Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

خالية كرة محددة وشروط الثقافة خالية من علبة التغذية بالورق "نماذج الخلية الشبكية" المستمدة من اللجنة التوجيهية جيل من البشر

Published: September 6, 2018 doi: 10.3791/57795
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Institut de la Vision, Sorbonne Université, INSERM, CNRS, F-75012 Paris, France
* These authors contributed equally

Summary

إنتاج خلايا الشبكية المتخصصة من الخلايا الجذعية pluripotent نقطة تحول في تطوير العلاج القائم على الخلايا الجذعية لأمراض الشبكية. تصف هذه الورقة طريقة بسيطة لجيل بكفاءة أورجانويدس الشبكية وظهاره المصطبغة الشبكية للبحوث الأساسية ومتعدية الجنسيات، والسريرية.

Abstract

إنتاج خلايا متخصصة من الخلايا الجذعية pluripotent يوفر أداة قوية لوضع نهج جديدة للطب التجديدي. استخدام الخلايا الجذعية pluripotent الاصطناعية (إيبسكس) جاذبية خاصة لدراسات أمراض الأعصاب، بما في ذلك ضمور الشبكية، حيث الاحتفال نماذج الخلية الشبكية المستمدة من اللجنة التوجيهية خطوة رئيسية إلى الأمام لفهم ومكافحة العمى. في هذه الورقة، ويصف لنا بروتوكول بسيطة وقابلة لتولد وتنضج كريوبريسيرفي أورجانويدس الشبكية. استناداً إلى تغيير متوسطة، والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب تجنب متعددة ومضيعة للوقت الخطوات المطلوبة عادة في تفريق المصحوبة بمرشدين في إيبسكس. محاكاة في المراحل الأولى من التنمية الشبكية بالتغيرات المتتالية وسائط المعرفة في الثقافات اللجنة التوجيهية البشرية ملتصقة، يسمح هذا البروتوكول المتزامن توليد الذاتي تشكيل هياكل نيوروريتينال والشبكية مصطبغة الخلايا الظهارية (RPE) في طريقة استنساخه وكفاءة في 4 أسابيع. يمكن أن تكون هذه الهياكل التي تحتوي على خلايا الشبكية السلف (محاولات RPCs) معزولة بسهولة لمزيد من النضج في حالة ثقافة عائمة يمكن التفريق بين محاولات RPCs إلى سبعة أنواع خلايا الشبكية الموجودة في شبكية العين البشرية الكبار. بالإضافة إلى ذلك، يصف لنا طرق سريعة لنعد أورجانويدس الشبكية والخلايا RPE للتخزين على المدى الطويل. مجتمعة، الأساليب الموصوفة هنا ستكون مفيدة لإنتاج وبنك الخلايا الشبكية البشرية المستمدة من اللجنة التوجيهية أو أنسجة للبحوث الأساسية والسريرية على حد سواء.

Introduction

شبكية العين هي جزء لا يتجزأ من النظام العصبي المركزي (CNS) ولديه قدرة محدودة على التجدد تلقائياً بعد إصابة صدمة أو الأمراض. ولذلك، الأمراض التنكسية مما تسبب في فقدان الخلية الشبكية نهائياً، مثل المتعلقة بالعمر البقعي (AMD)، والتهاب الشبكية الصباغي (RP)، الزرق، واعتلال الشبكية السكري، عادة ما يؤدي إلى العمى لا رجعة فيه. إنقاذ الشبكية تحولت هو أحد التحديات رئيسية التي تستند إلى الخلايا الجذعية العلاجات تهدف إلى استبدال الخلايا التالفة أو المفقودة واحدة من2،،من1النهج الواعدة3. Pluripotent الخلايا الجذعية كخلايا بشرية من الخلايا الجذعية الجنينية (بتوليدا) أو الخلايا الجذعية pluripotent الاصطناعية (إيبسكس) لديها القدرة على توسيع نطاق مسمى في الثقافة، ولديهم القدرة على إنتاج أي نوع من أنواع الخلايا. التقدم في فهمنا للتنمية الشبكية والتحسين في المختبر بروتوكولات للتمايز اللجنة التوجيهية البشرية قد أدت إلى توليد أورجانويدس الشبكية7،،من89، 10،،من1112. كافة الخلايا الشبكية الرئيسية، بما في ذلك خلايا العقدة الشبكية (رجكس)، فوتوريسيبتورس، والخلايا (RPE) طلائي المصطبغة الشبكية، وقد تم بنجاح متباينة من البشرية بتوليدا وإيبسكس4،5، 6-استناداً إلى أسلوب سفب (ثقافة خالية من مصل الدم امبريويد الجسم مثل المجاميع) وضعتها ايركو et al. يمكن الحصول على 13، تشكيل الذاتي أورجانويدس الشبكية من اشتقاق المفتاح ESC أو اللجنة التوجيهية المجاميع الجسم مثل امبريويد في المصفوفة خارج الخلية المحددة مكونات7،،من1014. ولكن هذه البروتوكولات المعقدة، التي تتطلب عددا كبيرا من الخطوات غير متوافقة دائماً مع إنتاج كبيرة من الخلايا لفحص المخدرات أو النهج العلاجية. وهكذا، اختيار الطريقة لإنتاج خلايا الشبكية البشرية حرج والأسلوب الذي يحتاج إلى أن تكون قوية وقابلة للتطوير، وكفاءة.

نحن هنا، استناداً إلى أن المنشور السابق15، تصف كل خطوة لجيل بسيطة وفعالة من خلايا الشبكية من خلال تشكيل الذاتي أورجانويد الشبكية من ملتصقة إيبسكس البشرية المزروعة في حالة خالية من تغذية وخالية من كرة. بدءاً من الثقافات الروتينية من إيبسكس البشرية ملتصقة، يتطلب هذا البروتوكول إلا وسيلة متعاقبة بسيطة تغيير للسماح بتوليد خلايا RPE (حرب) المستمدة من البرامج المتكاملة وهياكل نيوروريتينال في 4 أسابيع. بعد دليل عزلة، ويمكن توسيع نطاق حرب ويمكن استزراع الهياكل الشبكية كعائم أورجانويدس حيث الخلايا الشبكية السلف قادرين على التمييز في جميع أنواع الخلايا الشبكية في ترتيب تسلسلي متسقة مع الإنسان في فيفو ريتينوجينيسيس. وأخيراً، للنهوض بالبحوث أو الترجمة السريرية، يصف لنا أسلوب للواسمات السماح التخزين طويل الأجل أورجانويدس كله الشبكية والخلايا حرب دون أن يؤثر ذلك على خواص ووظائف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

البروتوكول، المذكورة في هذه الورقة فيما يلي المبادئ التوجيهية لهذه الرؤية de la معهد البحوث لجنة الأخلاقيات. رؤية de la معهد سمح للتلاعب بالعينات البشرية وفقا للائحة الفرنسية الحالية. يتبع نموذج التعامل مع حماية بيانات المريض وفقا "مبادئ هلسنكي"، والأنظمة الوطنية بعد الموافقة الأخلاقية "لجنة دي الحماية الأشخاص (حزب الشعب الكمبودي) القارسة الخامس".

1-إعداد وسائل الإعلام الثقافة وأطباق

  1. الثقافة الإعلامية
    1. استخدام اللجنة التوجيهية المتوسطة، وسيلة محددة كيميائيا مكرسة للثقافة الخلايا الجذعية pluripotent في ظروف خالية من تغذية16. إعداد 500 مل متوسطة وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    2. استخدام اللجنة التوجيهية القاعدية (Bi) المتوسطة، تعريف اللجنة التوجيهية كيميائيا المتوسطة دون عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية 2 (FGF2) أو تحويل عامل النمو بيتا (TGFß).
    3. إعداد 500 مل من ثنائي المتوسطة وتستكمل مع الملحق 1% N2 (الحاوية 2 المتوسطة)، 10 وحدات/مل من البنسلين، و 10 ملغ/مل من والستربتوميسين.
    4. إعداد 500 مل من المستندة إلى N2 برونيورال المتوسطة (المتوسطة ProN2) تتألف من خليط DMEM:Nutrient F-12 (DMEM/F12، 1:1، ل الجلوتامين)، 1% MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية، الملحق 1% N2، 10 وحدات/مل من البنسلين، و 10 ملغ/مل من والستربتوميسين.
    5. إعداد بناء B27 برونيورال المتوسطة (المتوسطة ProB27) تتألف من خليط DMEM:Nutrient F-12 (DMEM/F12، 1:1، ل الجلوتامين)، 1% MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية، الملحق 2% B27، 10 وحدات/مل من البنسلين و 10 ملغ/مل من والستربتوميسين.
  2. إعداد سفينة الثقافة
    1. لثقافة البشرية [ايبسك]
      1. إعداد 10 مل محلول فيترونيكتين يحتوي على 5 ميكروغرام/مل من فيترونيكتين في برنامج تلفزيوني x 1. في 10 مل من 1 x برنامج تلفزيوني، إضافة 100 ميليلتر من الحل الأسهم فيترونيكتين المذابة (100 س).
      2. توزيع 2 مل الحل فيترونيكتين كل طبق 6-سم الثقافة المقابلة إلى 0.5 ميكروغرام/سم2. احتضانها من أجل ح 1 في درجة حرارة الغرفة (RT). إزالة الحل فيترونيكتين بتطلع باستخدام نظام تطلع فراغ أو ماصة 5 مل.
      3. إضافة 4 مل من اللجنة التوجيهية المتوسطة الواحدة وطبق 6-سم.
      4. احتضان الأطباق في حاضنة ثقافة خلية على 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
    2. لزراعة الخلايا البشرية RPE (حرب) المستمدة من اللجنة التوجيهية
    3. استخدام مصفوفة مؤهل بالخلايا الجذعية pluripotent أو الركيزة لمعطف الآبار وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. إضافة مصفوفة أو الركيزة لتغطية النمو كامل المساحة كافية. على سبيل المثال، وضع 300 ميليلتر من مصفوفة الواحدة أيضا في لوحة 24-جيدا ومل 3 من المصفوفة في قارورة2 سم T-25.
    4. احتضان ثقافة المغلفة السفن للحد أدنى من 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. إزالة مصفوفة استخدام نظم تطلع فراغ أو ماصة 5 مل.
    5. إضافة 1 مل من ProN2 المتوسطة الواحدة وكذلك على لوحات 24-جيدا والعودة السفينة الثقافة إلى حاضنة للحد أدنى من 30 دقيقة الحارة وحجته على المديين المتوسط. للحصول على T-25 سم2 قوارير، راجع الخطوة 5، 2.

2-صيانة وتوسيع للبشرية إيبسكس

  1. صيانة إيبسكس البشرية
    1. إعداد 3 مل متوسطة اللجنة التوجيهية في أنبوب 15 مل وإبقائه في RT على الأقل لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام. تحضير طبق 6-سم مغلفة كما هو موضح في 1.2.1.
    2. ذوبان الجليد عينة إيبسكس البشرية من خزان النتروجين سائل أو-150 درجة مئوية ثلاجة مبردة بالحضانة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
    3. تطهير القنينة المبردة باستخدام رذاذ مطهر حل بعناية. نقل إيبسكس البشرية المذابة من كريوتوبي إلى أنبوب 15 مل يحتوي على 3 مل من اللجنة التوجيهية المتوسطة استعد مسبقاً في الرايت
    4. إزالة أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 110 x ز للحد الأدنى 3 المادة طافية بالشفط باستخدام نظام تطلع فراغ أو ماصة 5 مل.
    5. ريسوسبيند بيليه الخلية مع 1 مل من اللجنة التوجيهية المتوسطة من طبق المغلفة فيترونيكتين 6-سم ثقافة باستخدام ماصة 2 مل ونقل الخلايا إلى الطبق. إعادة الإناء للحاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 24 ساعة قبل تغيير المتوسطة.
      ملاحظة: يمكن إضافة مثبط روك، مثل Y-27632 في 10 ميكرون، إلى المتوسطة اللجنة التوجيهية في أطباق الثقافة 6-سم للحد من المبرمج.
    6. تغيير في المتوسط يوميا، وتمرير إيبسكس البشرية كل أسبوع.
  2. باساجينج من إيبسكس البشرية
    1. تمر اللجنة التوجيهية البشرية في التقاء 70-80%، كلاسيكي بعد 7 أيام في الثقافة.
    2. إعداد أطباق 6-سم باساجينج كما هو موضح في الخطوة 1.2.1. إزالة المتوسطة اللجنة التوجيهية من الأطباق مع إيبسكس المتلاقية وإضافة 2 مل الحل الانفصال لمدة دقيقة 6 في الرايت
      ملاحظة: فترة حضانة المرض يعتمد على نسيلة اللجنة التوجيهية. حاول حضانة 6 دقيقة كبداية.
    3. إزالة الحل الانفصال باستخدام نظم تطلع فراغ أو ماصة 5 مل وإضافة 2 مل متوسطة اللجنة التوجيهية قبل استعد في "الرايت ريسوسبيند" المستعمرات اللجنة التوجيهية التي بيبيتينج عليها صعودا وهبوطاً x 5-10 مع ماصة 1,000 ميليلتر.
      تحذير: تجنب تفكك خلية واحدة من بيبيتينج المفرطة.
    4. نقل 30 إلى 200 ميليلتر من كتل حراكه خلية في صحن 6-سم ثقافة جديدة. عودة الأطباق إلى حاضنة الثقافة الخلية في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 24 ساعة قبل تغيير المتوسطة.
      ملاحظة: حجم الخلية حراكه كتل بحاجة باساجينج يعتمد على نسيلة اللجنة التوجيهية.
    5. تغيير في المتوسط يوميا، وتمرير إيبسكس البشرية كل أسبوع.

3-جيل أورجانويدس الشبكية

  1. بدء التفريق بين اللجنة التوجيهية بعد البروتوكول المخططة في الشكل 1A عند المستعمرات التوصل إلى التقاء 60-70% (الشكل 1B).
  2. إعداد 4 مل متوسطة مرتين كل الطبق 6-سم. حرارة متوسطة مرتين إلى 37 درجة مئوية. تغيير المتوسطة اللجنة التوجيهية للمتوسط مرتين. ملاحظة هذه المرة كاليوم 0 (D0).
  3. في D2، التبديل الثقافات في المتوسط مرتين إلى وسيلة الحاوية 2، استعد مسبقاً عند 37 درجة مئوية. تغيير في المتوسط كل 2-3 أيام.
  4. تحديد أورجانويدس الشبكية الذاتي تشكيل الناشئة من براعم نيوروبيثيليوم، كما هو مبين في الشكل 1 -1E.
    ملاحظة: هذه أورجانويدس الشبكية المبكر، المقابلة في مرحلتها التنموية إلى كأس البصرية، يمكن أن تكون معزولة يدوياً للتجريب المتلقين للمعلومات.

4-نضوج أورجانويدس الشبكية

  1. في D28، إعداد لوحات 6-كذلك يتضمن 4 مل/بئر ProB27 المتوسطة يكمل في البداية مع 10 نانوغرام/مل من FGF2 (الشكل 1A).
    ملاحظة: إضافة FGF2 فورا قبل إضافة الوسائط إلى اللوحات.
    تنبيه: عدم تصفية FGF2.
  2. استعادة الهياكل الشبكية من الأطباق 6-سم يدوياً. للقيام بذلك، عزل هياكل صنع التصدعات متعامدة مع الإبرة حول المهد نيوروبيثيليال، كما هو مبين في الشكل 1E، وفصل في أورجانويدس بخدش لهم بلطف مع الإبرة.
  3. نضح أورجانويدس 10-15 باستخدام ماصة ميليلتر 1,000 ونقلها في بئر واحدة للوحة 6-البئر الذي يحتوي على ProB27 المتوسطة.
  4. يبقى أورجانويدس الشبكية في ظروف الثقافة العائمة في متوسطة ProB27 في حاضنة ثقافة خلية في 37 درجة مئوية و 5% CO2. تغيير نصف المتوسط كل 2-3 أيام.
    ملاحظة: علاج أورجانويدس مع FGF2 حتى D35.
  5. في D35، إزالة نصف المتوسط وإضافة جديدة متوسطة ProB27 بريوارميد في 37 درجة مئوية دون FGF2.
  6. تغيير نصف المتوسط كل 2-3 أيام خلال الفترة الزمنية اللازمة للحصول على أنواع الخلايا الشبكية المطلوب وفقا لظهور أنواع الخلايا الشبكية، كما هو مبين في الشكل 2.

5-جيل و "تضخيم الإنسان" خلايا RPE (حرب) المستمدة من اللجنة التوجيهية

  1. جيل خلايا البشرية هيربي
    1. المشاركة في إيبسكس في التفريق عند المستعمرات التوصل إلى التقاء 60-70%، يتبع البروتوكول المخططة في الشكل 3A.
    2. إعداد 4 مل في الطبق 6-سم متوسطة ثنائية والحارة المتوسطة مرتين عند 37 درجة مئوية. تغيير المتوسطة اللجنة التوجيهية للمتوسط مرتين. ملاحظة هذه المرة كاليوم 0 (D0).
    3. في D2، التبديل الثقافات في المتوسط مرتين إلى وسيلة الحاوية 2 استعد مسبقاً عند 37 درجة مئوية. تغيير في المتوسط كل 2-3 أيام.
    4. في D28، تغيير المتوسطة إلى متوسطة ProN2 طازجة استعد مسبقاً عند 37 درجة مئوية كما هو مبين في الشكل 3 ألف.
      ملاحظة: يمكن القيام بهذه الخطوة بعد الانتقاء أورجانويد هو موضح في الخطوة 4.
    5. تغيير المتوسطة ProN2 كل 2-3 أيام.
    6. في D42، تحديد الخلايا الناشئة من حرب بمراقبة البقع المصطبغة كما هو موضح في الشكل 3 (ب).
      ملاحظة: يظهر تصبغ الخلايا حرب بين D35 إلى D56 اعتماداً على استنساخ اللجنة التوجيهية.
  2. تضخيم خلايا هيربي
    1. في D42، إعداد لوحة 24-كذلك كانت مغلفة بالمصفوفة كما هو موضح في الخطوة 1.2.2 والذي يحتوي على 1 مل من ProN2 المتوسطة الواحدة وكذلك. ضع اللوحة لمدة 15 دقيقة في الحضانة عند 37 درجة مئوية و 5% CO2 قبل الاستخدام.
    2. استرداد بقع هيربي من الطبق 6-سم يدوياً. لعزل بقع، وجعل من سترييشن عمودي مع الإبرة حول ظهارة المصطبغة وفصل الورقة بالخدش بلطف أنه مع الإبرة. نضح 10 بقع مصطبغة باستخدام ماصة ميليلتر 1,000 ونقلها في بئر واحدة للوحة 24-جيدا.
    3. إبقاء بقع حرب في المتوسطة ProN2 في حاضنة ثقافة خلية في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لح 48 قبل تغيير المتوسطة. ملاحظة هذا المقطع خلية حرب ك 0 (hiRPEp0). تغيير في المتوسط كل 2-3 أيام مع ProN2 المتوسطة.
    4. تمر الخلايا hiRPEp0 عندما تكون الخلايا المتلاقية.
      1. إزالة المتوسطة استخدام نظم فراغ-التطلع وغسل كل س 1 جيدا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني باستخدام ماصة 5 مل.
      2. تجاهل برنامج تلفزيوني استخدام نظم فراغ-التطلع، إضافة 200 ميليلتر الواحدة من 0.25% التربسين جيدا، واحتضان على الأقل لمدة 15 دقيقة في حاضنة في 37 درجة مئوية. إضافة 800 ميليلتر المتوسطة ProB27 إلى إلغاء تنشيط التربسين.
        ملاحظة: لا ينصح استخدام ProN2 المتوسطة لوقف نشاط التربسين.
      3. ننأى بالورقة حرب الخلايا التي بيبيتينج من الأعلى والأسفل. وضع تعليق خلية في أنبوب 15 مل والطرد المركزي أنه لمدة 5 دقائق في 110 x ز.
        ملاحظة: يمكن أن يتم غسل إضافية مع المتوسطة ProN2 لإزالة الفائض في المتوسط ProB27.
      4. إزالة المادة طافية ولطف ريسوسبيند بيليه الخلية في 2 مل متوسطة ProN2 استعد مسبقاً عند 37 درجة مئوية. عد الخلايا مع عداد خلايا.
      5. تأخذ الخلايا 1.25 مليون ووضعها في T-25 سم المغلفة بمصفوفة قارورة2 (راجع الخطوة 2.2.2) التي تحتوي على 5 مل متوسطة ProN2 استعد مسبقاً عند 37 درجة مئوية. ملاحظة هذا المقطع خلية حرب ك 1 (hiRPEp1).
    5. تبقى الخلايا حرب في المتوسط ProN2 في حاضنة ثقافة خلية في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لح 48 قبل تغيير المتوسطة.
    6. تغيير وسائل الإعلام كل 2-3 أيام. عند الخلايا hiRPEp1 التوصل إلى التقاء، القيام بالمرور أو تجميد القادمة.

6-تجميد "أورجانويدس الشبكية" والخلايا حرب

  1. لأسرة الشبكية أورجانويدس
    1. حدد 5 إلى 20 أورجانويدس الشبكية باستخدام بيبيت نقل ووضعها في قنينة مبردة. إزالة أي وسيط الزائدة مع ماصة ميليلتر 1,000 دون لمس أورجانويدس في الجزء السفلي من الأنبوب وإضافة 250 ميليلتر لتجميد الباردة المتوسطة (انظر الجدول للمواد).
    2. تجميد قارورة في حاوية تجميد المستندة إلى الايزوبروبانول في-80 درجة مئوية للحد ني حاء 4 نقل القنينات المجمدة إلى الثلاجة-150 درجة مئوية أو خزان النتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
  2. للخلايا هيربي
    1. في مرور 1، فصل الخلايا حرب عندما تكون الخلايا المتلاقية.
      ملاحظة: لا ينصح تجميد الخلايا hiRPEp0.
    2. نضح المتوسطة من قارورة2 سم T-25 استخدام نظم فراغ الطموح وغسله x 1 مع 3 مل من برنامج تلفزيوني باستخدام ماصة 5 مل.
    3. إزالة برنامج تلفزيوني استخدام نظم فراغ الطموح وإضافة 1 مل من 0.25% التربسين واحتضان على الأقل لمدة 15 دقيقة في حاضنة في 37 درجة مئوية. إضافة 5 مل متوسطة ProB27 لوقف نشاط التربسين.
      ملاحظة: لا ينصح استخدام ProN2 المتوسطة لإلغاء تنشيط التربسين.
    4. ننأى بالورقة حرب الخلايا التي بيبيتينج من أعلى وأسفل باستخدام ماصة 10 مل. عد الخلايا مع خلية العداد. وضع تعليق خلية في أنبوب 15 مل والطرد المركزي أنه لمدة 5 دقائق في 110 x ز.
      ملاحظة: يمكن أن يؤديها يغسل إضافية مع المتوسطة ProN2 لإزالة الفائض في المتوسط ProB27.
    5. نضح المادة طافية استخدام الفراغ التطلع ولطف ريسوسبيند الخلايا للحصول على خلايا 2 مليون في 250 ميليلتر من المتوسطة للواسمات.
    6. نقل 250 ميليلتر من تعليق خلية كل قنينة المبردة. تجميد قارورة في حاوية تجميد المستندة إلى الايزوبروبانول في-80 درجة مئوية للحد ني ح 4.
    7. نقل القنينات المجمدة في ثلاجة-150 درجة مئوية أو خزان النتروجين سائل للتخزين على المدى الطويل.

7-ذوبان الجليد "أورجانويدس الشبكية" والخلايا حرب

  1. ذوبان الجليد من أورجانويدس كله الشبكية
    1. متوسطة ProB27 الحارة في 37 درجة مئوية (2 مل ستكون مطلوبة لكل قنينة المبردة).
    2. من خزان النتروجين السائل أو الثلاجة-150 درجة مئوية، ذوبان الجليد قنينة مبردة التي تحتوي على أورجانويدس الشبكية في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لتطهير س. 30 القنينة المبردة بعناية باستخدام رذاذ مطهر حل.
    3. فتح القنينة وإضافة 1 مل من قبل حرارة ProB27 المتوسطة. نقل أورجانويدس إلى أنبوب 1.5 مل مع ماصة نقل.
    4. إزالة المتوسطة بلطف بيبيتينج من دون لمس الهياكل الشبكية في الجزء السفلي من الأنبوب. أغسل أورجانويدس 1 المزيد من الوقت مع 1 مل من المتوسط ProB27 المعالجون مسبقاً.
    5. نضح أورجانويدس مع بيبيت نقلها ووضعها في 1 لوحة 6-البئر الذي يحتوي على ProB27 المتوسطة استعد مسبقاً واكويليبراتيد في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
      ملاحظة: وضع 10-15 أورجانويدس الشبكية كل من لوحة 6-جيدا جيدا.
    6. تغيير نصف المتوسط كل 2-3 أيام خلال الفترة الزمنية اللازمة للحصول على أنواع الخلايا الشبكية المطلوب وفقا لظهورها، كما هو موضح في الشكل 2.
  2. ذوبان الجليد من الخلايا هيربي
    1. متوسطة ProN2 الحارة في 37 درجة مئوية (8 مل ستكون مطلوبة لكل قنينة المبردة).
    2. من خزان النتروجين السائل أو الثلاجة-150 درجة مئوية، ذوبان الجليد مبردة عينة من خلايا hiRPEp1 بحضانة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لتطهير س. 30 القنينة المبردة بعناية باستخدام رذاذ مطهر الحل.
    3. فتح الأنبوب وإضافة 1 مل من قبل حرارة ProN2 المتوسطة ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل يحتوي على 2 مل من قبل حرارة ProN2 المتوسطة. الطرد المركزي أنه لمدة 5 دقائق في 110 x ز.
    4. إزالة المادة طافية ولطف ريسوسبيند بيليه الخلية في 2 مل متوسطة ProN2 استعد مسبقاً عند 37 درجة مئوية.
    5. عد الخلايا مع عداد خلايا.
    6. تأخذ الخلايا 1.25 مليون ووضعها في قارورة2 سم T-25 المغلفة بمصفوفة (راجع الخطوة 2.2.2) التي تحتوي على 5 مل متوسطة ProN2 استعد مسبقاً عند 37 درجة مئوية. في هذه المرحلة، علما المرور ك 2 (hiRPEp2).
    7. إبقاء الخلايا hiRPEp2 في ProN2 المتوسطة في حاضنة الثقافة الخلية في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لح 48 قبل تغيير المتوسطة.
    8. تغيير وسائل الإعلام كل 2-3 أيام. عند الخلايا حرب التوصل إلى التقاء، القيام بالمرور أو تجميد القادمة.
      ملاحظة: بعد أسبوعين في الثقافة، 8 مليون هيربي الخلايا يمكن جمعها لمزيد من التجريب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الخطوة الأولى للتفريق اللجنة التوجيهية البشرية المزروعة في ظروف خالية من تغذية16 إيقاف تشغيل الجهاز الذاتي تجديد استخدام المتوسطة ثنائية لتشجيع تفريق عفوية (الشكل 1A). ثم، في D2، يكمل المتوسطة ثنائية مع ملحق N2 لتوجيه تمييز الخلايا إيبسكس نحو الأنساب العصبية والشبكية. هذه العملية تؤدي إلى ظهور براعم نيوروريتينال في جميع أنحاء D28 (الشكل 1 - 1E). يمكن أن تكون معزولة باستخدام إبرة كما هو موضح في الشكل 1E الذاتي تشكيل هياكل نيوروريتينال ونقل إلى لوحات الثقافة للسماح نضوج أورجانويدس الشبكية في ظروف الثقافة العائمة باستخدام ProB27 المتوسطة (الشكل 1F). لصالح النمو والتنمية الشبكية العصبية، يتم إضافة FGF2 إلى المتوسطة لمدة أسبوع واحد (الشكل 1A).

في D28، تتضمن الهياكل الشبكية الناشئة أساسا خلايا الشبكية السلف التي شاركت تعبر عن عامل النسخ الرئيسية ك PAX6 و RAX VSX215. تثير هذه فروعه إلى سبع فئات رئيسية من أنواع الخلايا الشبكية في العائمة أوضاع الثقافة في أمر ولادة تقحم مصانة تمشيا مع التنمية البشرية الشبكية. على أساس قرة-بكر و immunohistochemistry الموصوفة سابقا في ريشمان et al. 15، المنحنيات الواسعة في الشكل 2 إظهار موجات المبكرة والمتأخرة-ولد الأجيال الخلية الشبكية خلال عملية نضج في المختبر . وبالتالي، يحدد الوقت الثقافة أنواع الخلايا الموجودة في أورجانويدس.

يمكن أن يؤديها عزل الخلايا حرب لأي مزيد من التضخيم فقط عندما يكون التصبغ محسوسة لهذا التلون الخلية يسمح التصور. وبهذه الطريقة، يتم استخدام المتوسطة ProN2 من D28 إلى D42 لصالح تصبغ الخلايا RPE15.

اعتماداً على استنساخ البشر من اللجنة التوجيهية، يمكن اكتشاف البقع المصطبغة قبل أو بعد الذاتي تشكيل الهياكل الشبكية؛ لكن معظمها 1 أو 2 أسابيع بعد استخدام ProN2 المتوسطة في D28 (الشكل 3 أ، ب). صورة ممثل الميداني مشرق للخلايا حرب موسعة من بقع معزولة في المرور 0 يظهر في الشكل 3 و 3D. بعد ذلك، يمكن توسيع نطاق الخلايا حرب حتى مرور 4، الإبقاء على النمط الظاهري RPE دون مرحلة انتقالية الظهارية الوسيطة (EMT). ومع ذلك، يمكن منع EMT باستعمال مثبطات روك مثل Y-27632، مما يتيح أيضا زيادة الممرات خلية رقم17. يمكن أن يؤديها الثقافات طويلة الأجل لحرب الخلايا بعد ذوبان الجليد بسهولة في الشروط الموضحة هنا للحصول على ظهارة ناضجة والفنية15. مثال الخلايا hiRPEp2 ناضجة في الأسبوع 52 مع مورفولوجيا حصاة كبيرة cuboidal كلاسيكية يتضح في الشكل 3E.

Figure 1
رقم 1: توليد ونضوج أورجانويدس الشبكية من إيبسكس البشرية ملتصقة. (أ) تمييز بروتوكول يسمح بتوليد أورجانويدس الشبكية. (ب) إيبسكس البشرية في D0. (ج) الناشئة ظهارة نيوروريتينال في D15. (د) الهياكل الشبكية مثل تشكيل الذاتي العصبية في D22. (ﻫ) هنا، برعم نيوروريتينال استخدام إبرة معزولة. (و) صور الممثل من أورجانويدس الشبكية في العائمة شرط الثقافة في D35. تغيير حجم أشرطة = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: موجات الشبكية البشرية المستمدة من اللجنة التوجيهية خلية جيل- المختصرات: خلايا الشبكية السلف (محاولات RPCs) وخلايا العقدة الشبكية (رجكس) والخلايا الأفقية (هو)، خلايا أماكريني (ص)، مولر الخلايا الدبقية (مجكس)، خلايا ثنائية القطب (Bp) و photoreceptors (PR). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: توليد والتضخيم من البشر RPE المستمدة من اللجنة التوجيهية- (أ) مثالاً على بروتوكول التمايز يسمح بتوليد الخلايا البشرية حرب. (ب) مرحلة-التباين الصور بقع تظهر مصطبغة الناشئة من التفريق بين إيبسكس البشرية ملتصقة في الأسبوع 6 (W6). (ج) hiRPEp0 الخلايا المزروعة أسبوع واحد (W1) بعد الانتقاء البقعة المصطبغة. (د) hiRPEp0 الخلايا في الأسبوع 6 (W6) بعد الانتقاء البقعة المصطبغة. (ﻫ) صورة تمثيلية من الخلايا hiRPEp2 بعد ذوبان الجليد، المزروعة لمدة 52 أسبوعا (W52) في المتوسط ProN2. تغيير حجم أشرطة = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذا البروتوكول توضح كيفية إنتاج خلايا RPE وأورجانويدس الشبكية، التي تحتوي على رجكس الشبكية وفوتوريسيبتورس، من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية في ظروف خالية من كرة وخالية من علبة التغذية بالورق. متوافقة مع عملية ممارسة التصنيع الجيد (GMP)، والأسلوب الذي يزرع المعروضة هنا يسمح إنتاج كبير من خلايا الشبكية المستمدة من اللجنة التوجيهية RPE الخلايا ورجكس، وفوتوريسيبتورس لتطوير العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية والمخدرات اكتشاف نهج لمعالجة الأمراض التنكسية الشبكية مستقبلا. تجميد أورجانويدس كله الشبكية أو خلايا حرب كما يوفر ميزة كبيرة في إنشاء بنوك وسيطة، خطوة هامة لاستخدامها في المستقبل في العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية.

إنتاج كميات كبيرة من أنواع معينة من الخلايا الشبكية في مرحلة معينة من التمايز سيكون مطلوباً للترجمة السريرية مستقبلا. في هذا الصدد، وصفت الجيل في الأشهر الثلاثة من السلائف مستقبله CD73-إيجابية سكان المتوافقة مع زرع خلية18، وإمكانية توليد هذه فوتوريسيبتورس غير ناضجة من إذابة تجميد الشبكية أورجانويدس15 تعزز الأمل في استخدام هذه الخلايا لأغراض علاجية. ظهارة المصطبغة الشبكية، وفيما يتعلق بقدرة الخلايا حرب آخذة في الانتشار في المختبر يسمح خلية كبيرة للإنتاج للبنك لهم. الأهم من ذلك، المذابة الخلايا RPE البشرية المستمدة من اللجنة التوجيهية الاحتفاظ بالنمط الظاهري RPE والدالة، ولذلك، كالعوامل التغذوية إفراز أو مستقبله الجزء الخارجي البلعمه15، التحقق من سهولة استخدامها لفحص الاستراتيجيات، وكذلك فيما يتعلق النهج العلاجية مستقبلا.

وهناك مجموعة متنوعة من البروتوكولات لتوليد أورجانويدس الشبكية المستمدة من اللجنة التوجيهية7،8،9،10،11،،من1215 التي تختلف في الثقافة أساليب (امبريويد الجسم مثل المجاميع مقابل الخلايا ملتصقة) فضلا عن كفاءة ومتانة. الأسلوب الموصوفة هنا يبدأ من إيبسكس البشرية ملتصقة ويظهر فعالية استنساخه، والقدرة على التكيف، وتطبيقها على مجموعة واسعة من الخطوط التوجيهية البشرية15. هذه العملية، استناداً إلى التغيير المتعاقبة لوسائل الإعلام الحرة المصل، يلخص الخطوات الرئيسية للتنمية الشبكية باستغلال العظة الجوهرية للنظام لتوجيه التمايز. ميزة هامة من هذا البروتوكول هو عدم تشكيل هيئة الجنينية وإضافة مصفوفة للخلية الشبكية GMP المتوافقة المستقبل تصنيع البروتوكولات لإنتاج مشتقات العلاج الخلية. وبهذه الطريقة، تم العثور على أي فرق في كفاءة توليد أورجانويد الشبكية ونضج بين الثقافة إكسينوجينيك ولا إكسينوجينيك شروط استخدام المكملات نظام العلاج بالخلايا (CTS) أم لا، وصاغت حصرا مع المؤتلف أو مكونات أنسنة.

نجاح أسلوب المفاضلة الشبكية يعتمد إلى حد كبير على نوعية الثقافات البشرية اللجنة التوجيهية. طريقة إعادة برمجة لا تؤثر على كفاءة التمايز إيبسكس البشرية إلى خلايا الشبكية8، لكن وضعهم ستيمنيس بحاجة إلى أن يكون الحل الأمثل. بإيجاز، المزروعة بشكل روتيني إيبسكس البشرية ينبغي أن لا تظهر أي علامات على التمايز. ينبغي عدم التداخل بين المستعمرات ويجب أن تعرض على مورفولوجيا دائرية مميزة. على الرغم من أن كفاءة التفريق بين الشبكية تعتمد على استنساخ، يمكن انتقاء الحد أدنى من اثنين من الهياكل الشبكية كل سم2 في D28، المقابلة لهياكل نيوروريتينال 50-60 سم 6 صحن واحد. لنضوج أورجانويد الشبكية في ظروف الثقافة العائمة، مما يحد من العدد هياكل للبئر الواحد يتجنب الانصهار الهيكل والإفراط في الاستهلاك المتوسط. في ظل هذه الظروف الثقافة، يمكن ماتوراتيد أورجانويدس الشبكية لوقت موسعة، يلزم الحصول على أنواع الخلايا الشبكية المتأخرة.

التطلع إلى الأمام، أورجانويدس الشبكية التي تم إنشاؤها في المختبر باستخدام هذه الطريقة تشكل أدوات قوية لنموذج أمراض الشبكية. سيتم استخدام نماذج الخلية الشبكية المستمدة من اللجنة التوجيهية الخاصة بالمريض فهم أفضل للأمراض الوراثية أو المعقدة باستكشاف تلك الآليات الجزيئية والخلوية. هذه النماذج سوف تكون مناسبة بشكل خاص لاكتشاف المخدرات عن طريق الفرز الفائق أو العلاجات الخلية والجينات أو الجينوم تحرير نهج، تطوير علاجات مبتكرة لضمور الشبكية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ريشمان ساشا، جورو أوليفييه، والساحل خوسيه-العين هي المخترعين في انتظار براءات الاختراع المتعلقة بتوليد خلايا الشبكية من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية.

Acknowledgments

الكتاب يود أن يشكر أعضاء فريق جورياو للحصول على إسهامهم أثناء إنشاء الأساليب الموصوفة هنا، وجاجلياردي غ. م. جاريتا للقراءة الحرجة. أيد منح مقدمة من وكالة الاستخبارات الوطنية هذا العمل (جبيبس: ANR-2010--RFCS005؛ سايتريبير: وكالة الاستخبارات الوطنية-16-CE17-008-02)، "رابطة فرنسا الشبكية" والتكنولوجيا نقل شركة "لاتيش سات". كما أنه أنجز في إطار ليفيسينسيس لابيكس (ANR-10-لابكس-65) تدعمها وكالة الاستخبارات الوطنية داخل البرنامج دعفينير يشرف (ANR-11-معرض أيدكس-0004-02).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated ThermoFisher Scientific A14700 Coating
CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated ThermoFisher Scientific A27940 Coating
Essential 8 Medium ThermoFisher Scientific A1517001 medium
Essential 6 Medium ThermoFisher Scientific A1516401 medium
CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement ThermoFisher Scientific A1370701 supplement CTS
N-2 Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17502048 supplement
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504044 supplement
CTS B-27 Supplement, XenoFree ThermoFisher Scientific A1486701 supplement CTS
DMEM/F-12 ThermoFisher Scientific 11320074 medium
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140035 supplement
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122 antibiotic
CellStart CTS ThermoFisher Scientific A1014201 Matrix CTS
Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix ThermoFisher Scientific A1569601 Matrix
Gentle Cell Dissociation Reagent Stemcell Technologies 7174 dissociation solution
Cryostem Freezing Media clinisciences 05-710-1D Cryopreservation medium
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) Preprotech 100-18B FGF2
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free Preprotech AF-100-18B FGF2 Xeno free
AGANI needle 23G Terumo AN*2332R1 Needle
Flask 25 cm² Tissue Culture Treated Falcon 353109 T-25 cm²
24 well plate Tissue Culture Treated Costar 3526 24-well plate
6 well plate Tissue Culture Treated Costar 3516 6-well plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, C., Wang, Q., Temple, S. Stem cell therapies for retinal diseases: recapitulating development to replace degenerated cells. Development. 144, 1368-1381 (2017).
  2. Dalkara, D., Goureau, O., Marazova, K., Sahel, J. -A. Let There Be Light: Gene and Cell Therapy for Blindness. Human Gene Therapy. 27, 134-147 (2016).
  3. Wright, L. S., Phillips, M. J., Pinilla, I., Hei, D., Gamm, D. M. Induced pluripotent stem cells as custom therapeutics for retinal repair: Progress and rationale. Experimental Eye Research. 123, 161-172 (2014).
  4. Leach, L. L., Clegg, D. O. Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients with Ocular Disease. Stem Cells. 33, 2363-2373 (2015).
  5. Gill, K. P., Hewitt, A. W., Davidson, K. C., Pébay, A., Wong, R. C. B. Methods of Retinal Ganglion Cell Differentiation From Pluripotent Stem Cells. Translational Vision Science and Technology. 3, 2 (2014).
  6. Giacalone, J. C., Wiley, L. A., et al. Concise review: Patient-specific stem cells to interrogate inherited eye disease. STEM CELLS Translational Medicine. 5, 132-140 (2016).
  7. Nakano, T., Ando, S., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
  8. Reichman, S., Terray, A., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 8518-8523 (2014).
  9. Meyer, J. S., Howden, S. E., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29, 1206-1218 (2011).
  10. Zhong, X., Gutierrez, C., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
  11. Mellough, C. B., Collin, J., et al. IGF-1 Signalling plays an important role in the formation of three dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33, 2416-2430 (2015).
  12. Gonzalez-Cordero, A., Kruczek, K., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9, 820-837 (2017).
  13. Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
  14. Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16698-16703 (2009).
  15. Reichman, S., Slembrouck, A., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).
  16. Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
  17. Croze, R. H., Buchholz, D. E., et al. ROCK inhibition extends passage of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium. Stem Cells Translational Medicine. 3, 1066-1078 (2014).
  18. Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, 6462-6471 (2011).

Tags

علم الأحياء التنموي، 139 قضية، الشبكية، أورجانويدس، والخلايا الجذعية pluripotent، التمايز، العلاجات الخلية، واكتشاف المخدرات
خالية كرة محددة وشروط الثقافة خالية من علبة التغذية بالورق "نماذج الخلية الشبكية" المستمدة من اللجنة التوجيهية جيل من البشر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Slembrouck-Brec, A., Nanteau, C.,… More

Slembrouck-Brec, A., Nanteau, C., Sahel, J. A., Goureau, O., Reichman, S. Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models. J. Vis. Exp. (139), e57795, doi:10.3791/57795 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter