti , NDC80ORF mRNAs, ואילו הגששים CF 590 (מוצג במגנטה) hybridize לאזור ייחודי 5' של NDC80luti . ה-DNA הוכתם דאפי (מוצג בצבע כחול). כל תא בוימה על ידי האות Zip1-GFP, סמן meiotic prophase. פרוטוקול smFISH שלנו שומרת על קליטה טובה GFP ללא שינוי נוסף. גידול וגטטיבי: Zip1-GFP שלילי. Meiotic prophase: Zip1-GFP חיובי. תמונות מוצגים ההשתקפויות בעוצמה מקסימלית של z-במחסן. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. נתון זה משתנה מ- 2C איור של צ'ן. et al. 16. (B) NDC80ORF, NDC80luti, Ndc80 רמת חלבון (Ndc80p) במהלך המיוזה (UB4074). NDC80luti , NDC80ORF רמות נקבעו על ידי חשופה בצפון, רמת Ndc80p נקבע על ידי anti-V5 immunoblot בנקודות זמן שצוין. Hxk1p, טעינת פקד עבור immunoblot. כמו זן UB8144, זן זה גם בנמלים pGAL-NDT80 GAL4-ER סנכרון מערכת19,20. התאים היו מועברים לבינונית הנבגה בשעה 0, שוחרר מן המעצר pachytene על ידי תוספת β-אסטרדיול 6 שעות מאוחר יותר. בתמליל NDC80luti robustly התגלה ב- S/meiotic prophase, ואילו NDC80ORF תעתיקים נכח בעיקר, לפני הכניסה meiotic (שעה 0) ובמהלך לחטיבות meiotic (7-9 שעות). נתון זה משתנה מ 6J איור של צ'ן. et al. 16 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Figure 6
איור 6: "אוזן הנעל" ניתוח המבוצעת על הדגימות meiotic prophase שמוצג איור 5 . כל התאים כימות היו איחדו ולאחר מספר נתון (n) של התאים היו שנדגמו באקראי פי 500. ממוצע של 95% הסמך חושבו עבור השבר של mRNA לזווג ו אינטראקצית בכל תא. נתונים אלו שורטטו עבור כל אפשרות של n מספרים (הבלעה). הרמה בוריאנס היה דמיינו ידי התוויית השונות המדגם מחולק הממוצע, כפונקציה של מספר התאים (n) שנדגמו. המספר הכולל של תאים נמדד (תאים 437) מאוד חריגה המספר שבו השגיאה plateaued (תאים ~ 60), המציין כי נתונים נוספים לא תשפר את הביטחון במידות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: כימות הנתונים smFISH שמוצג איור 5 , כמנוקד כמו היסטוגרמות התדירות היחסית של התאים עם מספר נתון של NDC80luti , NDC80ORF תעתיקים בכל תא, תוך שימוש בנתונים איחדו מ 3 ניסויים עצמאי. הקו המקווקו מציין את המספר הממוצע של NDC80luti , NDC80ORF תעתיקים בכל תא. היסטוגרמה לכל היה מנורמל כך גובה סל המרבי היה זהה על-פני כל היסטוגרמות. המספר הכולל של תאים 637 נותחו עבור גידול וגטטיבי, 437 עבור meiotic prophase. דו-זנבית Wilcoxon דרגה סכום הבדיקה בוצעה עבור NDC80luti , NDC80ORF, בהתאמה, השוואה בין דגימות prophase וגטטיבי לבין meiotic. נתון זה משתנה מ- איור דו-ממדי של צ'ן. et al. 16 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

