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Developmental Biology

정의 된 이종 무료 및 급지대 무료 문화 세대의 인간 iPSC 파생 된 망막 세포 모델에 대 한

Published: September 6, 2018 doi: 10.3791/57795
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Institut de la Vision, Sorbonne Université, INSERM, CNRS, F-75012 Paris, France
* These authors contributed equally

Summary

전문된 망막 세포 pluripotent 줄기 세포의 생산은 망막 질환 줄기 세포 기반 치료의 발전에 있는 전환 점을. 현재 종이, 변환, 기본 및 임상 연구에 대 한 organoids 망막과 망막 색소 상피의 효율적인 생성을 위한 간단한 방법을 설명합니다.

Abstract

만능 줄기 세포에서 특수 세포의 생산 재생 의학에 대 한 새로운 접근을 개발 하는 강력한 도구를 제공 합니다. 인간 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 사용은 어디 iPSC 파생 된 망막 세포 모델 이해 하 고 실명을 싸울 중요 한 단계를 앞으로 표시 neurodegenerative 질병 연구, 망막 dystrophies를 포함 하 여 특히 매력적 이다. 이 논문에서는, 우리 생성, 성숙, 망막 organoids cryopreserve을 간단 하 고 확장 가능한 프로토콜을 설명 합니다. 변화 하는 매체에 따라,이 방법의 주요 장점은 여러 방지 이며 Ipsc의 가이드 차별화에 필요한 일반적으로 시간이 많이 걸리는 단계. 부착 인간의 iPSC 문화에 정의 된 미디어의 연속적인 변화에 의해 망막 개발의 초기 단계를 흉내 낸,이 프로토콜 자체 neuroretinal 구조에 망막 안료 상피 (RPE) 세포 형성의 동시 발생을 사용 하는 4 주에 재현 하 고 효율적인 방식 으로입니다. 성인 인간의 망막에 7 망막 세포 유형으로 Rpc의 차별화를 활성화 부동 문화 상태에서 더 성숙 망막 조상 세포 (Rpc)을 포함 하는 이러한 구조 쉽게 격리 될 수 있습니다. 또한, 우리 망막 organoids의 cryopreservation 빠른 방법 및 RPE 세포 장기 저장에 대 한 설명합니다. 함께 결합, 여기에 설명 된 방법을 생산 하 고 인간의 iPSC 파생 된 망막 세포 또는 조직 모두 기본 및 임상 연구에 대 한 은행 유용 있을 것입니다.

Introduction

망막 중앙 신경 시스템 (CNS)의 중요 한 부분이 이며 자발적으로 외상 성 부상이 나 질병에 따라 다시 생성 제한 된 용량을 하고있다. 따라서, 연령 관련 황 반 변성 (AMD), 망막 화 (RP), 녹 내장, 당뇨병 성 망막 증 등 확실 한 망막 세포 손실의 원인이 퇴행 성 병 리는 일반적으로 돌이킬 수 없는 실명으로 이어질. 퇴 화 된 망막 구조를 손상 또는 분실 된 세포를 대체 하는 것을 목표로 하는 줄기 세포 기반 요법 가장 유망한 접근1,,23중 하나는 주요 도전 이다. 인간 배아 줄기 세포 (ESCs) 세포로 만능 줄기 세포 또는 인간 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc) 문화, 무한정 확장 될 수 있고 그들은 모든 종류를 생산 하는 잠재력을가지고. 망막 개발에 대 한 우리의 이해에 생체 외에서 의 개선 발전 인간의 iPSC 차별화 망막 organoids7,,89의 세대에서 결과 대 한 프로토콜 10,,1112. 망막 신경 절 세포 (RGCs), 대뇌, 그리고 망막 안료 상피 (RPE) 세포를 포함 하 여 주요 망막 세포의 모든 인간의 ESCs와 Ipsc4,5, 에서 성공적으로 분화 된 6. Eiraku 그 외 여러분 에 의해 개발 된 SFEB (embryoid 몸 같은 집계의 혈 청 무료 문화) 방법에 따라 13, 망막 organoids의 자기 형성 ESC 또는 iPSC 파생 embryoid 몸 같은 집계 정의 된 세포 외 매트릭스 구성 요소7,10,14에서 얻을 수 있습니다. 하지만 이러한 프로토콜 치료 접근 또는 약물 검사에 대 한 많은 호환 되지 않습니다 항상 셀의 큰 생산 단계를 요구 하는 복잡 한. 따라서, 인간의 망막 세포를 생산 하는 방법의 선택이 중요 하 고 메서드가 확장 가능한, 강력 하 고 효율적인 필요.

우리 우리의 이전 게시15을 기반으로, 여기, 부착 인간의 Ipsc 급지대와 이종 조건에 재배에서 망막 organoid 자기 형성을 통해 망막 세포의 간단 하 고 효율적인 생성에 대 한 각 단계 설명 해 서. 부착 인간의 Ipsc의 일상적인 문화에서 시작 해 서,이 프로토콜만 간단한 연속 매체 4 주에 iPS 파생 RPE (hiRPE) 세포와 neuroretinal 구조 둘 다의 생성을 허용 하도록 변경 해야 합니다. 수동 격리 후 hiRPE를 확장할 수 있습니다. 있으며 망막 구조 망막 조상 세포 vivo에서 인간 일치 순차적으로 모든 망막 세포 유형으로 분화 할 수 있는 organoids를 부동으로 경작 될 수 있습니다. retinogenesis입니다. 마지막으로, 연구 발전 또는 임상 번역, 우리 그들의 phenotypic 특성 및 기능에 영향을 주지 않고 전체 망막 organoids 및 hiRPE 세포의 장기 저장 수 cryopreservation 메서드를 설명 합니다.

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Protocol

이 문서에 설명 된 프로토콜 인 라 드 비전의 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 인 드 라 비전 현재 프랑스 규칙에 따르면 인간의 표본 조작을 허용 되었습니다. 표본 처리는 "위원회 회의 드 보호 des Personnes (CPP) Ile-de-France V의" 윤리적인 승인 후 헬싱키의 신조에 따라 환자 데이터 보호 및 국가 규정을 따른다.

1입니다. 문화 미디어 및 요리 준비

  1. 문화 미디어
    1. IPSC 매체, 피더 무료 조건16pluripotent 줄기 세포 문화에 전념 화학적으로 정의 된 매체를 사용 합니다. 제조 업체의 프로토콜에 따라 매체의 500 mL를 준비 합니다.
    2. 사용 기저 iPSC (Bi) 매체는 iPSC 화학적으로 섬유 아 세포 성장 인자 2 (FGF2) 또는 변형 시키는 성장 인자 Beta (TGFß) 없이 매체를 정의합니다.
    3. 1% n 2 보충 (BiN2 매체), 보충 하는 양방향 매체의 500 mL를 준비, 페니실린과 스의 10 mg/mL의 10 단위/mL.
    4. Proneural n 2 기반 매체 (ProN2 매체) DMEM:Nutrient 혼합물 F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-글루타민), 1 %MEM 불필요 한 아미노산, 1% n 2 보충, 페니실린, 10 단위/mL 고 10 mg/mL 스의 구성의 500 mL를 준비 합니다.
    5. Proneural B27 기반 매체 (ProB27 매체) DMEM:Nutrient 혼합물 F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-글루타민), 1 %MEM 불필요 한 아미노산의 구성 준비, 2 %B27 보충, 페니실린의 10 단위/mL와 10 mg/mL의 스.
  2. 문화 선박 준비
    1. 인간의 iPSC 문화에 대 한
      1. 1 x PBS에 vitronectin의 5 μ g/mL를 포함 하는 vitronectin 솔루션의 10 mL를 준비 합니다. 1 x PBS의 10 ml, 해 동된 vitronectin 재고 솔루션 (100 x) 100 µ L를 추가 합니다.
      2. 0.5 µ g/c m2에 해당 하는 6 cm 문화 접시 당 vitronectin 솔루션의 2 개 mL를 배포 합니다. 실 온 (RT)에서 1 시간을 위해 그것을 품 어. 포부 진공 포부 시스템 또는 5 mL 피 펫을 사용 하 여 vitronectin 솔루션을 제거 합니다.
      3. 6 cm 접시 당 iPSC 매체의 4 mL를 추가 합니다.
      4. 사용 하기 전에 30 분의 최소 37 ° C, 5% CO2 셀 문화 인큐베이터에서 요리를 품 어.
    2. IPSC 파생 RPE (hiRPE) 세포 문화에 대 한
    3. 만능 줄기 세포 자격 매트릭스 또는 기판에 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 웰 스 코트. 충분 한 매트릭스 또는 기판 전체 성장 표면 영역을 커버를 추가 합니다. 예를 들어 잘 24-잘 접시와 T-25 cm2 플라스 크에 매트릭스의 3 mL 당 매트릭스의 300 µ L를 넣어.
    4. 37 ° c.에서 1 h의 최소 코팅된 문화 혈관을 품 어 진공 흡입 시스템 또는 5 mL 피 펫을 사용 하 여 매트릭스를 제거 합니다.
    5. 24-잘 접시에 잘 당 ProN2 매체의 1 mL을 추가 하 고 따뜻하고 매체 equilibrate 30 분의 최소 인큐베이터에 문화 선박을 반환 합니다. T-25 cm2 플라스 크, 단계 5.2 참조.

2. 유지 보수 및 확장의 인간의 Ipsc

  1. 인간의 Ipsc의 유지 보수
    1. 15 mL 튜브에서 iPSC 매체의 3 mL를 준비 하 고 사용 하기 전에 15 분의 최소 RT에서 그것을 유지. 1.2.1에 설명 된 대로 코팅된 6 cm 접시를 준비 합니다.
    2. 액체 질소 탱크 나는-150 ° C 냉동 고에서 인간의 Ipsc의 극저온 샘플 30 37 ° C에서 물 욕조에 부 화에 의해 해 동 s.
    3. 신중 하 게 살 균 제 솔루션 스프레이 사용 하 여 저온 유리병 소독. 실시간에서 미리 예 열 하는 iPSC 매체의 3 mL를 포함 하는 15 mL 튜브에는 cryotube에서 해 동된 인간의 Ipsc를 전송
    4. 원심 분리기 튜브 110 x g에서 3 분에 대 한 포부는 진공 포부 시스템 또는 5 mL 피 펫을 사용 하 여 여는 상쾌한을 제거 합니다.
    5. IPSC 2 mL 피 펫을 사용 하 여 6 cm 문화 vitronectin 코팅 접시에서 매체의 1 mL와 함께 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 다시 접시에 셀을 전송. 매체를 변경 하기 전에 최소 24 시간에서 37 ° C, 5% CO2 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.
      참고: 10 µ M에 Y-27632 등 록 억제제 apoptosis를 줄이기 위해 6 cm 문화 요리에서 iPSC 매체에 추가할 수 있습니다.
    6. 매일 매체를 변경 하 고 통과 인간의 Ipsc 매주.
  2. 인간의 Ipsc의 뿌리고
    1. 고전적인 7 일 후에 문화는 70-80% 합류에 인간의 iPSC를 전달 합니다.
    2. 1.2.1 단계에서 설명한 대로 뿌리고 6 cm 요리 준비. Confluent Ipsc와 요리에서 iPSC 매체를 제거 하 고 실시간에서 6 분 분리 솔루션의 2 개 mL를 추가
      참고: 보육 시간 iPSC 클론에 따라 달라 집니다. 시작으로 6 분 외피를 보십시오.
    3. 진공 흡입 시스템 또는 5 mL 피 펫을 사용 하 여 분리 솔루션을 제거 하 고 iPSC 매체의 2 mL 미리 따뜻하게 실시간 Resuspend에서 iPSC 식민지 1000 µ L 피 펫과 그들을 5-10 x 위아래로 pipetting 추가.
      주의: 과도 한 pipetting에서 단일 셀 분리를 하지 마십시오.
    4. 새로운 6 cm 문화 접시에 resuspended 세포 덩어리의 30 ~ 200 µ L를 전송 합니다. 매체를 변경 하기 전에 최소 24 시간에서 37 ° C, 5% CO2 셀 문화 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.
      참고: resuspended 셀 덩어리를 뿌리고에 필요한 양의 iPSC 클론에 따라 달라 집니다.
    5. 매일 매체를 변경 하 고 통과 인간의 Ipsc 매주.

3입니다. 망막 Organoids 세대

  1. 그림 1A 에서 도식화 식민지 60-70% 합류 (그림 1B)에 도달 하는 프로토콜에 따라 iPSC 차별화를 시작 합니다.
  2. 6 cm 접시 당 Bi 매체의 4 mL를 준비 합니다. 37 ° c 양방향 매체를 따뜻한 쌍방향 매체 iPSC 매체를 변경 합니다. 0 (D0)로이 시간 note
  3. D2, 스위치 문화 Bi 매체에 BiN2 중간, 37 ° c.에 이전 예 열 모든 2-3 일 매체를 변경 합니다.
  4. 그림 1C 와 같이 긴급 자체 형성 망막 organoids neuroepithelium 싹에 의해 식별 -1E.
    참고:이 초기 망막 organoids, 시 컵에 그들의 발달 단계에서 해당 수동으로 다운스트림 실험에 대 한 격리 수 있습니다.

4입니다. 망막 Organoids의 성숙

  1. D28에서 6 잘 플레이트 포함 ProB27 매체 10 ng/mL FGF2의 처음 보충의 4 mL/잘 준비 (그림 1A).
    참고: 추가 FGF2 즉시 미디어 판에 추가 됩니다.
    주의: FGF2 필터링 하지 않습니다.
  2. 6 cm 요리에서 망막 구조를 수동으로 복구 합니다. 이렇게 하려면 그림 1E, 같이 neuroepithelial 새싹 주위 바늘 수직 강선을 만드는 구조를 분리 하 고 부드럽게 바늘 긁는 organoids을 분리 합니다.
  3. 10-15 organoids 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 발음 하 고 ProB27 매체를 포함 하는 6 잘 플레이트의 단일 우물에 그들을 전송.
  4. 37 ° C, 5% CO2에서 셀 문화 인큐베이터에서 ProB27 매체에 부동 문화 조건에서 망막 organoids를 유지. 매체의 2-3 일 마다 변경 합니다.
    참고: D35까지 FGF2와 organoids을 취급 합니다.
  5. D35에 매체의 절반을 제거 하 고 신선한 prewarmed ProB27 매체 FGF2 없이 37 ° C에 추가.
  6. 매체의 절반 그림 2에서 같이 망막 세포 유형의 출현에 따라 원하는 망막 세포 유형 얻을 하는 데 필요한 시간 동안 2-3 일 마다 변경 합니다.

5. 세대 및 증폭의 인간의 iPSC 파생 RPE (hiRPE) 셀

  1. 인간 hiRPE 세포의 생성
    1. 차별화에 관여는 Ipsc 식민지 그림 3A에서도식화 하는 프로토콜에 따라 60-70%의 합류를 도달할 때.
    2. 쌍방향 매체의 6 cm 접시 당 4 mL를 준비 하 고 37 ° c.에 양방향 매체를 따뜻한 쌍방향 매체 iPSC 매체를 변경 합니다. 0 (D0)로이 시간 note
    3. D2, 스위치 문화 Bi 매체에 이전 37 ° c.에 따뜻하게 BiN2 매체에 모든 2-3 일 매체를 변경 합니다.
    4. D28에 이전 그림 3A에서 같이 37 ° C에서 예 열 신선한 ProN2 매체에 매체를 변경 합니다.
      참고:이 단계는 4 단계에서 설명한 organoid 따기 후 해질 수 있다.
    5. 2-3 일 마다 ProN2 매체를 변경 합니다.
    6. 그림 3B에서와 같이 D42에서 안료 패치의 관측에 의해 긴급 hiRPE 세포를 식별 합니다.
      참고: hiRPE 세포의 염색 D35 iPSC 클론에 따라 D56 사이 나타납니다.
  2. HiRPE 세포의 증폭
    1. D42에 이전 단계 1.2.2에서에서 설명한 대로 매트릭스와 코팅 잘 당 ProN2 매체의 1 mL를 포함 하는 24-잘 접시를 준비 합니다. 사용 하기 전에 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서 15 분 동안 접시를 놓습니다.
    2. 6 cm 접시에서 hiRPE 패치를 수동으로 복구 합니다. 패치를 격리 하려면 안료 상피 주위 바늘 수직 줄무늬를 확인 하 고 부드럽게 바늘 긁 적 하 여 시트를 분리 합니다. 10 안료 패치 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 발음 하 고 24-잘 접시의 단일 우물에 그들을 전송.
    3. 매체를 변경 하기 전에 ProN2 매체는 셀 문화 인큐베이터에서 48 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 hiRPE 패치 하십시오. 0 (hiRPEp0)으로이 hiRPE 셀 통로 note. 매체 ProN2 매체와 2-3 일 마다 변경 합니다.
    4. 셀 confluent 때 hiRPEp0 세포를 전달 합니다.
      1. 진공 흡입 시스템을 사용 하 여 매체를 제거 하 고 각 잘 1 x 5 mL 피 펫을 사용 하 여 PBS의 1 mL로 씻어.
      2. 진공 흡입 시스템을 사용 하 여 PBS를 버리고 0.25 %trypsin 당 200 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 인큐베이터에서 15 분의 최소 그것을 품 어 비활성화 된 트립 신을 ProB27 매체의 800 µ L를 추가 합니다.
        참고: 트립 신 활동을 ProN2 매체의 사용이 권장 하지 않습니다.
      3. HiRPE 셀의 위쪽 및 아래쪽 pipetting으로 해리. 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 놓고 110 x g에 5 분 동안 원심.
        참고: ProN2 매체 ProB27 매체의 초과 제거 하는 추가 세척을 할 수 있습니다.
      4. 상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 37 ° c.에 미리 예 열 ProN2 매체의 2 mL에 셀 펠 릿 resuspend 셀 카운터로 셀을 계산 합니다.
      5. 1.25 백만 셀 하 고 매트릭스 코팅 T-25 cm2 플라스 크에 넣어 (단계 2.2.2 참조) 37 ° c.에 미리 따뜻하게 ProN2 매체의 5 mL를 포함 하 1 (hiRPEp1)로이 hiRPE 셀 통로 note.
    5. 계속 hiRPE 셀 셀 문화 인큐베이터에서 ProN2 매체에서 48 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 매체를 변경 하기 전에.
    6. 2-3 일 마다 미디어를 변경 합니다. HiRPEp1 셀 합류에 도달, 다음 통로 또는 cryopreservation 수행 합니다.

6. 망막 Organoids 및 hiRPE 셀의 cryopreservation

  1. 전체 망막 organoids에 대 한
    1. 5 ~ 20 망막 organoids 전송 피펫으로 사용 하 여 선택 하 고 극저온 유리병에 넣어. 튜브의 하단에 organoids를 건드리지 않고 1000 µ L 피 펫과 초과 모든 매체를 제거 하 고 차가운 cryopreservation 매체의 250 µ L 추가 ( 재료의 표참조).
    2. 고정 4 h. 전송의 최소-80 ° C에서 소 프로 파 놀 기반 냉동 컨테이너에서 튜브-150 ° C 냉장고 또는 액체 질소 탱크 장기 저장을 위해 냉동된 튜브.
  2. HiRPE 셀에 대 한
    1. 통로 1에 셀 confluent 때 hiRPE 세포 분열.
      참고: hiRPEp0 셀의 cryopreservation 권장 하지 않습니다.
    2. T-25 cm2 플라스 크 진공 포부 시스템을 사용 하 여에서 중간 발음 하 고 그것을 씻어 5 mL 피 펫을 사용 하 여 PBS의 3 mL 1 x.
    3. 진공 흡입 시스템을 사용 하 여 PBS를 제거, 0.25 %trypsin 1 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 인큐베이터에서 15 분의 최소 그것을 품 어 트립 신 활동을 ProB27 매체의 5 mL를 추가 합니다.
      참고: 비활성화 트립 신을 ProN2 매체의 사용이 권장 하지 않습니다.
    4. 10 mL 피 펫을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 hiRPE 셀의 시트를 분리. 셀 카운터와 셀을 계산 합니다. 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 놓고 110 x g에 5 분 동안 원심.
      참고: 추가 세척 ProN2 매체 ProB27 매체의 초과 제거를 수행할 수 있습니다.
    5. 진공 포부를 사용 하 여 상쾌한 발음 하 고 부드럽게 cryopreservation 매체의 250 µ L에 2 백만 세포를 세포를 resuspend.
    6. 극저온 유리병 당 세포 현 탁 액의 250 µ L를 전송 합니다. 최소 4 h-80 ° C에서 소 프로 파 놀 기반 냉동 컨테이너에 튜브를 고정 합니다.
    7. -150 ° C 냉동 고 또는 장기 저장을 위한 액체 질소 탱크에 냉동된 튜브를 전송 합니다.

7. 해빙 망막 Organoids 및 hiRPE 세포의

  1. 전체 망막 organoids의 해빙
    1. 37 ° C에서 따뜻한 ProB27 매체 (2 mL 각 극저온 유리병에 필요한 것).
    2. 액체 질소 탱크 또는-150 ° C 냉장고에서 저온 유리병 포함 37 ° C에서 물 욕조에 망막 organoids 30 s. 소독 살 균 제 솔루션 스프레이 사용 하 여 신중 하 게 저온 유리병을 녹여.
    3. 유리병을 열고 미리 데워 진된 ProB27 매체의 1 mL를 추가 합니다. 전송 피 펫 1.5 mL 튜브에는 organoids를 전송.
    4. 튜브의 하단에 망막 구조를 건드리지 않고 pipetting으로 매체를 부드럽게 제거 합니다. 워시는 organoids 1 1 mL와 함께 더 많은 시간 미리 데워 진된 ProB27 매체의.
    5. 전송 피펫으로와 organoids를 발음 하 고 미리 예 열 하 고 37 ° C, 5% CO2배양 기에 equilibrated ProB27 매체를 포함 하는 6-잘 접시의 1에 넣어.
      참고: 6 잘 플레이트의 당 10-15 망막 organoids를 배치 합니다.
    6. 매체의 절반 그림 2에 설명 된 대로 그들의 출현에 따라 원하는 망막 세포 유형 얻을 하는 데 필요한 시간 동안 2-3 일 마다 변경 합니다.
  2. HiRPE 셀의 해빙
    1. 37 ° C에서 따뜻한 ProN2 매체 (8 mL 각 극저온 유리병에 필요한 것).
    2. 액체 질소 탱크 또는-150 ° C 냉장고에서 해 동 hiRPEp1 세포의 극저온 샘플 37 ° C에 물 목욕으로 외피에 의해 30 s. 소독에 대 한 신중 하 게 살 균 제 솔루션 스프레이 사용 하 여 저온 유리병.
    3. 튜브를 열고 미리 데워 진된 ProN2 매체의 1 mL를 추가 하 고 미리 데워 진된 ProN2 매체의 2 개 mL를 포함 하는 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 110 x g에 5 분 동안 원심.
    4. 상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 37 ° c.에 미리 예 열 ProN2 매체의 2 mL에 셀 펠 릿 resuspend
    5. 셀 카운터로 셀을 계산 합니다.
    6. 1.25 백만 셀 하 고 매트릭스 코팅 T-25 cm2 플라스 크에 넣어 (단계 2.2.2 참조) 37 ° c.에 미리 따뜻하게 ProN2 매체의 5 mL를 포함 하 이 단계에서 2 (hiRPEp2) 통로 note.
    7. 계속 hiRPEp2 셀 셀 문화 인큐베이터에서 ProN2 매체에서 48 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 매체를 변경 하기 전에.
    8. 2-3 일 마다 미디어를 변경 합니다. HiRPE 셀 합류에 도달, 다음 통로 또는 cryopreservation 수행 합니다.
      참고: 2 주 후에 문화, 8-10 백만 hiRPE 셀 추가 실험에 대 한 수집할 수 있습니다.

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Representative Results

급지대 무료 조건16 에서 인간의 iPSC 차별화에 대 한 첫 번째 단계는 자기 갱신 기계 자발적인 차별화 (그림 1A)를 장려 하기 위해 양방향 매체를 사용 하 여 종료입니다. 다음, Bi 매체 보완에 D2, 신경 및 망막 혈통으로 차별화 Ipsc 셀 가이드는 N2 보완. 이 프로세스 리드 D28 주위에 neuroretinal 꽃 봉 오리의 모습 (그림 1C - 1E). 자기 형성 neuroretinal 구조 그림 1E 에서 볼 수 있듯이 바늘을 사용 하 여 격리 될 수 있습니다 및 ProB27 매체 (그림 1 층)을 사용 하 여 부동 문화 조건에서 망막 organoids의 성숙 수 있도록 문화 접시에 전송. 하나를 신경 망막의 성장과 발전, FGF2 1 주일 (그림 1A) 매체에 추가 됩니다.

D28에서 신흥 망막 구조 공동 PAX6, RAX, 및 VSX215키 전사 요소를 표현 하는 망막 조상 세포 주로 포함 됩니다. 이러한 창시자 인간 망막 발달와 일치 진화론 보존된 출생 순서에 떠 있는 문화 조건에서 망막 세포 유형의 7 개의 주요 클래스를 일으키 다. QRT-PCR 및 immunohistochemistry 이전 Reichman 외 에 설명에 따라 15, 그림 2 에 광범위 한 곡선 표시 체 외에서 성숙 과정 동안 망막 세포 발생 초기와 후반을 태어난의 파도. 따라서, 문화 시간 셀 종류는 organoids에 정의합니다.

더 이상 확대를 위한 hiRPE 세포의 고립이 셀 채색의 시각화를 허용 하기 때문에 착 색은 지각할 수 있는 경우에 수행할 수 있습니다. 이 방법에서는, ProN2 매체 RPE 세포15의 착 색에 D42 데 D28에서 사용 됩니다.

인간의 iPSC 클론에 따라 안료 패치 검출 될 수 있다 망막 구조;의 자기 형성 전후 D28에서 ProN2 매체의 사용 후 대부분 1 개 또는 2 주 그러나 (그림 3A, B). HiRPE 셀 통로 0에 고립 된 헝겊 조각에서 확장의 대표적인 밝은 필드 이미지 그림 3C 와 3D에 표시 됩니다. 그런 다음, hiRPE 셀 통로 4, 상피 엽 전환 (응급) 없이 그들의 RPE 표현 형을 유지까지 확장할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 응급 Y-27632, 또한 셀 번호 구절17의 증가 수와 같은 바위 억제제의 사용으로 예방할 수 있습니다. 녹고 후 hiRPE 세포의 장기 문화는 성숙 하 고 기능성 상피15을 얻기 위해 여기에 설명 된 조건에서 쉽게 수행할 수 있습니다. 주 52 클래식 cuboidal 조약돌 형태학에서 성숙 hiRPEp2 세포의 예는 그림 3E에 그림입니다.

Figure 1
그림 1: 생성 및 부착 인간의 Ipsc에서 망막 organoids의 성숙. (A) 분화 프로토콜 망막 organoids의 생성을 허용. (B) 인간 Ipsc D0에서. (C) neuroretinal 상피 D15에서 신흥. (D) d 22에서 자기 형성 신경 망막 같은 구조. (E) 여기, neuroretinal 버드는 바늘을 사용 하 여 격리 됩니다. (F) D35에서 문화 상태를 부동에 망막 organoids의 대표 이미지. 스케일 바 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 파도 인간의 iPSC 파생 된 망막의 세포 생성. 약어: 망막 조상 세포 (Rpc), 망막 신경 절 세포 (RGCs), 수평 세포 (호), amacrine 세포 (오전), 뮐러 glial 세포 (MGCs), 양극 세포 (Bp), 및 대뇌 (홍보) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 생성 및 인간의 iPSC 파생 RPE의 증폭. (A) 인간의 hiRPE 세포의 생성을 허용 하는 분화 프로토콜의 그림. (B) 단계 대조 이미지 보여주는 착 패치 주 6 (W6) 부착 인간의 Ipsc 차별화에서 신흥. (C) hiRPEp0 셀 안료 패치 수확 후 1 주일 (W1)를 재배. (D) hiRPEp0 세포 주 6에서 (W6) 안료 패치 따기 후. (E) A 후에 녹고, hiRPEp2 셀의 대표 이미지는 52 주 (W52) ProN2 매체에 대 한 재배. 스케일 바 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

이 프로토콜 RPE 세포 및 망막 organoids, 망막 RGCs 및 대뇌, 이종와 피더 조건에서 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 생산 하는 방법을 설명 합니다. 여기 좋은 제조 관행 (GMP) 과정, 재배 하는 방법 호환 RPE 세포, RGCs, 그리고 줄기 세포 기반 요법 및 약물의 개발에 대 한 대뇌 iPSC 파생 된 망막 세포의 큰 생산 수 발견은 망막 퇴행 성 질환의 미래 처리를 위한 접근 한다. 전체 망막 organoids 또는 hiRPE 셀의 cryopreservation는 또한 가장 큰 장점은 수립 중간 세포 은행에 줄기 세포 기반 치료에서 차후 사용을 위해 중요 한 단계를 제공 합니다.

차별화의 특정 단계에서 큰 주식 종류의 특정 망막 세포의 생산 미래 임상 번역에 필요한 것입니다. 이와 관련, CD73 포지티브 포토 리셉터 일어나 3 개월에서 세대 이식 호환 셀 인구18, 동결 해 동 망막에서 이러한 미 성숙한 대뇌를 생성 하는 가능성으로 설명 organoids15 강화 치료 목적을 위해 이러한 세포를 사용 하는 희망. 망막 색소 상피에 관한 체 외에서 증식 하는 hiRPE 세포의 기능 그들을 은행에 큰 셀 제작 가능 중요 한 것은, 해 동된 인간 iPSC 파생 RPE 세포 자신의 RPE phenotype과 유지 기능, 따라서 영양 인자 분 비 또는 포토 리셉터 외부 세그먼트 먹어서15, 그들의로 대 한 전략을 심사에 대 한 용이성을 검증 미래의 치료 접근입니다.

IPSC 파생 망막 organoids7,,89,10,11,12,15 에서 변화 하는 세대에 대 한 프로토콜의 다양 한 있다 효율성 및 견고성 (embryoid 몸 처럼 대 부착 셀 집계) 방법 문화. 여기 설명 하는 방법을 부착 인간의 Ipsc에서 시작 하 고 재현할 수 효능, 적응성, 그리고 인간의 iPSC 라인15의 넓은 범위에 적용을 보여 줍니다. 혈 청 무료 미디어의 연속 된 변화에 따라이 프로세스를 차별화 가이드 시스템의 내장 신호를 이용 하 여 망막 개발의 주요 단계를이. 이 프로토콜의 중요 한 장점은 배아 체 대형의 부재 이며 미래의 GMP 준수 망막 세포 제조 셀 치료 파생 상품을 생산 하는 프로토콜에 대 한 매트릭스의 추가. 이 방법에서는, 망막 organoid 생성 및 성숙의 효율에 차이가 xenogeneic 아니 xenogeneic 문화 조건 안 셀 치료 시스템 (CTS) 보충제를 사용 하 여 독점적으로 재조합 공식화, 사이 발견 또는 인간 답게 된 구성 요소입니다.

망막 차별화 방법의 성공은 크게 인간의 iPSC 문화의 품질에 따라 달라 집니다. 재활 방법 망막 세포8, 인간의 Ipsc의 분화 효율 영향을 주지 않습니다 그러나 그들의 stemness 상태 수 필요가 있다. 짧게, 정기적으로 재배 인간의 Ipsc 한다 감 별 법의 어떤 표시 든 지 보여주지 않습니다. 식민지는 겹치지 않아야 하 고 그들의 독특한 원형 형태를 표시 해야 합니다. 비록 망막 차별화의 효율성은 클론 종속 c m2 당 2 개의 망막 구조의 최소 수 선택 D28에서 1 6 cm 접시에 대 한 50-60 neuroretinal 구조에 해당. 부동 문화 조건에서 망막 organoid 성숙에 대 한 구조 융합 및 중간 overconsumption 방지 잘 당 구조의 수를 제한 합니다. 이러한 문화 조건에서 망막 organoids 수 수 maturated는 광범위 한 시간 늦은 망막 세포 유형 얻을 하는 데 필요한.

앞으로 찾고, 망막 organoids 생성 된 생체 외에서 이 방법으로 모델 망막 질병에 강력한 도구 구성 합니다. 환자 전용 iPSC 파생 된 망막 세포 모델 그들의 분자 및 세포 메커니즘의 탐사에 의해 더 복잡 한 또는 유전 질병을 이해 하 사용 됩니다. 이 모델은 특히 높은 처리량 검열, 세포와 유전자 치료, 또는 게놈 망막 dystrophies에 대 한 혁신적인 치료법 개발에 접근, 편집을 통해 약물 발견에 적합 될 것입니다.

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Disclosures

Sacha Reichman, 올리비에 Goureau, 그리고 호세 알랭 Sahel 중인 인간 만능 줄기 세포에서 망막 세포의 생성에 관련 된 특허 발명에 있습니다.

Acknowledgments

저자는 그들의 중요 한 독서에 대 한 여기에 설명 된 방법 및 G. Gagliardi M. Garita의 설치 하는 동안 그들의 입력에 대 한 Goureau의 팀의 일원을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 ANR에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), 망막 프랑스 협회와 기술 이전 회사 SATT Lutech. 그것은 또한 Investissements d'Avenir 프로그램 (ANR-11-IDEX-0004-02) 내에서 ANR에서 지 원하는 LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65)의 프레임에서 수행 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated ThermoFisher Scientific A14700 Coating
CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated ThermoFisher Scientific A27940 Coating
Essential 8 Medium ThermoFisher Scientific A1517001 medium
Essential 6 Medium ThermoFisher Scientific A1516401 medium
CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement ThermoFisher Scientific A1370701 supplement CTS
N-2 Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17502048 supplement
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504044 supplement
CTS B-27 Supplement, XenoFree ThermoFisher Scientific A1486701 supplement CTS
DMEM/F-12 ThermoFisher Scientific 11320074 medium
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140035 supplement
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122 antibiotic
CellStart CTS ThermoFisher Scientific A1014201 Matrix CTS
Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix ThermoFisher Scientific A1569601 Matrix
Gentle Cell Dissociation Reagent Stemcell Technologies 7174 dissociation solution
Cryostem Freezing Media clinisciences 05-710-1D Cryopreservation medium
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) Preprotech 100-18B FGF2
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free Preprotech AF-100-18B FGF2 Xeno free
AGANI needle 23G Terumo AN*2332R1 Needle
Flask 25 cm² Tissue Culture Treated Falcon 353109 T-25 cm²
24 well plate Tissue Culture Treated Costar 3526 24-well plate
6 well plate Tissue Culture Treated Costar 3516 6-well plate

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References

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개발 생물학 문제점 139 망막 organoids pluripotent 줄기 세포 분화 세포 치료 신약
정의 된 이종 무료 및 급지대 무료 문화 세대의 인간 iPSC 파생 된 망막 세포 모델에 대 한
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Slembrouck-Brec, A., Nanteau, C.,… More

Slembrouck-Brec, A., Nanteau, C., Sahel, J. A., Goureau, O., Reichman, S. Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models. J. Vis. Exp. (139), e57795, doi:10.3791/57795 (2018).

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