Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Tanımlanmış Xeno-alerjik ve besleyici-Alerjik kültür koşulları üretimi insan IPSC kaynaklı Retina hücre modelleri için

Published: September 6, 2018 doi: 10.3791/57795
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Institut de la Vision, Sorbonne Université, INSERM, CNRS, F-75012 Paris, France
* These authors contributed equally

Summary

Pluripotent kök hücrelerden özel Retina hücrelerinin üretimini geliştirme retina hastalıkları için kök hücre tabanlı tedavisinin bir dönüm noktası olduğunu. Mevcut kağıt Retina organoids ve Retina pigmentli epitel verimli bir nesil için temel, çevirim ve klinik araştırma için basit bir yöntem açıklanır.

Abstract

Özel hücreler pluripotent kök hücrelerinin üretimini rejeneratif tıp için yeni yaklaşımlar geliştirmek için güçlü bir araç sağlar. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSCs) nerede Retina hücre IPSC kaynaklı modelleri anlamak ve körlük mücadele için önemli bir adım ileri işaretlemek Retina dystrophies, nörodejeneratif hastalık çalışmaları için özellikle çekici kullanmaktır. Bu yazıda, biz oluşturmak, Olgun ve Retina organoids cryopreserve için basit ve ölçeklenebilir iletişim kuralı tanımlamak. Orta değiştirilmesi hakkında temel, bu yöntemin ana avantajı birden fazla önlemek için ve zaman alıcı adımları yaygın olarak iPSCs bir rehberli farklılaşma içinde gerekli. Retina gelişme erken aşamalarında başarılı değişiklikleri yapisan insan IPSC kültürler üzerinde tanımlanan medya tarafından taklit eden, bu iletişim kuralları, neuroretinal yapıları ve Retina pigmentli epitel (RPE) hücreleri kendi kendini oluşturan eşzamanlı üretimi sağlar bir 4 hafta tekrarlanabilir ve verimli bir şekilde. Retina progenitör hücre (RPC'ler) içeren bu yapılar için daha fazla olgunlaşma RPC farklılaşmaya yetişkin insan retinada mevcut yedi Retina hücre türlerine izin kayan bir kültür durumda kolayca ayrılmış olabilir. Ayrıca, Retina organoids dondurma için hızlı yöntemleri ve RPE hücrelerinin uzun süreli depolama için açıklar. Birlikte birlikte, burada açıklanan yöntemleri üretmek ve insan IPSC kaynaklı Retina hücreleri veya doku temel ve klinik araştırma için banka yararlı olacaktır.

Introduction

Retina Merkezi sinir sistemi (MSS) ayrılmaz bir parçasıdır ve travmatik bir yaralanma veya hastalık kendiliğinden yeniden oluşturmak için sınırlı bir kapasiteye sahip. Bu nedenle, dejeneratif patolojiler kesin Retina hücre kaybı, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), retinitis pigmentosa (RP), glokom ve diyabetik retinopati, gibi neden genellikle geri dönüşü olmayan körlük neden. Dejenere retina tahlisiye kök hücre tabanlı terapiler bozuk veya eksik hücrelerin yerini alır amaçlayan en umut verici yaklaşımlar1,2,3biri olan büyük bir sorun olduğunu. Pluripotent kök hücreler insan embriyonik kök hücreleri (ESCs) hücreler olarak veya insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSCs) kültürü süresiz olarak genişletilecek kapasitesine sahip ve herhangi bir hücre tipleri üretmek potansiyeline sahip. Vitro geliştirilmesi ve Retina geliştirme anlayışımızı gelişmeler protokolleri insan IPSC farklılaşma sonuçlandı için Retina organoids7,8,9üretimi, 10,11,12. Retina ganglion hücrelerinin (RGCs), photoreceptors ve Retina pigmentli epitel (RPE) hücreleri, dahil olmak üzere büyük Retina hücreleri başarıyla insan ESCs ve iPSCs4,5dan, Ayrıştırılan 6. Eiraku vd tarafından geliştirilen SFEB (serum serbest kültür embryoid vücut benzeri toplamları) yöntemine dayalı 13, Retina organoids öz oluşumu ESC veya IPSC türetilmiş tanımlı hücre dışı matriks bileşenlerinin7,10,14embryoid vücut benzeri toplamları üzerinden elde edilebilir. Ama bu tedavi yaklaşımları veya uyuşturucu tarama için adımları değil her zaman hücreler büyük üretim ile uyumlu çok sayıda gerektiren karmaşık iletişim kurallarıdır. Böylece, insan Retina hücreleri üretmek için yöntem seçiminde önemlidir ve Yöntem sağlam, ölçeklenebilir ve etkin olması gerekir.

Burada, bizim önceki yayın15tarihinde dayanarak, biz her adım bir besleyici ve xeno özgür durumda ekili yapisan insan iPSCs üzerinden Retina organoid öz oluşumu ile retina hücreleri basit ve etkili bir nesil için açıklamak. Yapisan insan iPSCs rutin kültürleri başlayarak, bu iletişim kuralı yalnızca basit bir ardışık orta IP'leri türetilmiş RPE (hiRPE) hücreleri ve neuroretinal yapıları nesil 4 hafta içinde izin vermek için değiştirme gerektirir. El ile bir yalıtım sonra hiRPE-ebilmek var olmak genişlemek ve Retina yapıları Retina progenitör hücre içine tüm Retina hücre tipleri sıralı vivo insan ile tutarlı ayırt etmek mümkün nerede organoids yüzen olarak kültürlü retinogenesis. Son olarak, araştırma gelişme veya klinik çeviri için biz onların fenotipik özellikleri ve işlevselliği etkilemeden bütün Retina organoids ve hiRPE hücreleri uzun süreli depolama sağlayan bir dondurma yöntemi açıklanmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu raporda açıklanan protokol Institut de la vizyon'ın Araştırma Etik Komitesi kuralları izler. Institut de la vizyon geçerli Fransız yönetmelik göre insan numune işleme izin verdi. Numune işleme Helsinki ilkeleri doğrultusunda hasta veri koruma ve ulusal düzenlemeler "Comité de koruma des Personnes (CPP) Ile-de-France V" etik onaylandıktan sonra takip eder.

1. hazırlanması Kültür Medya ve yemekleri

  1. Kültür medya
    1. IPSC orta, pluripotent kök hücre kültür besleyici-Alerjik koşulları16adanmış bir kimyasal olarak tanımlanmış ortam kullanın. 500 mL orta üreticinin protokolüne göre hazırlayın.
    2. Kullanım bazal IPSC (BI) orta, IPSC orta olmadan fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2) veya dönüştürme büyüme faktörü Beta (TGFß) kimyasal olarak tanımlı.
    3. 500 mL (Bın2 orta), %1 N2 ilave ile desteklenmiş bı orta hazırlamak 10 adet/mL penisilin ve 10 mg/mL streptomisin.
    4. 500 mL oluşan DMEM:Nutrient karışımı F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-Glutamine), %1 MEM önemli olmayan amino asitler, %1 N2 ek, 10 adet/mL penisilin ve 10 mg/mL streptomisin proneural Orta (ProN2 orta) N2 tabanlı hazırlayın.
    5. DMEM:nutrient karışımı F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-Glutamine), %1 MEM önemli olmayan amino asitler oluşur proneural Orta (ProB27 orta) B27 tabanlı hazırlamak, %2 B27 ek, 10 adet/mL penisilin ve 10 mg/mL streptomisin.
  2. Kültür gemi hazırlık
    1. İnsan IPSC kültür için
      1. 10 mL 5 μg/mL 1 x PBS vitronectin de içeren bir vitronectin çözeltisi hazırlamak. 10 mL 1 x PBS, 100 µL çözdürülen vitronectin hisse senedi çözüm (100 x) ekleyin.
      2. 2 mL başına 0,5 µg/cm2' ye karşılık gelen 6 cm kültür çanak vitronectin çözeltisi dağıtın. (RT) Oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. Vitronectin çözüm tarafından aspirasyon bir vakum-aspirasyon sistemi veya 5 mL pipet kullanarak kaldırın.
      3. IPSC orta 6 cm çanak başına 4 mL ekleyin.
      4. Bulaşıkları 37 ° C ve % 5 CO2 30 dk kullanmadan önce en az bir hücre kültür kuluçka kuluçkaya.
    2. İnsan IPSC kaynaklı RPE (hiRPE) hücre kültürü için
    3. Pluripotent kök hücre nitelikli matris veya substrat wells üreticinin protokolüne göre kat için kullanın. Yeterli matris veya tüm büyüme yüzey alanı kapsayacak şekilde substrat ekleyin. Örneğin, matris 300 µL 24-şey plaka ve T-25 cm2 şişeye matrix 3 mL başına koy.
    4. En az 1 h 37 ° C'de kaplamalı kültürü kapları kuluçkaya Matris vakum-aspirasyon sistemleri veya 5 mL pipet kullanarak kaldırın.
    5. ProN2 orta iyi başına 1 mL 24-şey tabaklarda ekleyin ve kültür gemi kuluçka makinesi en az 30 dk sıcak ve orta equilibrate geri dönün. T-25 cm2 şişeler için bkz: adım 5.2.

2. bakım ve genişleme insan iPSCs

  1. İnsan iPSCs bakım
    1. 3 mL IPSC orta 15 mL tüp içinde hazırlamak ve RT 15dk kullanmadan önce en az tutun. Kaplamalı 6 cm çanak 1.2.1 içinde açıklandığı şekilde hazırlayın.
    2. Kuluçka 30 37 ° C'de bir su banyosunda tarafından insan iPSCs bir sıvı azot tankı veya-150 ° C dondurucu kriyojenik örneği çözülme s.
    3. Dikkatle kriyojenik şişeyi bir dezenfektan çözüm sprey kullanarak dezenfekte edin. Çözdürülen insan iPSCs RT önceden ısınmış IPSC orta 3 mL içeren 15 mL tüp cryotube aktarmak
    4. 3 dakika süreyle santrifüj tüpü 110 x g de bir vakum-aspirasyon sistemi veya 5 mL pipet kullanarak aspirasyon tarafından süpernatant kaldırın.
    5. Hücre Pelet IPSC Orta 2 mL pipet kullanarak bir 6-cm kültür vitronectin kaplı yemek üzerinden 1 mL ile resuspend ve hücreleri yemek için transfer. Çanak 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçka makinesi 24 h en az orta değiştirmeden önce dönün.
      Not: 10 µM, Y-27632 gibi bir ROCK inhibitörü apoptosis azaltmak için 6 cm kültür yemekleri IPSC ortamda eklenebilir.
    6. Orta her gün değiştirin ve insan iPSCs her hafta geçirin.
  2. İnsan iPSCs passaging
    1. İnsan IPSC % 70-80 izdiham klasik kültür 7 gün sonra geçmek.
    2. 1.2.1. adımda açıklandığı gibi passaging için 6 cm yemekleri hazırlamak. Konfluent iPSCs bulaşıkta IPSC orta kaldırmak ve RT. 2 mL 6 min için bir ayrılma çözeltisi ekleyin
      Not: Kuluçka süresi IPSC klonlar üzerinde bağlıdır. 6 dk kuluçka başlangıç olarak deneyin.
    3. Vakum-aspirasyon sistemleri veya 5 mL pipet kullanarak ayrılma çözüm kaldırın ve 2 mL IPSC orta dik Resuspend IPSC kolonileri 1.000 µL pipet ile 5-10 x yukarı ve aşağı onları pipetting tarafından önceden ısındı ekleyin.
      Uyarı: aşırı pipetting üzerinden tek hücre ayrılma kaçının.
    4. Resuspended hücre kümeleri yeni bir 6-cm kültür tabak 30-200 µL aktarın. Bulaşıkları 24 h en az 37 ° C ve % 5 CO2 hücre kültür kuluçka orta değiştirmeden önce dönün.
      Not: Passaging için gerekli resuspended hücre kümeleri hacmi IPSC klonlar üzerinde bağlıdır.
    5. Orta her gün değiştirin ve insan iPSCs her hafta geçirin.

3. nesil Retina Organoids

  1. Şekil 1A ' koloniler % 60-70 izdiham (Şekil 1B) ulaştığında kapsamlıdır protokol sonrası IPSC farklılaşma başlatın.
  2. Bi orta 6 cm çanak başına 4 mL hazırlayın. Bi orta ile 37 ° c sıcak IPSC orta bı orta olarak değiştirin. Bu kez gün 0 (D0) olarak unutmayın.
  3. D2 bı ortamda daha önce 37 ° C'de ısındı Bın2 orta kültürleri Orta 2-3 günde değiştirin.
  4. Şekil 1 c içinde gösterildiği gibi acil kendini oluşturan Retina organoids neuroepithelium tomurcukları tarafından tespit -1E.
    Not: Bu erken Retina organoids, optik cup, onların gelişimsel aşamaya içinde karşılık gelen el ile aşağı akım deneme için ayrılmış olabilir.

4. Retina Organoids olgunlaşma

  1. D28 4 mL/iyi başlangıçta 10 ng/mL ile FGF2 takıma ProB27 orta içeren 6-şey tabak hazırlamak (Şekil 1A).
    Not: medya tabakaları bana hemen eklenmeden önce FGF2 ekleyin.
    Dikkat: FGF2 filtre uygulamayın.
  2. Retina yapıları 6 cm yemeklerini el ile kurtarmak. Bunu yapmak için Şekil 1Eiçinde gösterildiği gibi etrafında neuroepithelial bud, iğne ile dikey yivler yapma yapıları ayırma ve nazikçe onları çizilmemesi tarafından iğne ile organoids ayırmak.
  3. 10-15 organoids 1000 µL pipet kullanarak Aspire edin ve ProB27 orta içeren 6-şey plaka tek bir kuyuda aktarabilirsiniz.
  4. Retina organoids ProB27 orta bir hücre kültür kuluçka kayan kültür koşullarda 37 ° C ve % 5 CO2' de unutmayın. Orta yarısı 2-3 günde değiştirin.
    Not: D35 kadar organoids FGF2 ile tedavi.
  5. İtibariyle D35, orta yarısı kaldırın ve taze prewarmed ProB27 orta FGF2 olmadan 37 ° C'de ekleyin.
  6. Orta yarısı her 2-3 gün boyunca Şekil 2' de gösterildiği gibi Retina hücre tipleri, istenen Retina hücre tipleri ortaya çıkması göre elde etmek için gereken süreyi değiştirin.

5. nesil ve amplifikasyon insan IPSC kaynaklı RPE (hiRPE) hücreleri

  1. İnsan hiRPE hücre üretimi
    1. Kolonilerin 3A rakamkapsamlıdır protokol sonrası % 60-70 izdiham ulaştığınızda iPSCs farklılaşma içinde meşgul.
    2. 6-cm çanak bı orta başına 4 mL hazırlamak ve 37 ° C'de bı orta sıcak IPSC orta bı orta olarak değiştirin. Bu kez gün 0 (D0) olarak unutmayın.
    3. D2 bı ortamda daha önce 37 ° C'de ısındı Bın2 orta kültürleri Orta 2-3 günde değiştirin.
    4. D28 daha önce 37 ° C'de Şekil 3Aiçinde gösterildiği gibi sıcak taze bir ProN2 orta orta değiştirin.
      Not: Bu adım adım 4'te açıklanan organoid malzeme çekme sonra yapılabilir.
    5. ProN2 Orta 2-3 günde değiştirin.
    6. D42 acil hiRPE hücreleri pigmentli yamalar gözlem tarafından 3B şekilgösterildiği gibi tanımlayın.
      Not: HiRPE hücre pigmentasyon D35 D56 bağlı olarak IPSC klonlar için arasında görünür.
  2. HiRPE hücreleri amplifikasyon
    1. D42 daha önce 1.2.2. adımda açıklandığı gibi matris ile kaplı ve ProN2 orta iyi başına 1 mL içeren bir 24-şey plaka hazırlayın. Kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2 kullanmadan önce plaka 15 dakika yerleştirin.
    2. HiRPE yamalar 6 cm çanak el ile kurtarmak. Yamalar izole, pigmentli epitel çevresinde iğne ile dik bir striation yapmak ve yavaşça iğneyle çizilmemesi tarafından sayfası ayırmak için. 1000 µL pipet kullanarak 10 pigmentli yamalar Aspire edin ve 24-şey plaka tek bir kuyuda aktarabilirsiniz.
    3. HiRPE yamalar ProN2 orta bir hücre kültür kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2 48 h için orta değiştirmeden önce tutmak. Bu hiRPE hücre geçiş 0 (hiRPEp0) Not. Orta 2-3 günde ProN2 orta ile değiştirin.
    4. Hücreleri konfluent ne zaman hiRPEp0 hücreleri geçmek.
      1. Vakum-aspirasyon sistemleri kullanarak orta kaldırmak ve her şey 1 x 1 mL 5 mL pipet kullanarak PBS ile yıkayın.
      2. Vakum-aspirasyon sistemleri kullanarak PBS atmak, 200 µL % 0.25 tripsin kuyu başına ekleyin ve en az 15 dk 37 ° C'de bir kuluçka kuluçkaya ProB27 orta tripsin devre dışı 800 µL ekleyin.
        Not: Tripsin etkinliğini durdurmak için ProN2 orta kullanımı tavsiye edilmez.
      3. HiRPE hücreleri sayfa yukarı ve aşağı pipetting tarafından ayırmak. Hücre süspansiyon bir 15 mL tüp içinde yerleştirin ve 110 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi.
        Not: ProN2 orta ProB27 orta fazlalığı kaldırmak için ek bir yıkama yapılabilir.
      4. Süpernatant kaldır ve yavaşça 37 ° C'de önceden sıcak ProN2 Orta 2 ml hücre Pelet resuspend Bir hücre sayaç içeren hücreleri saymak.
      5. 1.25 milyon hücre alıp bir matris kaplı T-25 cm2 şişeye yerleştirebilirsiniz (bkz. Adım 2.2.2) 5 mL ProN2 orta de içeren önceden 37 ° C'de ısındı Bu hiRPE hücre geçiş 1 (hiRPEp1) unutmayın.
    5. HiRPE hücreleri hücre kültür kuluçka ProN2 ortamda 48 h 37 ° C ve % 5 CO2 orta değiştirmeden önce tutmak.
    6. Medya her 2-3 gün değiştirin. HiRPEp1 hücreleri izdiham ulaştığınızda, sonraki geçit veya dondurma gerçekleştirin.

6. dondurma Retina Organoids ve hiRPE hücre

  1. Bütün Retina organoids için
    1. 5 ila 20 Retina organoids bir transfer damlalıklı kullanarak seçin ve onları kriyojenik bir şişede yerleştirin. Organoids tüp alt dokunmadan 1.000 µL pipet ile aşırı her ortam kaldırın ve soğuk dondurma orta 250 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek).
    2. Bir isopropanol tabanlı dondurma konteyner-80 ° c en az 4 h Transfer şişeleri donmuş şişeleri-150 ° C dondurucu veya uzun süreli depolama için sıvı azot Tankı durdur.
  2. HiRPE hücreler için
    1. Hücreleri konfluent olduğunda 1 geçiş hiRPE hücreleri ayırmak.
      Not: Bir dondurma hiRPEp0 hücre tavsiye edilmez.
    2. Vakum-aspirasyon sistemleri kullanarak T-25 cm2 şişeye ortamından Aspire edin ve yıkayın 1 x 3 mL 5 mL pipet kullanarak PBS ile.
    3. Vakum-aspirasyon sistemleri kullanarak PBS kaldırmak, 1 mL % 0.25 tripsin ekleyin ve en az 15 dk 37 ° C'de bir kuluçka kuluçkaya Tripsin etkinliğini durdurmak için ProB27 orta 5 mL ekleyin.
      Not: ProN2 orta tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için kullanımı tavsiye edilmez.
    4. HiRPE hücreleri yaprağı 10 mL pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetting tarafından ayırmak. Hücre sayacı ile hücreleri saymak. Hücre süspansiyon bir 15 mL tüp içinde yerleştirin ve 110 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi.
      Not: Ek bir yıkama ile ProN2 orta ProB27 orta fazlalığı kaldırmak için gerçekleştirilebilir.
    5. Vakum-aspirasyon kullanarak süpernatant Aspire edin ve yavaşça hücreleri dondurma orta 250 µL 2 milyon hücre elde etmek için resuspend.
    6. Hücre süspansiyon kriyojenik şişe başına 250 µL aktarın. Bir isopropanol tabanlı dondurma konteyner-80 ° c en az 4 h şişeleri dondur.
    7. Donmuş şişeleri-150 ° C dondurucu veya uzun süreli depolama için sıvı azot tankı aktarın.

7. çözdürme Retina Organoids ve hiRPE hücre

  1. Bütün Retina organoids çözme
    1. Sıcak ProB27 orta 37 ° C'de (2 mL kriyojenik her şişe için gerekli olacak).
    2. Sıvı azot tankı ya da -150 ° C dondurucu kriyojenik bir şişe Retina organoids 37 ° C'de bir su banyosunda 30 s. dezenfekte için dikkatli bir dezenfektan çözüm sprey kullanarak kriyojenik flakon içeren çözülme.
    3. Şişe açın ve önceden ısıtılmış ProB27 orta 1 mL ekleyin. Organoids 1.5 mL tüp transferi pipet ile aktarın.
    4. Orta yavaşça Retina yapıları tüp alt dokunmadan pipetting tarafından çıkarın. Organoids 1 1 mL ile daha fazla zaman önceden ısıtılmış ProB27 orta yıkayın.
    5. Organoids bir transfer damlalıklı ile Aspire edin ve 1 de önceden ısıttı ve 37 ° C ve % 5 CO2bir kuluçka equilibrated ProB27 orta içeren 6-şey plaka koyun.
      Not: 6-şey plaka kuyu 10-15 Retina organoids yerleştirin.
    6. Orta yarısı her 2-3 gün boyunca Şekil 2' de açıklandığı gibi istenen Retina hücre tiplerine göre onların ortaya çıkması, elde etmek için gereken süreyi değiştirin.
  2. HiRPE hücreleri çözme
    1. Sıcak ProN2 orta 37 ° C'de (8 mL kriyojenik her şişe için gerekli olacak).
    2. Sıvı azot tankı ya da -150 ° C dondurucu hiRPEp1 hücreleri kriyojenik örneği 37 ° C'de bir su banyosu içine bir kuluçka tarafından 30 s. dezenfekte için dikkatle dezenfektan çözüm sprey kullanarak kriyojenik şişe çözülme.
    3. Tüp açın ve önceden ısıtılmış ProN2 orta 1 mL ekleyin ve hücre süspansiyon önceden ısıtılmış ProN2 Orta 2 mL içeren bir 15 mL tüp aktarmak. 110 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi.
    4. Süpernatant kaldır ve yavaşça 37 ° C'de önceden sıcak ProN2 Orta 2 ml hücre Pelet resuspend
    5. Bir hücre sayaç içeren hücreleri saymak.
    6. 1.25 milyon hücre alıp matris kaplı T-25 cm2 şişeye yerleştirebilirsiniz (bkz. Adım 2.2.2) 5 mL ProN2 orta de içeren önceden 37 ° C'de ısındı Bu aşamada, geçiş 2 (hiRPEp2) olarak unutmayın.
    7. HiRPEp2 hücreleri hücre kültür kuluçka ProN2 ortamda 48 h 37 ° C ve % 5 CO2 orta değiştirmeden önce tutmak.
    8. Medya her 2-3 gün değiştirin. HiRPE hücreleri izdiham ulaştığınızda, sonraki geçit veya dondurma gerçekleştirin.
      Not: daha fazla Hollow'a için 8-10 milyon hiRPE hücre kültüründe 2 hafta sonra toplanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İlk insan IPSC farklılaşma besleyici-Alerjik koşulları16 ekili için spontan farklılaşma (Şekil 1A) teşvik için Bi orta kullanarak kendini yenileme makine kapatmaya adımdır. O zaman, D2 Bi orta tamamlanmaktadır sinirsel ve Retina soy karşı ayırt iPSCs hücreleri gösterecek bir N2 takviyesi ile. Bu işlem neuroretinal tomurcukları etrafında D28 görünümünü yol açar (Şekil 1 c - 1E). Kendi kendini oluşturan neuroretinal yapıları Şekil 1E içinde gösterildiği gibi bir iğne kullanılarak ayrılmış olabilir ve kültür plakaları Retina organoids olgunlaşma ProB27 Orta (Şekil 1F) kullanarak kayan kültür koşullarda izin transfer. Büyüme ve gelişme sinirsel Retina iyilik için FGF2 1 hafta (Şekil 1A) için orta olarak eklenir.

D28 gelişmekte olan Retina yapıları ağırlıklı olarak hangi ortak anahtar transkripsiyon faktörü olarak PAX6, RAX ve VSX215hızlı Retina progenitör hücre içeriyor. Bu ataları yedi büyük sınıflara kültür koşulları insan Retina gelişimi ile tutarlı bir evrimsel korunmuş Doğum sırası yüzen olarak retina hücre tiplerinin neden olmaktadır. QRT-PCR ve daha önce açıklanan Reichman ve ark. immünhistokimya dayalı 15, Şekil 2 ' deki geniş eğriler dalgalar nesillerin erken ve geç-doğumlu Retina hücre bir vitro olgunlaşma sürecinde göster. Böylece, kültür zaman içinde organoids mevcut hücre türleri tanımlar.

Bu hücre rengi kendi görselleştirme verdiğinden yalnızca pigmentasyon algılanabilir olduğunda hiRPE hücreleri daha fazla amplifikasyon için yalıtım gerçekleştirilebilir. Bu şekilde, ProN2 orta D42 için RPE hücrelerinin15pigmentasyon lehine D28 kullanılır.

İnsan IPSC klon bağlı olarak pigmente yamaları önce veya sonra retina yapıları kendini oluşumu tespit edilebilir; Ama çoğunlukla 1-2 hafta ProN2 orta D28 kullanımdan sonra (Şekil 3A, B). HiRPE hücreleri izole yamalar, geçit 0 üzerinden genişletilmiş bir temsilcisi parlak alan görüntüsünü Şekil 3 c ve 3Dgösterilir. Sonra hiRPE hücreleri epitelyal mezenkimal geçişe (EMT) olmadan onların RPE fenotip istinat geçiş 4, kadar genişletilebilir. Yine de, EMT tarafından ROCK inhibitörleri gibi Y-27632, aynı zamanda hücre sayı pasajlar17lik bir artış sağlayan kullanımı önlenebilir. Uzun vadeli çözdürme sonra hiRPE hücre kültürleri olgun ve fonksiyonel epitel15elde etmek için burada açıklanan koşullarda kolayca gerçekleştirilebilir. Olgun hiRPEp2 hücre hafta 52 klasik tetrahedron Arnavut kaldırımlı görünümdeki adlı bir örnek Şekil 3Eiçinde gösterilmiştir.

Figure 1
Şekil 1: üretimi ve olgunlaşma yapisan insan iPSCs üzerinden Retina organoids. (A)Retina organoids nesil izin farklılaşma protokolü. (B) insan iPSCs D0 adlı. (C) neuroretinal epitel D15, ortaya çıkan. (D) kendi kendini oluşturan sinir retina benzeri yapılar D22. (E) burada, neuroretinal bud bir iğne kullanılarak izole edilmiştir. (F) kültür durumu D35 yüzen olarak retina organoids temsilcisi görüntülerini. Ölçek çubukları 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: insan IPSC kaynaklı Retina dalgaların hücre üretimi. Kısaltmalar: Retina progenitör hücre (RPC'ler), Retina ganglion hücrelerinin (RGCs), yatay hücreler (Ho), amacrine hücrelerinin (Am), Müller Gliyal hücreler (MGCs), bipolar hücreler (Bp) ve photoreceptors (PR). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: üretimi ve insan IPSC kaynaklı RPE amplifikasyon. (A) insan hiRPE hücre üretimi sağlayan farklılaşma Protokolü görülmektedir. (B) faz kontrast pigmentli gösteren yamalar yapisan insan iPSCs hafta 6 (W6) ayırt ortaya çıkan görüntüler. (C) hiRPEp0 hücreleri bir hafta (W1) Pigmentli yama malzeme çekme sonra ekili. (D) hiRPEp0 hücreleri haftası 6 (W6) Pigmentli yama malzeme çekme sonra. (E) A temsili resim çözme sonra hiRPEp2 hücrelerinin ekili 52 hafta (W52) ProN2 orta için. Ölçek çubukları 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu iletişim kuralı RPE hücrelerinin ve Retina organoids, Retina RGCs ve photoreceptors, xeno ve besleyici özgür koşullarda insan pluripotent kök hücrelerden içeren üretmek nasıl açıklar. Burada sunulan uyumlu iyi üretim uygulaması (GMP) süreci, ekili yöntemi ile retina hücreleri IPSC kaynaklı büyük bir üretim RPE hücrelerinin, RGCs ve photoreceptors kök hücre tabanlı terapiler ve ilaç geliştirilmesi için izin verir. keşif için Retina Dejeneratif hastalıkları tedavi gelecekte yaklaşıyor. Dondurma bütün Retina organoids veya hiRPE hücrelerin de ara hücre bankalar, kurulmasında önemli bir avantaj kök hücre tabanlı tedaviler ileride kullanmak için önemli bir adım sağlar.

Belirli Retina hücre tiplerinin büyük hisse senetleri üretim farklılaşma belirli bir aşamada gelecek klinik çeviri için gerekli olacaktır. Bu bağlamda, bir nakli uyumlu cep nüfus18ve bu olgunlaşmamış photoreceptors donma çözdürülen Retina oluşturmak için olasılık olarak üretimi CD73 pozitif photoreceptor öncüleri üç ay içinde açıklanan organoids15 güçlendirmek bu hücreleri tedavi amacıyla kullanmak için umut. Retina pigmentli epitel ile ilgili olarak, büyük hücreli üretimleri onları banka hiRPE hücreleri vitro çoğalırlar yeteneği sağlar. Önemlisi, çözdürülen insan IPSC kaynaklı RPE hücrelerinin onların RPE fenotip ve fonksiyonu, bu nedenle, onların rahatlık-in kullanma stratejileri de olarak süzmek için doğrulama trofik faktör salgı veya photoreceptor dış segment fagositoz15, korumak Gelecekteki tedavi yaklaşımları.

İletişim kuralları değişir IPSC kaynaklı Retina organoids7,8,9,10,11,12,15 nesil için çeşitli vardır (embryoid vücut gibi vs yapışık hücreleri toplar) yöntemleri verimlilik ve sağlamlık yanı sıra kültür. Burada açıklanan yöntemi yapisan insan iPSCs başlar ve tekrarlanabilir etkinliği, uyum ve insan IPSC satırları15geniş bir yelpazesi için Uygulanabilirlik gösterir. Serum-ücretsiz medya, art arda gelen değişiminde dayalı bu işlemi, Retina gelişimi ana adımları farklılaşma rehberlik sisteminin içsel ipuçları sömürerek beyannamedir. Bu protokol önemli bir avantaj embriyonik vücut oluşumu yokluğu ve gelecekteki GMP uyumlu Retina hücre hücre terapisi türevleri üretmek için protokolleri üretim için matris eklenmesi olduğunu. Bu şekilde, Retina organoid üretimi ve olgunlaşma verimliliğini hiçbir fark ya da değil hücre terapi sistemi (CTS) takviyeleri kullanarak, sadece rekombinant ile formüle xenogeneic ve no-xenogeneic kültür koşullar arasında bulundu veya insanlaşmış bileşenleri.

Retina farklılaşma yöntemi başarısı büyük ölçüde insan IPSC kültürler kalitesine bağlı. Programlama yöntemi Retina hücreleri8insan iPSCs farklılaşma verimliliğini etkilemez, ama onların stemness durumu en iyi olmak zorunda. Kısaca, rutin ekili insan iPSCs farklılaşma belirtileri göstermesi gerekir değil. Kolonilerin yok örtüşme ve onların karakteristik dairesel morfoloji görüntülemeniz gerekir. Retina farklılaşma verimliliğini klon bağımlı olmakla birlikte, iki Retina yapı cm2 başına en az 50-60 neuroretinal yapıları bir 6-cm yemek için karşılık gelen D28 alınabilir. Kayan kültür koşullarında Retina organoid olgunlaşma için iyi ücret yapıları sayısını sınırlama yapısı fusion ve orta overconsumption önler. Bu kültür koşullar içinde geç Retina hücre tipleri elde etmek için gereken kapsamlı bir süre Retina organoids maturated.

Dört gözle, bu yöntem tarafından oluşturulan Retina organoids vitro modeli retina hastalıkları için güçlü araçlar oluşturur. Hastaya özgü IPSC kaynaklı Retina hücre modelleri karmaşık veya genetik hastalıklar daha iyi anlamak için moleküler ve hücresel mekanizmaları keşif tarafından kullanılır. Bu modeller özellikle ilaç keşfi ile yüksek-den geçerek tarama, hücre ve gen terapileri veya genom Retina dystrophies için yenilikçi tedavileri geliştirmek için yaklaşımlar, düzenleme için uygun olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Sacha Reichman, Olivier Goureau ve José-Alain Sahel mucitler Retina hücreleri üretimi için insan pluripotent kök hücre ile ilgili patent bekleyen yanıyor.

Acknowledgments

Yazarlar kendi giriş için Goureau'nın ekibinin sırasında belgili tanımlık yöntem tanımlamak burada ve G. Gagliardi ve M. Garita up kendi eleştirel okuma için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser ANR gelen hibe tarafından desteklenmiştir (GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), Retina Fransa Derneği ve teknoloji transferi şirket SATT Lutech. Ayrıca Investissements d'Avenir programı (ANR-11-IDEX-0004-02) içinde ANR tarafından desteklenen LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65) çerçevesinde gerçekleştirildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated ThermoFisher Scientific A14700 Coating
CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated ThermoFisher Scientific A27940 Coating
Essential 8 Medium ThermoFisher Scientific A1517001 medium
Essential 6 Medium ThermoFisher Scientific A1516401 medium
CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement ThermoFisher Scientific A1370701 supplement CTS
N-2 Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17502048 supplement
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504044 supplement
CTS B-27 Supplement, XenoFree ThermoFisher Scientific A1486701 supplement CTS
DMEM/F-12 ThermoFisher Scientific 11320074 medium
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140035 supplement
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122 antibiotic
CellStart CTS ThermoFisher Scientific A1014201 Matrix CTS
Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix ThermoFisher Scientific A1569601 Matrix
Gentle Cell Dissociation Reagent Stemcell Technologies 7174 dissociation solution
Cryostem Freezing Media clinisciences 05-710-1D Cryopreservation medium
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) Preprotech 100-18B FGF2
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free Preprotech AF-100-18B FGF2 Xeno free
AGANI needle 23G Terumo AN*2332R1 Needle
Flask 25 cm² Tissue Culture Treated Falcon 353109 T-25 cm²
24 well plate Tissue Culture Treated Costar 3526 24-well plate
6 well plate Tissue Culture Treated Costar 3516 6-well plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, C., Wang, Q., Temple, S. Stem cell therapies for retinal diseases: recapitulating development to replace degenerated cells. Development. 144, 1368-1381 (2017).
  2. Dalkara, D., Goureau, O., Marazova, K., Sahel, J. -A. Let There Be Light: Gene and Cell Therapy for Blindness. Human Gene Therapy. 27, 134-147 (2016).
  3. Wright, L. S., Phillips, M. J., Pinilla, I., Hei, D., Gamm, D. M. Induced pluripotent stem cells as custom therapeutics for retinal repair: Progress and rationale. Experimental Eye Research. 123, 161-172 (2014).
  4. Leach, L. L., Clegg, D. O. Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients with Ocular Disease. Stem Cells. 33, 2363-2373 (2015).
  5. Gill, K. P., Hewitt, A. W., Davidson, K. C., Pébay, A., Wong, R. C. B. Methods of Retinal Ganglion Cell Differentiation From Pluripotent Stem Cells. Translational Vision Science and Technology. 3, 2 (2014).
  6. Giacalone, J. C., Wiley, L. A., et al. Concise review: Patient-specific stem cells to interrogate inherited eye disease. STEM CELLS Translational Medicine. 5, 132-140 (2016).
  7. Nakano, T., Ando, S., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
  8. Reichman, S., Terray, A., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 8518-8523 (2014).
  9. Meyer, J. S., Howden, S. E., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29, 1206-1218 (2011).
  10. Zhong, X., Gutierrez, C., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
  11. Mellough, C. B., Collin, J., et al. IGF-1 Signalling plays an important role in the formation of three dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33, 2416-2430 (2015).
  12. Gonzalez-Cordero, A., Kruczek, K., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9, 820-837 (2017).
  13. Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
  14. Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16698-16703 (2009).
  15. Reichman, S., Slembrouck, A., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).
  16. Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
  17. Croze, R. H., Buchholz, D. E., et al. ROCK inhibition extends passage of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium. Stem Cells Translational Medicine. 3, 1066-1078 (2014).
  18. Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, 6462-6471 (2011).

Tags

Gelişim biyolojisi sayı: 139 Retina organoids pluripotent kök hücreler farklılaşma hücre tedavileri ilaç bulma
Tanımlanmış Xeno-alerjik ve besleyici-Alerjik kültür koşulları üretimi insan IPSC kaynaklı Retina hücre modelleri için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Slembrouck-Brec, A., Nanteau, C.,… More

Slembrouck-Brec, A., Nanteau, C., Sahel, J. A., Goureau, O., Reichman, S. Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models. J. Vis. Exp. (139), e57795, doi:10.3791/57795 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter