Summary
Produktionen av specialiserade retinala celler från pluripotenta stamceller är en vändpunkt i utvecklingen av stem cell-baserad terapi för retinala sjukdomar. Detta dokument beskriver en enkel metod för en effektiv generering av retinal organoids och retinal pigmenterade epitel för grundläggande, translationell och klinisk forskning.
Abstract
Produktionen av specialiserade celler från pluripotenta stamceller ger ett kraftfullt verktyg för att utveckla nya tillvägagångssätt för regenerativ medicin. Användningen av mänskliga-inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) är särskilt attraktiva för neurodegenerativa sjukdomen studier, inklusive retinala dystrofier, där iPSC-derived retinal cellmodeller markerar ett stort steg framåt att förstå och bekämpa blindhet. I den här artikeln beskriver vi en enkel och skalbar protokoll för att generera, mogen och frysa retinal organoids. Baserat på medellång förändras, den största fördelen med denna metod är att undvika flera och tidskrävande steg krävs allmänt en guidad differentiering av iPSCs. Detta protokoll härma tidiga faser av retinal utveckling av successiva förändringar av definierade media på vidhäftande mänskliga iPSC kulturer, och tillåter samtidig framställning av själv bildar neuroretinal strukturer och retinal pigmenterade (RPE) epitelceller i en reproducerbar och effektivt sätt i 4 veckor. Dessa strukturer som innehåller retinal stamceller (RPC-anrop) kan isoleras enkelt för vidare mognad i ett flytande kultur-villkor som möjliggör differentiering av RPC-anrop till de sju retinal celltyper som förekommer i vuxen mänskliga näthinnan. Dessutom beskriver vi snabba metoder för Frysförvaring av retinal organoids och RPE-celler för långsiktig lagring. Kombineras, kommer att metoderna som beskrivs här vara användbart att producera och bankens mänskliga iPSC-derived retinala celler eller vävnader för både grundforskning och klinisk forskning.
Introduction
Näthinnan är en integrerad del av det centrala nervsystemet (CNS) och har begränsad förmåga att regenerera spontant efter en traumatisk skada eller sjukdomar. Därför, degenerativa sjukdomar orsakar slutgiltiga retinal cellförlust, såsom åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP), glaukom och diabetesretinopati, normalt leda till irreversibel blindhet. Undsättning degenererade näthinnan är en stor utmaning som stamceller-baserade terapier som syftar till att ersätta de skadade eller förlorade cellerna är en av de mest lovande metoder1,2,3. Pluripotenta stamceller som mänskliga embryonala stamceller (råden) celler eller mänskliga-inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) har kapacitet att utökas på obestämd tid i kultur, och de har potential att producera alla celltyper. Framsteg i förståelsen av retinal utveckling och förbättring av in vitro- protokoll för mänskliga iPSC differentiering har resulterat i generationen av retinal organoids7,8,9, 10,11,12. Alla stora retinala celler, inklusive retinala ganglionceller (RGCs), fotoreceptorer och retinal pigmenterade epitelceller (RPE) har varit framgångsrikt åtskilt från mänskliga och sociala råden och iPSCs4,5, 6. utifrån metoden SFEB (serumfritt kultur av embryoid organ-liknande aggregat) som utvecklats av Eiraku et al. 13, själva bildandet av retinal organoids kan erhållas från ESC - eller iPSC-härledda embryoid organ-liknande aggregat i definierade extracellulär matrix komponenter7,10,14. Men dessa protokoll är invecklade, vilket kräver ett stort antal steg inte alltid kompatibel med stora produktionen av celler för behandlingsmetoder eller drogkontroll. Alltså, valet av metoden att producera mänskliga retinala celler är kritisk och metoden måste vara robust, skalbar och effektiv.
Här beskriver vi baserat på våra tidigare publikation15, varje steg för en enkel och effektiv generation av näthinnans celler genom retinal organoid själv bildas från vidhäftande mänskliga iPSCs odlas i en feeder-fri och xeno skick. Detta protokoll från rutinmässig kulturer av vidhäftande mänskliga iPSCs, och kräver bara en enkel successiva medium förändras så att generationen av både iPS-derived RPE (hiRPE)-celler och neuroretinal strukturer i 4 veckor. Efter en manuell isolering, hiRPE kan utvidgas och retinal strukturer kan vara odlade som flytande organoids där de retinala stamceller ska kunna differentieras till alla retinala celltyper i en ordningsföljd som är konsekvent med människan i vivo retinogenesis. Slutligen, för forskning befordran eller kliniska översättning beskriver vi en frysförvaring metod så att den långsiktiga lagringen av hela retinal organoids och hiRPE celler utan att påverka deras fenotypiska egenskaper och funktionalitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet beskrivs i detta dokument följer riktlinjerna i Institut de la Visions forskningsetisk kommitté. Institut de la visionen har tillåtits manipulering av mänskliga prov enligt den nuvarande franska förordningen. Provhantering följer patientens dataskydd i enlighet med Helsingfors grundsatser och nationella förordningar efter etiskt godkännande av ”Comité de Protection des Personnes (CPP) Ile-de-France V”.
1. beredning av kultur Media och rätter
-
Kultur media
- Använda iPSC medium, ett kemiskt definierat medium tillägnad pluripotenta stamceller kultur i feeder-fri villkorar16. Förbereda 500 mL medium enligt tillverkarens protokollet.
- Användning Basal iPSC (Bi) medium, iPSC kemiskt definierade medium utan fibroblast tillväxtfaktor 2 (FGF2) eller omvandla tillväxtfaktor Beta (TGFß).
- Förbereda 500 mL Bi medium kompletteras med 1% N2 supplement (BiN2 medium), 10 enheter/mL penicillin och 10 mg/mL streptomycin.
- Förbereda 500 mL proneural N2-baserade medium (ProN2 medium) består av DMEM:Nutrient blandning F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-glutamin), 1% MEM onödiga aminosyror, 1% N2 supplement, 10 enheter/mL av penicillin och 10 mg/mL streptomycin.
- Förbereda proneural B27-baserade medium (ProB27 medium) består av DMEM:Nutrient blandning F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-glutamin), 1% MEM onödiga aminosyror, 2% B27 tillägg, 10 enheter/mL av penicillin och 10 mg/mL streptomycin.
-
Kultur fartyget förberedelse
-
För mänskliga iPSC kultur
- Förbereda 10 mL en Aktiebolaget Trav & galopp lösning innehållande 5 μg/mL Aktiebolaget Trav & galopp i 1 x PBS. I 10 mL 1 x PBS, tillsätt 100 µL av tinade Aktiebolaget Trav & galopp stamlösning (100 x).
- Fördela 2 mL Aktiebolaget Trav & galopp lösning per 6-cm kultur maträtt motsvarar 0,5 µg/cm2. Inkubera det 1 h i rumstemperatur (RT). Ta bort Aktiebolaget Trav & galopp lösningen genom aspiration med ett vakuum-aspiration system eller 5 mL pipett.
- Tillsätt 4 mL av iPSC medium per 6-cm skålen.
- Inkubera rätter i en cell kultur inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 i minst 30 min innan användning.
- För mänsklig iPSC-derived RPE (hiRPE) cellkultur
- Använd en pluripotenta stamceller-kvalificerade matris eller substrat för att bestryka brunnar enligt tillverkarens protokollet. Lägg till tillräcklig matris eller substrat för att täcka hela tillväxten yta. Exempelvis Lägg 300 µL av matris per brunn i plattan 24 brunnar och 3 mL matris i en T-25 cm2 kolv.
- Inkubera de belagda odlingskärl i minst 1 h vid 37 ° C. Ta bort matrisen använder vakuum-aspiration system eller 5 mL pipett.
- Tillsätt 1 mL av ProN2 medium per brunn på 24 brunnar och återgå kultur fartyget till inkubatorn i minst 30 min att värma och jämvikt på medellång. Om T-25 cm2 kolvar, se steg 5.2.
-
För mänskliga iPSC kultur
2. underhåll och utbyggnad av mänskliga iPSCs
-
Underhåll av mänskliga iPSCs
- Förbered 3 mL för iPSC medium i en 15 mL tub och förvara den i RT i minst 15 min innan användning. Förbereda en belagd 6 cm maträtt som beskrivs i punkt 1.2.1.
- Tina en kryogen prov av mänskliga iPSCs från en flytande kväve tank eller en-150 ° C frys genom inkubation i vattenbad vid 37 ° C i 30 s.
- Noggrant desinficera kryogen injektionsflaskan med en desinficerande lösning spray. Överföra den tinade mänskliga iPSCs från cryotube till 15 mL röret innehållande 3 mL av iPSC medium pre värmde på RT.
- Centrifugera röret vid 110 x g i 3 min. ta bort supernatanten genom aspiration med ett vakuum-aspiration system eller 5 mL pipett.
- Återsuspendera cellpelleten med 1 mL av iPSC medium från en Aktiebolaget Trav & galopp-belagd 6 cm kultur maträtt med pipett 2 mL och överför cellerna tillbaka till skålen. Återgå skålen till inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 för minst 24 h innan du ändrar mediet.
Obs: En ROCK-hämmare, såsom Y-27632 vid 10 µM, kan läggas till iPSC medium i 6 cm kultur rätter att minska apoptos. - Mediet dagligen och passera den mänskliga iPSCs varje vecka.
-
Passaging av mänskliga iPSCs
- Passera mänskliga iPSC på en 70-80% confluence, klassiskt efter 7 dagar i kultur.
- Förbereda 6 cm rätter för den passaging som beskrivs i steg 1.2.1. Ta bort iPSC mediet från rätter med konfluenta iPSCs och tillsätt 2 mL av en dissociation lösning för 6 min på RT.
Obs: Inkubationstiden beror på iPSC klonerna. Prova en 6 minuters inkubation som en start. - Ta bort dissociation lösningen använder vakuum-aspiration system eller 5 mL pipett och tillsätt 2 mL av iPSC medium har pre värmas på RT. Omsuspendera iPSC kolonierna av pipettering dem upp och ned 5-10 x med 1000 µL pipett.
FÖRSIKTIGHET: Undvik enda cell dissociation från överdriven pipettering. - Överföra 30 till 200 µL återsuspenderad cell klumpar i en ny 6-cm kultur maträtt. Tillbaka rätterna till cell kultur inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 för minst 24 h innan du ändrar mediet.
Obs: Volymen av återsuspenderade cell klumpar behövs för den passaging beror på iPSC klonerna. - Mediet dagligen och passera den mänskliga iPSCs varje vecka.
3. generation av Retinal Organoids
- Starta iPSC differentiering efter protokollet schematized i figur 1A när kolonierna når en 60-70% sammanflödet (figur 1B).
- Förbered 4 mL Bi medium per 6-cm skålen. Värma Bi medellång till 37 ° C. Ändra på iPSC medellång till Bi medium. Observera denna gång som dag 0 (D0).
- D2, Byt kulturerna i Bi mediet till en BiN2 medium, tidigare värmde vid 37 ° C. Ändra på medellång varje 2-3 dagar.
- Identifiera framväxande själv bilda retinal organoids av neuroepithelium knoppar, som visas i figur 1 c -1E.
Obs: Dessa tidiga retinal organoids, motsvarande i sin utvecklingsfas till optic cup, kan isoleras manuellt för nedströms experiment.
4. mognaden av Retinal Organoids
- På D28, förbereda 6-väl plattor som innehåller 4 mL per brunn ProB27 medium initialt kompletteras med 10 ng/mL FGF2 (figur 1A).
Lägg Till FGF2 omedelbart innan media läggs till plattorna.
Varning: Inte filtrera FGF2. - Återställa de retinala strukturerna från de 6 cm rätterna manuellt. För att göra detta, isolera de strukturer som gör vinkelrätt strimmor med nålen runt den neuroepithelial knoppen, som visas i figur 1E, och lossa organoids genom att försiktigt skrapa dem med nålen.
- Sug ut 10-15 organoids med 1000 µL pipett och överföra dem i en enda brunn av 6-väl plattan som innehåller ProB27 medium.
- Hålla den retinala organoids i flytande odlingsbetingelser i ProB27 medium i en cell kultur inkubator vid 37 ° C och 5% CO2. Ändra hälften av medlet efter 2-3 dagar.
Obs: Behandla organoids med FGF2 tills D35. - På D35, ta bort hälften av medium och lägga till färska förvärmd ProB27 medium vid 37 ° C utan FGF2.
- Ändra hälften av medium varje 2-3 dagar under den tid som krävs för att erhålla önskad retinal celltyper enligt uppkomsten av retinal celltyper, som avbildas i figur 2.
5. generation och förstärkning av mänskliga iPSC-derived RPE (hiRPE) celler
-
Generering av mänskliga hiRPE celler
- Engagera iPSCs differentiering när kolonierna når en 60-70% confluence, efter protokollet schematized i figur 3A.
- Förbered 4 mL per 6-cm skålen av Bi medium och varma Bi mediet vid 37 ° C. Ändra på iPSC medellång till Bi medium. Observera denna gång som dag 0 (D0).
- D2, Byt kulturerna i Bi medium till ett BiN2 medium tidigare värmde vid 37 ° C. Ändra på medellång varje 2-3 dagar.
- D28, ändra mediet till en färsk ProN2 medium tidigare värmde vid 37 ° C som avbildas i figur 3A.
Obs: Detta steg kan göras efter organoid plockning beskrivs i steg 4. - Ändra ProN2 medium varje 2-3 dagar.
- På D42, identifiera framväxande hiRPE celler genom observation av pigmenterade fläckar som visas i figur 3B.
Obs: Pigmentering av hiRPE celler visas mellan D35 till D56 beroende på iPSC klonerna.
-
Förstärkning av hiRPE celler
- På D42, förbereda en 24-well platta tidigare belagda med matrisen som beskrivs i steg 1.2.2 och innehållande 1 mL ProN2 medium per brunn. Placera plattan i 15 min i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 före användning.
- Återställa hiRPE patchar från 6-cm skålen manuellt. Att isolera patchar, göra en vinkelrät strimmor med nålen runt pigmenterade epitel och lossa arket genom att försiktigt skrapa den med nålen. Aspirera 10 pigmenterade fläckar med 1000 µL pipett och överföra dem i en enda brunn Skyltens 24 brunnar.
- Håll hiRPE patchar i ProN2 medium i en cell kultur inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 för 48 h innan du ändrar mediet. Observera denna hiRPE cell passage som 0 (hiRPEp0). Ändra på medellång varje 2-3 dagar med ProN2 medium.
- Passera hiRPEp0 cellerna när cellerna är konfluenta.
- Ta bort mediet använder vakuum-aspiration system och tvätta varje väl 1 x med 1 mL PBS med 5 mL pipett.
- Kassera PBS använder vakuum-aspiration system, tillsätt 200 µL per brunn av 0,25% trypsin och inkubera det minst 15 min i en inkubator vid 37 ° C. Tillsätt 800 µL av ProB27 medium att inaktivera trypsin.
Obs: Användning av ProN2 medium att stoppa aktiviteten trypsin rekommenderas inte. - Separera bladet av hiRPE celler genom pipettering det upp och ner. Placera cellsuspensionen i en 15 mL rör och centrifugera det i 5 min vid 110 x g.
Obs: En ytterligare tvätta kan göras med ProN2 medel att ta bort överskottet av ProB27 medium. - Avlägsna supernatanten och återsuspendera försiktigt cellpelleten i 2 mL av ProN2 medium pre värmas vid 37 ° C. Räkna cellerna med en cell räknare.
- Ta 1,25 miljoner celler och placera dem i en matris-belagd T-25 cm2 kolv (se steg 2.2.2) innehållande 5 mL av ProN2 medium pre värmas vid 37 ° C. Observera denna hiRPE cell passage som 1 (hiRPEp1).
- Hålla de hiRPE cellerna i ProN2 mediet i en cell kultur inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 för 48 h innan du ändrar mediet.
- Ändra media varje 2-3 dagar. När de hiRPEp1 cellerna når sammanflödet, utföra nästa passage eller frysförvaring.
6. Frysförvaring av Retinal Organoids och hiRPE celler
-
För hela retinal organoids
- Välj 5 till 20 retinal organoids använder en överföring Pipettera och placera dem i en kryogen injektionsflaska. Ta bort eventuella överskott medium med 1000 µL pipett utan att röra organoids på botten av röret och tillsätt 250 µL kallt frysförvaring medium (se Tabell för material).
- Frysa injektionsflaskorna i en isopropanol-baserade frysning behållare vid-80 ° C i minst 4 h. överföring av frysta injektionsflaskor till en-150 ° C frys eller flytande kväve tank för långsiktig lagring.
-
För hiRPE celler
- Vid passagen 1, separera hiRPE cellerna när cellerna är konfluenta.
Obs: En Frysförvaring av hiRPEp0 celler rekommenderas inte. - Sug ut mediet från den T-25 cm2 flask med vakuum-aspiration system och tvätta det 1 x med 3 mL PBS med 5 mL pipett.
- Ta bort PBS använder vakuum-aspiration system, tillsätt 1 mL av 0,25% trypsin och inkubera det minst 15 min i en inkubator vid 37 ° C. Tillsätt 5 mL av ProB27 medium att stoppa aktiviteten trypsin.
Obs: Användning av ProN2 medium att inaktivera trypsin rekommenderas inte. - Separera bladet av hiRPE celler genom pipettering det upp och ner med 10 mL pipett. Räkna cellerna med cell counter. Placera cellsuspensionen i en 15 mL rör och centrifugera det i 5 min vid 110 x g.
Obs: En ytterligare tvätta kan utföras med ProN2 medium att ta bort överskottet av ProB27 medium. - Aspirera supernatanten med vakuum-aspiration och försiktigt Omsuspendera cellerna för att få 2 miljoner celler i 250 µL av frysförvaring medium.
- Över 250 µL cellsuspension per kryogen injektionsflaska. Frysa injektionsflaskorna i en isopropanol-baserade frysning behållare vid-80 ° C i minst 4 h.
- Överföra de frysta injektionsflaskorna till-150 ° C frys eller en flytande kväve tank för långsiktig lagring.
- Vid passagen 1, separera hiRPE cellerna när cellerna är konfluenta.
7. upptining av Retinal Organoids och hiRPE celler
-
Upptining av hela retinal organoids
- Varm ProB27 medium vid 37 ° C (2 mL kommer att krävas för kryogen en injektionsflaska).
- Från flytande kväve tank eller -150 ° C frys, Tina en kryogen injektionsflaska innehållande retinal organoids i ett vattenbad vid 37 ° C för 30 s. desinficera kryogen injektionsflaskan försiktigt med en desinficerande lösning spray.
- Öppna flaskan och tillsätt 1 mL av pre värmde ProB27 medium. Överföra organoids till ett 1,5 mL rör med överföring pipett.
- Ta försiktigt bort mediet genom pipettering det utan att röra de retinala strukturerna på botten av röret. Tvätta organoids 1 mer tid med 1 mL av pre värmde ProB27 medium.
- Aspirera på organoids med en överföring Pipettera och placera dem i 1 väl i en 6-well platta innehållande ProB27 medium pre värmde och jämviktas i en inkubator på 37 ° C och 5% CO2.
Obs: Plats 10-15 retinal organoids per brunn 6-bra platta. - Ändra hälften av medium varje 2-3 dagar under den tid som krävs för att erhålla önskad retinal celltyper enligt deras uppkomst, som beskrivs i figur 2.
-
Upptining av hiRPE celler
- Varm ProN2 medium vid 37 ° C (8 mL kommer att krävas för kryogen en injektionsflaska).
- Från flytande kväve tank eller -150 ° C frys, Tina en kryogen urval av hiRPEp1 celler genom en inkubation i ett vattenbad vid 37 ° C för 30 s. desinficera kryogen injektionsflaskan försiktigt med desinficerande lösning spray.
- Öppna tuben och tillsätt 1 mL av pre värmde ProN2 medium och överföra cellsuspensionen till en 15 mL tub innehållande 2 mL före värmde ProN2 medium. Centrifugera det 5 min vid 110 x g.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera försiktigt cellpelleten i 2 mL av ProN2 medium pre värmas vid 37 ° C.
- Räkna cellerna med en cell räknare.
- Ta 1,25 miljoner celler och placera dem i matrix-belagd T-25 cm2 kolven (se steg 2.2.2) innehållande 5 mL av ProN2 medium pre värmas vid 37 ° C. I detta skede, notera att passagen som 2 (hiRPEp2).
- Håll hiRPEp2 cellerna i ProN2 medium i cell kultur inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 för 48 h innan du ändrar mediet.
- Ändra media varje 2-3 dagar. När de hiRPE cellerna når sammanflödet, utföra nästa passage eller frysförvaring.
Obs: Efter 2 veckor i kultur, 8-10 miljoner hiRPE celler kan tas ut för ytterligare experimenterande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det första steget för mänskliga iPSC differentiering odlas i feeder-fria villkor16 är att stänga självförnyelse maskiner använder Bi medium för att uppmuntra en spontan differentiering (figur 1A). Sedan, på D2, Bi medium kompletteras med ett N2 tillägg att vägleda särskiljande iPSCs cellerna mot de neurala och retinal härstamningar. Denna process leder till uppkomsten av neuroretinal knoppar på runt D28 (figur 1 c - 1E). Själv bilda neuroretinal strukturer kan isoleras med hjälp av en nål som illustreras i figur 1E och överförs till kultur plattor att tillåta mognaden av den retinala organoids i flytande odlingsbetingelser på ProB27 medium (figur 1F). För att gynna tillväxt och utveckling av neurala näthinnan, läggs FGF2 till medium för 1 vecka (figur 1A).
D28 innehåller de framväxande retinal strukturerna huvudsakligen retinala stamceller som samtidigt uttrycker de viktiga transkriptionsfaktor som PAX6, RAX och VSX215. Dessa stamfäder ge upphov till de sju stora klasserna av retinal celltyper i flytande odlingsbetingelser i ett evolutionärt bevarade födelseordning överensstämmer med mänsklig retinal utveckling. Baserat på qRT-PCR och immunohistokemi som tidigare beskrivits i Reichman o.a. 15, bred kurvorna i figur 2 visar vågor av tidiga och sena-födda retinal cell generationer under en in vitro- mognadsprocess. Således definierar kultur tiden celltyper som finns i organoids.
Isolering av hiRPE celler för ytterligare förstärkning kan utföras endast när pigmentering är märkbar eftersom denna cell färg gör sin visualisering. På detta sätt används ProN2 mediet från D28 till D42 för att gynna pigmentering av RPE celler15.
Beroende på den mänskliga iPSC klonen, kan den pigmenterade fläckar upptäckas före eller efter själva bildandet av retinal strukturer. men mestadels 1-2 veckor efter användning av ProN2 medium på D28 (figur 3A, B). En representativ ljusa fältet bild av hiRPE celler expanderat från de isolerade fläckar på passage 0 visas i figur 3 c och 3D. HiRPE cellerna kan sedan utökas tills passage 4, behålla sin RPE fenotyp utan en epitelial-mesenkymala övergång (EMT). EMT kan dock förebyggas genom användning av ROCK-hämmare såsom Y-27632, vilket också en ökning av cell nummer passager17. Långsiktiga kulturer av hiRPE celler efter upptining kan enkelt utföras i de villkor som beskrivs här för att få en mogen och funktionella epitel15. Ett exempel på mogna hiRPEp2 celler vid vecka 52 med en klassisk ton kullersten morfologi illustreras i figur 3E.
Figur 1: Generation och mognaden av retinal organoids från vidhäftande mänskliga iPSCs. (A) differentiering protokoll möjliggör generering av retinal organoids. (B) mänskliga iPSCs på D0. (C) framväxande neuroretinal epitel på D15. (D) själv bilda neural retina-liknande strukturer på D22. (E) här, den neuroretinal knoppen är isolerad med hjälp av en nål. (F) representativa bilder av retinal organoids i flytande kultur skick på D35. Skala barer = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: vågor av mänskliga iPSC-derived retinal cell generation. Förkortningar: Retinal stamceller (RPC-anrop), retinala ganglionceller (RGCs), horisontella celler (Ho), amakrina celler (Am), Müller gliaceller (MGCs), bipolära celler (Bp) och fotoreceptorer (PR). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Generation och förstärkning av mänsklig iPSC-derived RPE. (A) en illustration av protokollet differentiering möjliggör generering av mänskliga hiRPE celler. (B) faskontrast bilder visar pigmenterade fläckar från att differentiera vidhäftande mänskliga iPSCs i vecka 6 (W6). (C) hiRPEp0 celler odlade en vecka (W1) efter pigmenterade patch plockning. (D) hiRPEp0 celler vecka 6 (W6) efter pigmenterade patch plockning. (E) A representativ bild av hiRPEp2 celler efter upptining, odlas för 52 veckor (W52) i ProN2 medium. Skala barer = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det här protokollet beskriver hur man producerar RPE-celler och retinal organoids, innehållande retinal RGCs och fotoreceptorer, från mänskliga pluripotenta stamceller i xeno-fri och feeder villkor. Kompatibel med god tillverkningssed (GMP) processen, metoden odlade presenteras här tillåter en stor produktion av iPSC-derived näthinnans celler som RPE celler, RGCs och fotoreceptorer för utveckling av stamceller-baserade terapier och läkemedel Discovery närmar sig för framtida behandling av retinala degenerativa sjukdomar. Frysförvaring av hela retinal organoids eller hiRPE celler ger också en stor fördel att fastställa mellanliggande cellbanker, ett viktigt steg för framtida användning i stamceller-baserade behandlingar.
Produktionen av stora lager av specifik retinal celltyper i ett visst skede av differentiering kommer att krävas för framtida kliniska översättning. I detta avseende generationen i tre månader av CD73-positiv ljusmätare prekursorer beskrivs som en transplantation-kompatibel cell befolkningen18, och möjligheten att generera dessa omogna fotoreceptorer från freeze-tinade retinal organoids15 förstärka hoppas att använda dessa celler för terapeutiska ändamål. När det gäller retinal pigmenterade epitel tillåter hiRPE cellernas förmåga att föröka sig i vitro stora cell produktioner att banken dem. Ännu viktigare, behåller tinade mänskliga iPSC-derived RPE-celler sin RPE fenotyp och funktion, därför som trofiska faktor sekretion eller ljusmätare yttre segmentet fagocytos15, validera deras användarvänlighet för screening strategier såväl som för framtida behandlingsmetoder.
Det finns en mängd olika protokoll för generering av iPSC-derived retinal organoids7,8,9,10,11,12,15 som varierar i kultur metoder (embryoid organ-liknande aggregat vs. vidhäftande celler) samt effektivitet och tålighet. Den metod som beskrivs här startar från vidhäftande mänskliga iPSCs och visar en reproducerbar effekt, anpassningsförmåga och tillämplighet på ett brett utbud av mänskliga iPSC linjer15. Denna process, baserat på den successiva förändringen av serum-fria medier, sammanfattas de viktigaste stegen i näthinnans utveckling genom att utnyttja de inneboende ledtrådar i systemet för att vägleda differentiering. En viktig fördel med detta protokoll är avsaknad av embryonala kroppen bildandet och tillägg av matrix för framtida GMP-kompatibla retinal cell tillverkning protokoll för att producera cell terapi derivat. På så sätt hittades ingen skillnad i effektivitet av retinal organoid generering och mognad mellan xenogena och nr-xenogena odlingsbetingelser använder Cell terapi System (CTS) kosttillskott eller inte, framtagen uteslutande med rekombinant eller humaniserad komponenter.
Framgången med metoden retinal differentiering beror till stor del på kvaliteten på de mänskliga iPSC kulturerna. Metoden omplanering påverkar inte mänskliga iPSCs till näthinnans celler8differentiering effektivitet, men deras stemness status måste vara optimal. Sammanfattningsvis bör rutinmässigt odlade mänskliga iPSCs inte visar några tecken på differentiering. Kolonierna bör inte överlappar varandra och måste visa sin karakteristiska cirkulär morfologi. Även om effektiviteten av retinal Differentieringen är klon-beroende, kan minst två retinal strukturer per cm2 hämtas vid D28, motsvarande 50-60 neuroretinal strukturer för en 6-cm maträtt. För retinal organoid mognaden i flytande odlingsbetingelser undviker begränsning av antalet strukturer per brunn struktur fusion och medelstora överkonsumtion. I dessa odlingsbetingelser, kan retinal organoids vara maturated för en omfattande tid, krävs för att få sent retinal celltyper.
Ser fram emot, utgör retinal organoids genereras i vitro genom denna metod kraftfulla verktyg till modell retinala sjukdomar. Patient-specifika iPSC-derived retinal cellmodeller kommer att användas att bättre förstå komplexa eller genetiska sjukdomar av utforskandet av deras molekylära och cellulära mekanismer. Dessa modeller kommer att vara särskilt lämplig för läkemedelsutveckling genom hög genomströmning screening, cell och genterapi terapier eller genomet redigering metoder, för att utveckla innovativa behandlingar för retinala dystrofier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sacha Reichman, Olivier Goureau och José-Alain Sahel är uppfinnare på väntande patent relaterade till generation av näthinnans celler från mänskliga pluripotenta stamceller.
Acknowledgments
Författarna vill tacka medlemmarna i Goureau's team för deras insatser under installationen av de metoder som beskrivs här, och G. Gagliardi och M. Garita för deras kritisk läsning. Detta arbete stöds av bidrag från ANR (GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), föreningen Retina Frankrike och den tekniköverföring företaget SATT Lutech. Det framfördes också inom ramen för den LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65) stöds av ANR inom programmet Investissements pris (ANR-11-IDEX-0004-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A14700 | Coating |
| CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A27940 | Coating |
| Essential 8 Medium | ThermoFisher Scientific | A1517001 | medium |
| Essential 6 Medium | ThermoFisher Scientific | A1516401 | medium |
| CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | A1370701 | supplement CTS |
| N-2 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | supplement |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | supplement |
| CTS B-27 Supplement, XenoFree | ThermoFisher Scientific | A1486701 | supplement CTS |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | supplement |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | antibiotic |
| CellStart CTS | ThermoFisher Scientific | A1014201 | Matrix CTS |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFisher Scientific | A1569601 | Matrix |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | dissociation solution |
| Cryostem Freezing Media | clinisciences | 05-710-1D | Cryopreservation medium |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Preprotech | 100-18B | FGF2 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free | Preprotech | AF-100-18B | FGF2 Xeno free |
| AGANI needle 23G | Terumo | AN*2332R1 | Needle |
| Flask 25 cm² Tissue Culture Treated | Falcon | 353109 | T-25 cm² |
| 24 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3526 | 24-well plate |
| 6 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3516 | 6-well plate |
References
- Zhao, C., Wang, Q., Temple, S. Stem cell therapies for retinal diseases: recapitulating development to replace degenerated cells. Development. 144, 1368-1381 (2017).
- Dalkara, D., Goureau, O., Marazova, K., Sahel, J. -A. Let There Be Light: Gene and Cell Therapy for Blindness. Human Gene Therapy. 27, 134-147 (2016).
- Wright, L. S., Phillips, M. J., Pinilla, I., Hei, D., Gamm, D. M. Induced pluripotent stem cells as custom therapeutics for retinal repair: Progress and rationale. Experimental Eye Research. 123, 161-172 (2014).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients with Ocular Disease. Stem Cells. 33, 2363-2373 (2015).
- Gill, K. P., Hewitt, A. W., Davidson, K. C., Pébay, A., Wong, R. C. B. Methods of Retinal Ganglion Cell Differentiation From Pluripotent Stem Cells. Translational Vision Science and Technology. 3, 2 (2014).
- Giacalone, J. C., Wiley, L. A., et al. Concise review: Patient-specific stem cells to interrogate inherited eye disease. STEM CELLS Translational Medicine. 5, 132-140 (2016).
- Nakano, T., Ando, S., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Reichman, S., Terray, A., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 8518-8523 (2014).
- Meyer, J. S., Howden, S. E., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29, 1206-1218 (2011).
- Zhong, X., Gutierrez, C., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
- Mellough, C. B., Collin, J., et al. IGF-1 Signalling plays an important role in the formation of three dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33, 2416-2430 (2015).
- Gonzalez-Cordero, A., Kruczek, K., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9, 820-837 (2017).
- Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16698-16703 (2009).
- Reichman, S., Slembrouck, A., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).
- Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
- Croze, R. H., Buchholz, D. E., et al. ROCK inhibition extends passage of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium. Stem Cells Translational Medicine. 3, 1066-1078 (2014).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, 6462-6471 (2011).