מאגר B (1 ליטר מניות: 1.2 מ' בסורביטול; 0.1 M אשלגן פוספט מאגר, pH 7.5) 1 x
נוקלאז ללא מים 500 מ
בסורביטול 218.6 g
2פו ח'4 2.18 גרם
K-2-HPO-4 14.62 g
נוקלאז ללא מים להביא 1 ליטר נפח סופי
* חנות-הלעפה תרוטרפמט 4 ב- 50-mL aliquots לאחר סינון לחיטוי
Zymolyase 100T (10 mg/mL)
לאחסן ב-20 הלעפה תרוטרפמט ב- aliquots
לפזר אבקת zymolyase 10 מ ג 1 מ"ל מים MilliQ
E . coli tRNA (10 mg/mL)
לאחסן ב-20 הלעפה תרוטרפמט ב- aliquots
לפזר אבקת tRNA 10 מ ג 1 מ"ל מים MilliQ
70% אתנול (50 מ"ל) 1 x (mL)
אתנול טהור 35
נוקלאז ללא מים 15
לשמור בטמפרטורת החדר
הכלאה מאגר (10 מ"ל) 1 x (mL)
50% לתוספי סולפט 2
E. coli tRNA (10 mg/mL) 1
200 מ"מ Vanadyl ribonucleoside מורכבים (VRC) 0.1
BSA, 50 מ"ג/מ"ל 0.04
20 x SSC 1
Formamide 1
נוקלאז ללא מים 4.86
לאחסן ב-20 הלעפה תרוטרפמט ב- 250-µL או 500-µL aliquots
10% formamide שטיפת מאגר (10 מ"ל) 1 x (mL)
Formamide בטמפרטורת החדר 1
20 x SSC 1
נוקלאז ללא מים 8
* להכין טרי, מערבולת עבור 20-ה-30 לערבב
תמיסת גלוקוז 10%
* חנות ב 4 הלעפה תרוטרפמט ב aliquots לאחר סינון לחיטוי
להמיס 1 גר' גלוקוז ב 10 מ"ל של מים נטולי נוקלאז
גלוקוז אוקסידאז
לאחסן ב-20 הלעפה תרוטרפמט ב- aliquots
להמיס 3.7 מ ג גלוקוז אוקסידאז ב 1 מ"ל של 50 מ מ NaOAc, pH 5
מאגר אנטי-אקונומיקה (GLOX), ללא אנזימים (1 מ"ל) 1 x (µL)
10% גלוקוז במים נטולי נוקלאז 40
1 מ' טריס, pH 8.0 10
20 x SSC 100
נוקלאז ללא מים 850
* להפוך טריים, יכולה גם לאחסן aliquots ב 4 הלעפה תרוטרפמט
מאגר אנטי-אקונומיקה (GLOX), עם אנזימים (50 µL) 1 x (µL)
קטלאז (מערבולת במתינות, הוא מתיישב בקלות) 0.5
גלוקוז אוקסידאז 0.5
100 מ מ Trolox (מומס באתנול) 1
מאגר GLOX 50
* להפוך טריים בכל פעם, להכין על קרח, ניתן לאחסן ב הלעפה תרוטרפמט 4 2-3 שעות

טבלה 1. Buffers ו- media

Discussion

פרוטוקול המובאת כאן נגזרת אחרים שפורסמו smFISH פרוטוקולים2,3,21,22,23, במיוחד ממוטב עבור רקע המתח שמרים SK1. הפרמטרים ממוטב כללו את מספר הטלפון הנייד, קיבוע משך, מהירות צנטריפוגה, משך, משך העיכול, מאגר עיכול, בדיקה לריכוז מאגר הכלאה. לא עברו אופטימציה פרמטרים אחרים כגון הכלאה טמפרטורה ומשך. בחלק זה, אנו חולקים כמה הערות שיעזרו לך להתאים את פרוטוקול זה איזשהו רקע המתח שמרים, את תנאי הגידול של עניין.

דופן התא של ניצני שמרים היא אחד האתגרים הגדולים נגד קבלת תמונות באיכות גבוהה smFISH ניצני שמרים כי קיר התא מונעת חדירה בדיקה. העיכול לא שלם של דופן התא על-ידי zymolyase מוביל הכלאה לא יעיל של המחקרים וכל השתנות גבוהה-לתא אות. אולם, עיכול יתר יכול להפוך את התאים שברירית מדי, המוביל משמעותית תא הפסד במהלך השלבים כביסה ותא מתפוצץ במהלך הכנת שקופית עבור הדמיה. לפיכך, אופטימיזציה של משך הזמן של מערכת העיכול היא קריטית. אנו ממליצים על ביצוע ניסוי smFISH טייס על ידי באותה דגימת זרע עבור כמויות שונות של זמן. במקרה שלנו, השגנו את הנתונים smFISH הטוב ביותר אם עצרנו העיכול כאשר ~ 80% של תאים הפך ללא-השבירה. בדרך כלל, עבור הצמיחה באותו המצב, זנים מוטציה גנטית יכול להיות מתעכל בתזמון דומה. עם זאת, משך הזמן של מערכת העיכול שונה בהשוואה בין תנאי גידול שונים, בשלבים שונים של מיוזה בניצני שמרים. ברגע התזמון נקבע, האיכות של smFISH הוא לשחזור. הערה כי עבור זנים מוטציה עם סינתזת דופן התא פגום ו/או הרכב, מערכת העיכול ועלול להסתיים בתוך פחות מ 15 דקות השימוש של קבוצות שונות של zymolyase עשויים גם מעט לשנות את התזמון לעיכול.

ריכוז אופטימלי בדיקה יש צורך להשיג יחס אות לרעש גבוה. אנחנו תוכנן ורכש מסחרית הגששים smFISH שלנו. הגששים טוב (לעיתים קרובות 20-מרס) צריך להיות אחוז של GC הנע בין 35% ל-45%, מרווח מינימלי של 2 זוגות בסיס בין הגששים, אשיג נמוכה. השתמשנו מעצב מבוסס-אינטרנט בדיקה מהיצרן כדי ליצור רשימה של הגששים, אם היו מספיק הגששים לבחירה, נשתמש האלגוריתם הפיצוץ במסד הנתונים של הגנום Saccharomyces לחסל את הגששים עם יותר מ 17 בסיסי זוגות חפפו עם אזורים אחרים גנומית. בחרנו את יותר photostable הפלורסנט (CAL עבור חיל הים 590) עבור ערכת בדיקה anneals לאזור ייחודי של NDC80luti (CF 590) כי בקבוצה זו, המספר של הגששים זה מרוצה כל הקריטריונים לעיל (20 הגששים) היה נמוך יותר מאשר המספר המינימלי המומלץ על ידי היצרן (~ 25 הגששים). לאחר לשחזר את הפתרון בדיקה בעקבות הוראות היצרן, עשינו 1:10 דילול של הפתרון מניות ומאוחסנת הפתרון מדולל 5-µL aliquots ב-20 הלעפה תרוטרפמט. כל aliquot היה בשימוש פעם אחת בלבד. עבור אופטימיזציה, לעשות סידורי דילולים מ ה-1:10 מדולל פתרון ובדיקה הריכוז אשר מניב את יחס אות לרעש הטוב ביותר. אנו ממליצים על ביצוע סדרת דילול 1:250, שבערך, 1:1000, 1:2000 מן המלאי המקורי. במקרה שלנו, גורם לדילול שבערך הביא יחס אות לרעש הטוב ביותר, עבור ערכות בדיקה CF 590 והן Q 670.

הזמן האופטימלי קיבוע חיוני גם עבור smFISH מוצלחת בניצני שמרים. אנחנו נמצא באותו קיבעון לילה-הלעפה תרוטרפמט 4, במקום תיקון בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות, לשפר באופן משמעותי את אחידות ואיכות התוצאות smFISH עבור דגימות meiotic. למרות שלא בדקנו איך לילה קיבוע העלולים להשפיע דגימות צמח, קיבוע בטמפרטורת החדר פעלה היטב את מצב גידול זה. לפיכך, כדי למטב את פרוטוקול smFISH עבור זנים חדשים או תנאי הגידול, מומלץ החל זמן קצר קיבוע בטמפרטורת החדר והגברת הזמן קיבוע אם השתנות גבוהה של האות הוא נתקל.

לעומת אחרים שפורסמו פרוטוקולים3,22,23, פרוטוקול שלנו משתמש החומר המדכא RNase VRC במהלך לעיכול, ריכוז גבוה יותר של VRC במהלך הכלאה. תוספת של VRC בשני שלבים אלה לשפר את העקביות של תוצאות smFISH, אולי על ידי יותר שמירה על מולקולות RNA נגד נוקלאז פעילות, אשר עשוי להיות מוצג על ידי שילוב zymolyase (האנזים מטוהר מכל תמציות גולמי, עשויים להכיל RNase מזהמים). לפיכך, אנו ממליצים להשתמש כמות VRC כפי שמפורט ב פרוטוקול או אפילו גבוה יותר ריכוזי VRC למיטוב שלנו.

חלק ניכר של התאים ייתכן שיאבדו במהלך השלבים כביסה B מאגר והן המאגר לשטוף formamide. כדי לצמצם את איבוד תאים, אחד יכול להגביר את מהירות צנטריפוגה. במקרה שלנו, באמצעות במהירות גבוהה (21,000 x g) הצניפה הדגימות שלנו במהלך B מאגר שוטף איבוד תאים מופחתת באופן משמעותי. עם זאת, תאים להפוך שברירי לאחר עיכול zymolyase, אז מהירות צנטריפוגה שינוי אינו מומלץ. במקום זאת, אנו מציעים שימוש השפופרות נמוך-הידבקות של מדעי בארה ב, אשר במידה רבה לעזור הצניפה התאים במהלך שוטף במאגר לשטוף formamide. בסך הכל, פרוטוקול שלנו בעקביות ליצור של טפט של תאים צפוף מספיק עבור הדמיה יעיל. בדרך כלל, 7 שדות ראייה אמור להניב > מתאים כימות 130 תאים.

לבסוף, חשוב לקבוע פרמטרים אופטימליים עבור ואת התוצרים לצורך, על סמך ניתוח תמונות. כדי לזהות כתמים smFISH, תוכניות שפורסמו ניתוח נפוץ לסנן את תמונות raw באמצעות גאוסיאנית הקרנל כדי להסיר רקע אות ובקש למשתמשים לקבוע את יחס אות לרעש לשימוש עבור כל קבוצה של תמונות2,17. למרבה הצער, אין כיום סטנדרט יחיד שבו נקבעים הפרמטרים הנכון, אז כמה בדיקות אמפירי של הגדרות שונות אלה יש צורך. כדי להגדיר את הפרמטרים הדרושים עבור כל אחד מהצעדים הללו, אחד צריך iteratively קלט סטים שונים של פרמטרים לבדוק עד כמה התוצאות המתקבלות מכל ערכה תואם את זה של ספירה ידנית בתאים נציג כמה. ברגע אחד קבוצת הפרמטרים נמצא, זה יכול לשמש עבור רוב הדימויים שהושג למרות תנאי גידול שונים ורקעים גנטי.

בנוסף, אחד יכול לבדוק אם הקרנה בעוצמה מקסימלית של תמונות smFISH יכולה להתבצע לפני כימות22. שלב זה מפשט את אלגוריתם זיהוי ספוט, מפחיתה באופן משמעותי את הזמן דימות, אף במחיר של מידע שעשוי להיות שימושי על נקודות בודדות, כגון לוקליזציה subcellular שלהם. במקרה שלנו, מספר מולקולות mRNA המיוצר על ידי הגן NDC80 היה נמוך מספיק המקומות היו מופרדים היטב לאחר העיבוד הזה (לא נדיר עבור תעתיקים של ניצני שמרים3,7). במקרים בהם colocalization ניתוח ביקורתי, הצינור ניתוח צריך לקבוע את המיקום של כל נקודה smFISH בכל אחד מהערוצים להעריך colocalization. תלוי השאלות הספציפיות הנשאלת, פרטים אחרים כגון העוצמה של כל מקום ייתכן גם צריך להיות מופק הצינור לצורך ניתוח נוסף. אופטימיזציה של המפתח צעדים בפרוטוקול, הצינור ניתוח התמונה מכריע בהשגת באיכות גבוהה של נתונים smFISH ללמוד את סוגיית הריבית.

Disclosures

המחברים יש אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים אן דודסון, סטפני היינריך עצה כיצד למטב את פרוטוקול smFISH, אקסבייר Darzacq בשביל לעזור עם פלטפורמת ניתוח, Haiyan הואנג לקבלת הצעות על ניתוח סטטיסטי. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות של המשפחה (5-FY15-99), הספסל צדקה סומך (00027344), קרן מחקר הסרטן של דיימון ראניון (35-15) וקרן גלן EÜ, של ה-NSF בוגר מחקר מלגת מענק מס DGE-1106400 לשם פורשים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA, RNase-free (50 mg/mL) Ambion AM2616 Store at -20 °C.
Catalase Sigma C3515 Store at 4 °C for short-term. Vortex before use.
DAPI Sigma D9564 Store at -20 °C after reconstitution in water. Protect from light.
50% Dextran Sulfate Milli Pore S4030 Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.
E. coli tRNA Sigma R4251 Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water.
Ethanol (100%, 200 proof) various Flammable.
37% Formaldehyde Fisher F79-500 Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.
Formamide Ambion AM9342 Store at 4 °C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution. 
Glucose various Store at 4 °C after dissolving in nuclease-free water.
Glucose oxidase Sigma G2133 Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.
Nuclease-free water Ambion AM9932 Store at room temperature.
Potassium phosphate (monobasic and dibasic) various Store at room temperature.
Probe library, diluted in TE, pH 8.0  Biosearch Technologies Store at -20 °C in aliquots (5 µL) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light. 
Sorbitol various Store at room temperature.
20X SSC Ambion AM9763 Store at room temperature.
TE, pH 8.0 Ambion AM9849 Store at room temperature.
1 M Tris, pH 8.0 Ambion AM9856 Store at room temperature.
Trolox Sigma 238813 Store at -20 °C in aliquots.
200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) NEB S1402S Store at -20 °C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.
Zymolyase 100T MP Biomedicals 08320932 Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water.
Low-adhesion tubes USA Scientific 1415-2600 Store at room temperature.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  2. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  3. Rahman, S., Zenklusen, D. Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae. Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).
  4. Gaspar, I., Ephrussi, A. Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).
  5. Vargas, D. Y., et al. Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing. Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).
  6. Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing. Mol Syst Biol. 7, 506 (2011).
  7. Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast. Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).
  8. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).
  9. Senecal, A., et al. Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts. Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).
  10. Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells. Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).
  11. Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ. Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).
  12. Ginart, P., et al. Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant. Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).
  13. Long, R. M., et al. Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA. Science. 277 (5324), 383-387 (1997).
  14. Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility. Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).
  15. Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses. RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).
  16. Chen, J., et al. Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA. eLife. 6, e27417 (2017).
  17. Mueller, F., et al. FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images. Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).
  18. Brar, G. A., et al. High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling. Science. 335 (6068), 552-557 (2012).
  19. Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
  20. Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).
  21. Dodson, A. E., Rine, J. Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae. eLife. 4, e05007 (2015).
  22. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).
  23. Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. Imaging single mRNA molecules in yeast. Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).

Tags

גנטיקה גיליון 135 קרינה פלואורסצנטית הכלאה בחיי עיר מולקולה בודדת (smFISH) ניצני שמרים מיטוזה מיוזה RNA ניתוח תא בודד שעתוק LUTI
קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת <em>ב באתרו</em> הכלאה (smFISH) ניתוח הנצה גידול וגטטיבי שמרים, מיוזה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, J., McSwiggen, D., Ünal,… More

Chen, J., McSwiggen, D., Ünal, E. Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis. J. Vis. Exp. (135), e57774, doi:10.3791/57774 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter