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Developmental Biology

परिभाषित एक्सो-नि: शुल्क और फीडर-मानव iPSC की पीढ़ी के लिए मुक्त संस्कृति शर्तों-व्युत्पन्न रेटिना सेल मॉडल

Published: September 6, 2018 doi: 10.3791/57795
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Institut de la Vision, Sorbonne Université, INSERM, CNRS, F-75012 Paris, France
* These authors contributed equally

Summary

pluripotent स्टेम सेल से विशेष रेटिना कोशिकाओं का उत्पादन रेटिना रोगों के लिए स्टेम कोशिका आधारित चिकित्सा के विकास में एक मोड़ है. वर्तमान कागज बुनियादी, शोधों, और नैदानिक अनुसंधान के लिए रेटिना organoids और रेटिना pigmented उपकला की एक कुशल पीढ़ी के लिए एक सरल तरीका का वर्णन.

Abstract

pluripotent स्टेम कोशिकाओं से विशेष कोशिकाओं के उत्पादन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है अपक्षयी चिकित्सा के लिए नए दृष्टिकोण विकसित करना । मानव-प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) का उपयोग विशेष रूप से neurodegenerative रोग के अध्ययन के लिए आकर्षक है, रेटिना dystrophies सहित, जहां iPSC व्युत्पन्न रेटिना सेल मॉडल एक प्रमुख कदम आगे समझने के लिए और अंधापन से लड़ने के लिए चिह्नित. इस पत्र में, हम एक सरल और स्केलेबल प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए उत्पंन, परिपक्व, और cryopreserve रेटिना organoids । मध्यम बदलने के आधार पर, इस विधि का मुख्य लाभ सामांयतः iPSCs के एक निर्देशित भेदभाव में आवश्यक कई और समय लेने वाली कदम से बचने के लिए है । अनुयाई मानव iPSC संस्कृतियों पर परिभाषित मीडिया के क्रमिक परिवर्तन द्वारा रेटिना विकास के प्रारंभिक चरणों नकल उतार, इस प्रोटोकॉल एक में स्व-बनाने neuroretinal संरचनाओं और रेटिना pigmented उपकला (RPE) कोशिकाओं के एक साथ पीढ़ी की अनुमति देता है reproducible और कुशल तरीके से 4 हफ्तों में । इन संरचनाओं रेटिना जनक कोशिकाओं (rpc) युक्त एक अस्थायी संस्कृति हालत में सात रेटिना कोशिका वयस्क मानव रेटिना में मौजूद प्रकार में rpc के भेदभाव को सक्षम करने में आगे परिपक्वता के लिए आसानी से अलग किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, हम लंबी अवधि के भंडारण के लिए रेटिना organoids और RPE कोशिकाओं के cryopreservation के लिए त्वरित तरीकों का वर्णन । एक साथ संयुक्त, यहां वर्णित तरीकों का उत्पादन और बैंक मानव iPSC-व्युत्पन्न रेटिना कोशिकाओं या दोनों बुनियादी और नैदानिक अनुसंधान के लिए ऊतक के लिए उपयोगी हो जाएगा ।

Introduction

रेटिना केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) का एक अभिन्न हिस्सा है और एक दर्दनाक चोट या रोगों के बाद अनायास पुनर्जीवित करने के लिए एक सीमित क्षमता है. इसलिए, अपक्षयी इस तरह की उम्र से संबंधित धब्बेदार अध-पतन (AMD), रेटनाइटिस pigmentosa (आरपी), मोतियाबिंद, और मधुमेह रेटिनोपैथी के रूप में निश्चित रेटिना कोशिका हानि, पैदा आमतौर पर अपरिवर्तनीय अंधापन के लिए सीसा । पतित रेटिना बचाव एक प्रमुख चुनौती है जिसके लिए कोशिका को क्षतिग्रस्त या खो कोशिकाओं को बदलने के लिए लक्ष्य आधारित उपचार के लिए एक सबसे होनहार दृष्टिकोण में से एक है1,2,3। Pluripotent मानव भ्रूण स्टेम सेल (ESCs) कोशिकाओं या मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) के रूप में स्टेम सेल संस्कृति में अनिश्चित काल तक विस्तारित करने की क्षमता है, और वे किसी भी कोशिका प्रकार के उत्पादन की क्षमता है । रेटिना विकास और मानव iPSC भेदभाव के लिए इन विट्रो प्रोटोकॉल में सुधार की हमारी समझ में अग्रिमों रेटिना organoids की पीढ़ी में हुई है7,8,9, 10,11,12. रेटिना नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं (RGCs), photoreceptors, और रेटिना pigmented उपकला (RPE) कोशिकाओं सहित प्रमुख रेटिना कोशिकाओं, के सभी, मानव ESCs और iPSCs से सफलतापूर्वक विभेदित किया गया है4,5, 6. Eiraku एट अल द्वारा विकसित SFEB (सीरम मुक्त संस्कृति के embryoid शरीर की तरह समुच्चय) विधि पर आधारित है । 13, रेटिना organoids के स्व-गठन ESC से प्राप्त किया जा सकता है-या iPSC-व्युत्पंन embryoid शरीर की तरह समुच्चय में परिभाषित extracellular मैट्रिक्स घटकों7,10,14। लेकिन इन प्रोटोकॉल जटिल, चिकित्सकीय दृष्टिकोण या दवा स्क्रीनिंग के लिए कोशिकाओं के बड़े उत्पादन के साथ हमेशा संगत नहीं कदम की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता होती है । इस प्रकार, मानव रेटिना कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए विधि का चुनाव महत्वपूर्ण है और विधि मजबूत, स्केलेबल, और कुशल होने की जरूरत है.

यहां, हमारे पिछले प्रकाशन15के आधार पर, हम रेटिना organoid के माध्यम से रेटिना कोशिकाओं के एक सरल और कुशल पीढ़ी के लिए प्रत्येक कदम का वर्णन अनुयाई मानव iPSCs से एक फीडर से मुक्त और एक्सो मुक्त हालत में खेती की । अनुयाई मानव iPSCs की दिनचर्या संस्कृतियों से शुरू, इस प्रोटोकॉल केवल एक साधारण उत्तराधिकारी के लिए दोनों आईपीएस की पीढ़ी की अनुमति बदलने के माध्यम से RPE (hiRPE) कोशिकाओं और 4 हफ्तों में neuroretinal संरचनाओं व्युत्पंन की आवश्यकता है । एक मैनुअल अलगाव के बाद, hiRPE विस्तार किया जा सकता है और रेटिना संरचनाओं के रूप में अस्थायी organoids जहां रेटिना जनक कोशिकाओं में सभी रेटिना सेल प्रकार में एक क्रमिक क्रम में अंतर करने में सक्षम हैं के रूप में प्रसंस्कृत किया जा सकता vivo मानव retinogenesis । अंत में, अनुसंधान उन्नति या नैदानिक अनुवाद के लिए, हम एक cryopreservation अपने phenotypic विशेषताओं और कार्यक्षमता को प्रभावित किए बिना पूरे रेटिना organoids और hiRPE कोशिकाओं के दीर्घकालिक भंडारण की अनुमति विधि का वर्णन.

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Protocol

इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल Institut de la Vision की शोध आचार समिति के दिशानिर्देशों का पालन करता है । इस Institut de la विजन वर्तमान फ्रांसीसी विनियमन के अनुसार मानव नमूना के हेरफेर की अनुमति दी गई है । नमूना हैंडलिंग हेलसिंकी के सिद्धांतों के अनुसार रोगी डेटा संरक्षण के बाद, और राष्ट्रीय विनियमों के नैतिक अनुमोदन के बाद "Comité de protection des Personnes (CPP) इले-डे-फ्रांस V".

1. संस्कृति मीडिया और व्यंजन की तैयारी

  1. संस्कृति मीडिया
    1. iPSC मध्यम, फीडर मुक्त शर्तों16में pluripotent स्टेम सेल संस्कृति को समर्पित एक रासायनिक परिभाषित माध्यम का उपयोग करें । निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार मध्यम से ५०० मिलीलीटर तैयार करें ।
    2. बेसल iPSC (द्वि) मध्यम, fibroblast वृद्धि कारक 2 (FGF2) के बिना iPSC रासायनिक रूप से परिभाषित माध्यम का उपयोग करें या वृद्धि कारक बीटा (TGFß) बदल रहा है ।
    3. ५०० मिलीलीटर को 1% N2 अनुपूरक (BiN2 मीडियम), 10 इकाइयों/एमएल और streptomycin के 10 मिलीग्राम/एमएल के साथ पूरक तैयार करें ।
    4. DMEM से बना तंत्रिका N2 आधारित मध्यम (ProN2 मध्यम) के ५०० मिलीलीटर तैयार: पोषक तत्व मिश्रण एफ 12 (DMEM/F12, 1:1, एल-Glutamine), 1% मेम गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 1% N2 पूरक, 10 इकाइयों/एमएल पेनिसिलिन के, और 10 मिलीग्राम/एमएल के streptomycin ।
    5. तैयार तंत्रिका B27-आधारित मध्यम (ProB27 माध्यम) DMEM से बना: पोषक तत्व मिश्रण एफ 12 (DMEM/F12, 1:1, एल-Glutamine), 1% मेम गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 2% B27 पूरक, 10 इकाइयों/एमएल के पेनिसिलिन और 10 मिलीग्राम/streptomycin के एमएल ।
  2. कल्चरल पोत वडा
    1. मानव iPSC संस्कृति के लिए
      1. 1x पंजाब में vitronectin के 5 μg/ml वाले vitronectin सॉल्यूशन के 10 मिलीलीटर तैयार करें । 1x पंजाब के 10 मिलीलीटर में, गल vitronectin स्टॉक समाधान (100x) के १०० µ एल जोड़ें ।
      2. 6 प्रति vitronectin समाधान के 2 मिलीलीटर वितरित-मुख्यमंत्री संस्कृति पकवान इसी ०.५ µ g/ यह कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 घंटे के लिए मशीन । एक निर्वात-आकांक्षा प्रणाली या एक 5 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग आकांक्षा द्वारा vitronectin समाधान निकालें ।
      3. 6-cm डिश के अनुसार 4 मिलीलीटर iPSC मीडियम की डालें ।
      4. ३७ ° c और 5% CO2 में एक सेल संस्कृति मशीन में व्यंजन की मशीन का उपयोग करने से पहले 30 मिनट की एक ंयूनतम के लिए ।
    2. मानव iPSC के लिए-व्युत्पन्न RPE (hiRPE) कोशिका संस्कृति
    3. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार कोट कुओं के लिए एक pluripotent स्टेम सेल योग्य मैट्रिक्स या सब्सट्रेट का प्रयोग करें । पूरे विकास सतह क्षेत्र को कवर करने के लिए पर्याप्त मैट्रिक्स या सब्सट्रेट जोड़ें । उदाहरण के लिए, 24 अच्छी तरह से थाली और एक टी में मैट्रिक्स के 3 मिलीलीटर-25 सेमी2 कुप्पी के अनुसार मैट्रिक्स के ३०० µ एल डाल दिया ।
    4. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे की एक ंयूनतम के लिए लेपित संस्कृति जहाजों की मशीन । निर्वात-आकांक्षा प्रणालियों या एक 5 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग मैट्रिक्स निकालें ।
    5. 24 अच्छी तरह से प्लेटों पर अच्छी तरह से प्रति ProN2 मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें और गर्म करने के लिए 30 मिनट की एक ंयूनतम के लिए मशीन के लिए संस्कृति पोत वापसी और मध्यम equilibrate । टी के लिए 25 सेमी2 कुप्पी, ५.२ कदम देखें ।

2. मानव iPSCs का अनुरक्षण एवं विस्तार

  1. मानव iPSCs का अनुरक्षण
    1. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में iPSC मध्यम के 3 मिलीलीटर तैयार है और उपयोग करने से पहले 15 मिनट की एक ंयूनतम के लिए आरटी पर रखो । एक लेपित 6-cm डिश के रूप में 1.2.1 में वर्णित तैयार करें ।
    2. गल एक तरल नाइट्रोजन टैंक या एक-१५० ° c फ्रीजर से मानव iPSCs के एक क्रायोजेनिक नमूना ३७ ° c पर एक पानी स्नान में 30 एस के लिए ।
    3. सावधानी से एक विसंक्रमित समाधान स्प्रे का उपयोग कर क्रायोजेनिक शीशी को संक्रमित । cryotube से गल मानव iPSCs को 15 एमएल ट्यूब पर ट्रांसफर करें जिसमें iPSC मीडियम के 3 मिलीलीटर प्री-आरटी पर गरम है ।
    4. ११० x g पर ट्यूब 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक एक निर्वात-आकांक्षा प्रणाली या एक 5 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर आकांक्षा द्वारा supernatant निकालें ।
    5. एक 2 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर एक vitronectin लेपित 6-मुख्यमंत्री संस्कृति पकवान से iPSC मध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ सेल गोली resuspend और कोशिकाओं डिश को वापस हस्तांतरण । ३७ ° c और 5% CO2 में एक ंयूनतम के लिए 24 घंटे के माध्यम से बदलने से पहले मशीन को पकवान लौटें ।
      नोट: एक रॉक अवरोधक, जैसे Y-२७६३२ पर 10 µ m, में iPSC माध्यम से जोड़ा जा सकता है 6-मुख्यमंत्री संस्कृति व्यंजन apoptosis को कम करने के लिए.
    6. प्रतिदिन यम को बदलें और मानव iPSCs को हर सप्ताह पास करें ।
  2. मानव iPSCs की Passaging
    1. एक ७०-८०% संगम पर मानव iPSC पास, शास्त्रीय संस्कृति में 7 दिनों के बाद ।
    2. चरण 1.2.1 में वर्णित passaging के लिए 6-cm व्यंजन तैयार करें । धाराप्रवाह iPSCs के साथ व्यंजन से iPSC मध्यम निकालें और आरटी में 6 मिनट के लिए एक पृथक्करण समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
      नोट: मशीन समय iPSC क्लोन पर निर्भर करता है । एक शुरुआत के रूप में एक 6 मिनट की मशीन की कोशिश करो ।
    3. निर्वात-आकांक्षा प्रणालियों या एक 5 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर पृथक्करण समाधान निकालें और आरटी पर iPSC मध्यम पूर्व गर्म के 2 मिलीलीटर जोड़ें । उन्हें pipetting अप और 5-10x नीचे एक १,००० µ l पिपेट के साथ द्वारा iPSC कालोनियों resuspend ।
      सावधानी: अत्यधिक pipetting से एकल कोशिका पृथक्करण से बचें ।
    4. एक नया 6-मुख्यमंत्री संस्कृति डिश में resuspend सेल के झुरमुट के 30 २०० µ एल स्थानांतरण । ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2 में सेल संस्कृति मशीन के लिए व्यंजन वापस मध्यम बदलने से पहले 24 ज की एक ंयूनतम के लिए ।
      नोट: resuspend सेल के passaging के लिए आवश्यक झुरमुट की मात्रा iPSC क्लोन पर निर्भर करता है ।
    5. प्रतिदिन यम को बदलें और मानव iPSCs को हर सप्ताह पास करें ।

3. रेटिना Organoids की जनरेशन

  1. जब कालोनियों में ६०-७०% संगम ( चित्रा 1b) तक पहुंच जाए तो schematized में प्रोटोकॉल का पालन करते हुए iPSC विभेद शुरू करें ।
  2. 6-सेमी डिश प्रति द्वि मध्यम के 4 मिलीलीटर तैयार करते हैं । ३७ ° c के लिए द्वि मध्यम गर्म । iPSC माध्यम को द्वि माध्यम में परिवर्तित करें । दिन 0 (D0) के रूप में इस समय नोट करें ।
  3. D2 पर, द्वि माध्यम में संस्कृतियों को एक BiN2 माध्यम में स्विच करें, पहले ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्म । हर 2-3 दिन मध्यम बदलें ।
  4. neuroepithelium कलियों द्वारा आकस्मिक स्व-गठन रेटिना organoids की पहचान, के रूप में चित्र 1C -1Eमें दिखाया गया है ।
    नोट: इन जल्दी रेटिना organoids, ऑप्टिक कप के लिए उनके विकास के चरण में इसी, मैंयुअल रूप से बहाव प्रयोग के लिए अलग किया जा सकता है ।

4. रेटिना Organoids की परिपक्वता

  1. D28 पर, 6-अच्छी तरह से प्लेटें तैयार ProB27 मध्यम के 4 मिलीलीटर/FGF2 (चित्र 1a) के 10 एनजी/एमएल के साथ पूरक ।
    नोट: मीडिया को प्लेटों में जोड़े जाने से पहले तुरंत FGF2 जोड़ें ।
    चेतावनी: फ़िल्टर FGF2 नहीं है ।
  2. मैन्युअल रूप से 6-सेमी व्यंजन से रेटिना संरचनाओं पुनर्प्राप्त. ऐसा करने के लिए, neuroepithelial कली के आसपास सुई के साथ सीधा striations बनाने संरचनाओं को अलग, के रूप में चित्रा 1Eमें दिखाया गया है, और धीरे सुई के साथ उन्हें खरोंच से organoids अलग.
  3. महाप्राण 10-15 एक १,००० µ एल पिपेट का उपयोग कर organoids और उंहें 6-अच्छी तरह से ProB27 माध्यम युक्त प्लेट के एक एकल कुआं में स्थानांतरण ।
  4. ३७ ° c और 5% CO2में एक सेल कल्चर मशीन में ProB27 माध्यम में फ़्लोटिंग कल्चर स्थितियों में रेटिना organoids रखें । परिवर्तन मध्यम हर 2-3 दिन के आधे ।
    नोट: D35 तक FGF2 के साथ organoids का इलाज करें ।
  5. D35 पर, मध्यम के आधे निकालें और FGF2 के बिना ३७ डिग्री सेल्सियस पर ताजा गरम ProB27 मध्यम जोड़ें ।
  6. परिवर्तन मध्यम हर 2-3 दिनों के दौरान रेटिना सेल प्रकार के उद्भव के अनुसार वांछित रेटिना सेल प्रकार प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय के दौरान, चित्र 2में चित्रित के रूप में.

5. मानव iPSC-व्युत्पन्न RPE (hiRPE) कोशिकाओं का उत्पादन और प्रवर्धन

  1. मानव hiRPE कोशिकाओं की पीढ़ी
    1. भेदभाव में iPSCs संलग्न जब कालोनियों एक ६०-७०% संगम तक पहुंचने, चित्र 3ए में प्रोटोकॉल schematized निंनलिखित ।
    2. bi मीडियम के 6-cm डिश के प्रति 4 मिलीलीटर तैयार करें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर bi मीडियम को गर्म कर लें । iPSC माध्यम को द्वि माध्यम में परिवर्तित करें । दिन 0 (D0) के रूप में इस समय नोट करें ।
    3. D2 पर, Bi मध्यम में संस्कृतियों को पहले ३७ ° c में उष्ण BiN2 मध्यम पर स्विच करें । हर 2-3 दिन मध्यम बदलें ।
    4. D28 में, एक ताजा ProN2 मध्यम पहले ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्म के रूप में चित्र 3ए में चित्रित करने के लिए माध्यम बदल जाते हैं ।
      नोट: चरण 4 में वर्णित organoid खरीदना के बाद यह चरण किया जा सकता है ।
    5. ProN2 मीडियम को हर 2-3 दिन में बदल दीजिये.
    6. D42 में, चित्र बीमें दिखाए गए के रूप में pigmented पैच के अवलोकन द्वारा आपात hiRPE कोशिकाओं की पहचान ।
      नोट: hiRPE कोशिकाओं की रंजकता iPSC क्लोन के आधार पर D56 के लिए D35 के बीच प्रकट होता है ।
  2. hiRPE कोशिकाओं का प्रवर्धन
    1. D42 में, एक 24 अच्छी तरह से पहले के रूप में कदम 1.2.2 में वर्णित मैट्रिक्स के साथ लेपित थाली तैयार है और अच्छी तरह से प्रति ProN2 माध्यम से 1 मिलीलीटर युक्त । मशीन में 15 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह उपयोग से पहले प्लेट प्लेस2 ।
    2. मैन्युअल रूप से 6-cm डिश से hiRPE पैच पुनर्प्राप्त करें । पैच को अलग करने के लिए, pigmented उपकला के आसपास सुई के साथ एक सीधा striation बनाने के लिए और धीरे सुई के साथ इसे scratching द्वारा चादर अलग. महाप्राण 10 pigmented पैच एक १,००० µ l पिपेट का उपयोग कर और उन्हें 24 अच्छी तरह से थाली के एक एकल कुआं में स्थानांतरण.
    3. ProN2 माध्यम में hiRPE पैच एक सेल संस्कृति मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 में ४८ एच के लिए मध्यम बदलने से पहले रखें । इस hiRPE कक्ष गद्यांश को 0 (hiRPEp0) के रूप में नोट करें । मध्यम हर 2-3 दिन ProN2 माध्यम के साथ बदलें ।
    4. hiRPEp0 कक्षों को तब पास करते है जब कक्ष धाराप्रवाह होते हैं ।
      1. निर्वात-आकांक्षा प्रणालियों का उपयोग कर मध्यम निकालें और एक 5 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ एक अच्छी तरह से धो लें ।
      2. छोड़ें निर्वात का उपयोग कर पंजाब-आकांक्षा प्रणालियों, ०.२५% trypsin की अच्छी तरह से प्रति २०० µ एल जोड़ने के लिए, और यह एक मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस में 15 मिनट की एक ंयूनतम के लिए मशीन । trypsin को निष्क्रिय करने के लिए ProB27 मीडियम के ८०० µ l को जोड़ें ।
        नोट: trypsin गतिविधि को रोकने के लिए ProN2 माध्यम का उपयोग अनुशंसित नहीं है ।
      3. इसे ऊपर और नीचे pipetting करके hiRPE कोशिकाओं की शीट अलग कर देना । एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन प्लेस और यह 5 मिनट के लिए ११० x g पर केंद्रापसारक
        नोट: एक अतिरिक्त धोने के साथ किया जा सकता ProN2 माध्यम ProB27 की अधिकता को दूर करने के लिए मध्यम ।
      4. supernatant निकालें और धीरे ProN2 मध्यम पूर्व के 2 मिलीलीटर में सेल गोली ३७ डिग्री सेल्सियस पर गरम पुनः स्थगित । कक्ष काउंटर के साथ कक्षों को गिनना ।
      5. १,२५०,००० कोशिकाओं लो और उन्हें एक मैट्रिक्स में जगह-लेपित टी-25 सेमी2 कुप्पी (स्टेप -8) ProN2 मध्यम पूर्व के 5 मिलीलीटर युक्त-३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्म. इस hiRPE सेल गद्यांश को 1 (hiRPEp1) के रूप में नोट करें ।
    5. ProN2 माध्यम में एक सेल संस्कृति मशीन में hiRPE कोशिकाओं ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह में रखें ४८ एच के लिए2 मध्यम बदलने से पहले ।
    6. हर 2-3 दिन मीडिया बदलें । जब hiRPEp1 कोशिकाएं संगम तक पहुंचती हैं, तो अगले गद्यांश या cryopreservation को पूरा करें ।

6. रेटिना Organoids और hiRPE कोशिकाओं की Cryopreservation

  1. पूरे रेटिना organoids के लिए
    1. एक स्थानांतरण प्लास्टिक का उपयोग कर 5 से 20 रेटिना organoids का चयन करें और उन्हें एक क्रायोजेनिक शीशी में रखें । ट्यूब के नीचे organoids को छूने के बिना किसी १,००० µ l पिपेट के साथ किसी भी अतिरिक्त माध्यम को निकालें और कोल्ड cryopreservation मीडियम के २५० µ l को जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें).
    2. एक isopropanol-आधारित ठंड कंटेनर में शीशियों फ्रीज-८० ° c 4 एच के लिए एक ंयूनतम के लिए जमे हुए शीशियों स्थानांतरण-१५० ° c फ्रीजर या लंबे समय तक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन टैंक ।
  2. hiRPE कक्षों के लिए
    1. 1 बीतने पर, hiRPE कोशिकाओं अलग कर देना जब कोशिकाओं को धाराप्रवाह हैं ।
      नोट: hiRPEp0 कक्षों की कोई cryopreservation अनुशंसित नहीं है ।
    2. महाप्राण टी से मध्यम-25 सेमी2 कुप्पी वैक्यूम-आकांक्षा प्रणालियों का उपयोग कर और एक 5 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर पंजाब के 3 मिलीलीटर के साथ इसे धो 1x ।
    3. हटाने के निर्वात का उपयोग कर पंजाब-आकांक्षा प्रणालियों, जोड़ें ०.२५% trypsin की 1 मिलीलीटर, और यह एक मशीन में 15 मिनट की एक ंयूनतम के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन । trypsin गतिविधि को रोकने के लिए ProB27 मध्यम से 5 मिलीलीटर जोड़ें ।
      नोट: trypsin को निष्क्रिय करने के लिए ProN2 माध्यम का उपयोग अनुशंसित नहीं है ।
    4. अलग कर देना hiRPE कोशिकाओं की शीट को pipetting करके इसे ऊपर और नीचे एक 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर । कक्ष काउंटर के साथ कक्षों की गणना । एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन प्लेस और यह 5 मिनट के लिए ११० x g पर केंद्रापसारक
      नोट: एक अतिरिक्त धोने ProN2 माध्यम के साथ किया जा सकता है ProB27 मध्यम की अधिकता को दूर करने के लिए ।
    5. महाप्राण निर्वात-आकांक्षा का उपयोग कर supernatant और धीरे कोशिकाओं resuspend cryopreservation माध्यम के २५० µ एल में २,०००,००० कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए ।
    6. क्रायोजेनिक शीशी प्रति कक्ष निलंबन के २५० µ l का अंतरण । 4 एच की एक ंयूनतम के लिए-८० ° c पर एक isopropanol-आधारित फ्रीजिंग कंटेनर में शीशियों फ्रीज ।
    7. एक-१५० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर या लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक तरल नाइट्रोजन टैंक जमे हुए शीशियों स्थानांतरण ।

7. रेटिना Organoids और hiRPE कोशिकाओं का गल जाना

  1. पूरे रेटिना organoids के गल
    1. ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्म ProB27 मध्यम (2 मिलीलीटर प्रत्येक क्रायोजेनिक शीशी के लिए आवश्यक हो जाएगा) ।
    2. तरल नाइट्रोजन टैंक या-१५० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से, गल एक क्रायोजेनिक शीशी ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी में स्नान में रेटिना organoids युक्त 30 एस के लिए एक संक्रमित समाधान स्प्रे का उपयोग कर सावधानी से क्रायोजेनिक शीशी को संक्रमित ।
    3. शीशी को खोल कर उसमें 1 मिलीलीटर पूर्व-उष्ण ProB27 मध्यम डालें । organoids स्थानांतरण पिपेट के साथ एक १.५ एमएल ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
    4. मध्यम धीरे से इसे ट्यूब के नीचे रेटिना संरचनाओं को छूने के बिना pipetting द्वारा निकालें । पूर्व-उष्ण ProB27 मध्यम से 1 मिलीलीटर के साथ organoids 1 अधिक समय धोएं ।
    5. महाप्राण एक स्थानांतरण प्लास्टिक के साथ organoids और उंहें 1 में जगह एक 6 अच्छी तरह से ProB27 मध्यम पूर्व युक्त प्लेट के ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2में एक मशीन में equilibrated ।
      नोट: प्लेस 10-15 रेटिना organoids प्रति अच्छी तरह से एक 6-खैर प्लेट ।
    6. परिवर्तन मध्यम हर 2-3 दिनों में अपने उद्भव के अनुसार वांछित रेटिना सेल प्रकार प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय के दौरान, चित्रा 2में वर्णित के रूप में.
  2. hiRPE कोशिकाओं का गल जाना
    1. ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्म ProN2 मध्यम (8 मिलीलीटर प्रत्येक क्रायोजेनिक शीशी के लिए आवश्यक हो जाएगा) ।
    2. तरल नाइट्रोजन टैंक या-१५० ° c फ्रीजर, गल से hiRPEp1 कोशिकाओं के एक क्रायोजेनिक नमूना ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी में स्नान के लिए 30 एस के लिए, क्रायोजेनिक शीशी को ध्यान से संक्रमित समाधान स्प्रे का उपयोग कर ।
    3. ट्यूब खोलें और पूर्व गर्म ProN2 मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें और एक 15 मिलीलीटर पूर्व गर्म ProN2 मध्यम के 2 मिलीलीटर युक्त ट्यूब के लिए सेल निलंबन हस्तांतरण । यह 5 मिनट के लिए ११० x g पर केंद्रापसारक
    4. supernatant निकालें और धीरे ProN2 मध्यम पूर्व के 2 मिलीलीटर में सेल गोली ३७ डिग्री सेल्सियस पर गरम पुनः स्थगित ।
    5. कक्ष काउंटर के साथ कक्षों को गिनना ।
    6. १,२५०,००० कोशिकाओं लो और उन्हें मैट्रिक्स में जगह-लेपित टी-25 सेमी2 कुप्पी (स्टेप -8) ProN2 मध्यम पूर्व के 5 मिलीलीटर युक्त-३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्म. इस चरण में, 2 (hiRPEp2) के रूप में गद्यांश को नोट करें ।
    7. ProN2 मध्यम में सेल संस्कृति मशीन में hiRPEp2 कोशिकाओं ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 में ४८ एच के लिए रखें मध्यम बदलने से पहले ।
    8. हर 2-3 दिन मीडिया बदलें । जब hiRPE कोशिकाएं संगम तक पहुंचती हैं, तो अगले गद्यांश या cryopreservation को पूरा करें ।
      नोट: संस्कृति में 2 सप्ताह के बाद, 8-10 लाख hiRPE कोशिकाओं को आगे प्रयोगों के लिए एकत्र किया जा सकता है ।

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Representative Results

फीडर-नि: शुल्क स्थितियों में मानव iPSC विभेदन के लिए पहला कदम एक सहज विभेद (आंकड़ा 1a) को प्रोत्साहित करने के लिए द्वि-नवीनीकरण मशीनरी को बंद करना है । फिर, D2 पर, द्वि मध्यम एक N2 पूरक के साथ पूरित है तंत्रिका और रेटिना वंश की ओर iPSCs कोशिकाओं अंतर गाइड । इस प्रक्रिया के आसपास D28 (चित्रा 1C - 1E) पर neuroretinal कलियों की उपस्थिति की ओर जाता है । स्व-बनाने neuroretinal संरचनाओं एक सुई का उपयोग कर अलग किया जा सकता है के रूप में चित्रा 1E में सचित्र और संस्कृति प्लेटों में स्थानांतरित करने के लिए अस्थायी संस्कृति ProB27 माध्यम (चित्रा 1F) का उपयोग कर स्थितियों में रेटिना organoids की परिपक्वता की अनुमति । विकास और तंत्रिका रेटिना के विकास एहसान करने के लिए, FGF2 1 सप्ताह (चित्रा 1a) के लिए माध्यम से जोड़ा जाता है ।

D28 में, उभरते रेटिना संरचनाओं मुख्य रूप से रेटिना जनक कोशिकाओं जो सह PAX6, RAX, और VSX215के रूप में प्रमुख प्रतिलेखन कारक व्यक्त होते हैं । इन progenitors एक evolutionarily में चल संस्कृति की स्थिति में रेटिना सेल प्रकार के सात प्रमुख वर्गों को जंम देने के जन्म क्रम मानव रेटिना विकास के अनुरूप । qRT-पीसीआर और immunohistochemistry के आधार पर पहले Reichman एट अल में वर्णित है । 15, चित्रा 2 में व्यापक घटता जल्दी और देर से पैदा रेटिना सेल पीढ़ियों के शो लहरों में एक इन विट्रो परिपक्वता प्रक्रिया के दौरान. इस प्रकार, संस्कृति समय organoids में मौजूद कोशिका प्रकार को परिभाषित करता है ।

किसी भी आगे प्रवर्धन के लिए hiRPE कोशिकाओं का अलगाव ही प्रदर्शन किया जा सकता है जब रंजकता प्रत्यक्ष है क्योंकि इस सेल रंगाई उनके दृश्य की अनुमति देता है । इस तरह, ProN2 मध्यम D28 से D42 करने के लिए RPE कोशिकाओं15की रंजकता एहसान करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

मानव iPSC क्लोन पर निर्भर करता है, pigmented पैच से पहले या रेटिना संरचनाओं के आत्म गठन के बाद पता लगाया जा सकता है; लेकिन ज्यादातर 1 या 2 सप्ताह D28 पर ProN2 माध्यम के उपयोग के बाद (3ए, बी) । hiRPE कोशिकाओं के एक प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवि 0 के पारित होने पर अलग पैच से विस्तारित चित्रा 3 सी और 3 डीमें दिखाया गया है. फिर, hiRPE कोशिकाओं का विस्तार किया जा सकता है जब तक पारित 4, एक उपकला mesenchymal संक्रमण (EMT) के बिना उनके RPE phenotype को बनाए रखना. फिर भी, EMT इस तरह के वाई के रूप में रॉक अवरोधकों के उपयोग से रोका जा सकता है-२७६३२, इसके अलावा सेल संख्या17अंश की वृद्धि की अनुमति । गल के बाद hiRPE कोशिकाओं की दीर्घकालिक संस्कृतियों आसानी से यहां वर्णित शर्तों में किया जा सकता है एक परिपक्व और कार्यात्मक उपकला15प्राप्त करने के लिए । एक शास्त्रीय cuboidal cobblestone आकृति विज्ञान के साथ ५२ सप्ताह में परिपक्व hiRPEp2 कोशिकाओं का एक उदाहरण चित्रा 3Eमें सचित्र है ।

Figure 1
चित्रा 1: अनुयाई मानव iPSCs से रेटिना organoids की पीढ़ी और परिपक्वता. (क) विभेदक रेटिना organoids की पीढ़ी की अनुमति प्रोटोकॉल । (ख) D0 पर मानव iPSCs. (ग) D15 में उभरते neuroretinal उपकला. (घ) D22 पर स्वयं तंत्रिका रेटिना की तरह संरचनाओं का गठन. (ङ) यहां, neuroretinal कली एक सुई का प्रयोग अलग है । (च) D35 में फ़्लोटिंग कल्चर स्थिति में रेटिना organoids का प्रतिनिधि छवियाँ. स्केल बार्स = २०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: मानव iPSC की तरंगों-रेटिना सेल पीढ़ी व्युत्पंन । संक्षिप्त नाम: रेटिना जनक कोशिकाओं (rpc), रेटिना नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं (RGCs), क्षैतिज कोशिकाओं (हो), amacrine कोशिकाओं (Am), म्यूलर glial कोशिकाओं (MGCs), द्विध्रुवी कोशिकाओं (बीपी), और photoreceptors (पीआर). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: मानव iPSC के उत्पादन और प्रवर्धन-व्युत्पंन RPE । (A) मानव hiRPE कोशिकाओं के सृजन की अनुमति भेदभाव प्रोटोकॉल का एक उदाहरण । (ख) चरण-विपरीत pigments 6 सप्ताह में अनुयाई मानव iPSCs अंतर से उभर पैच दिखा (W6) । (ग) hiRPEp0 कोशिकाओं की खेती एक सप्ताह (W1) pigmented पैच उठा के बाद. (घ) सप्ताह में hiRPEp0 कोशिकाओं 6 (W6) pigmented पैच उठा के बाद. (ङ) hiRPEp2 कोशिकाओं की एक प्रतिनिधि छवि गल जाने के बाद, ProN2 माध्यम में ५२ सप्ताह (W52) के लिए खेती की जाती है. स्केल बार्स = २०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे RPE कोशिकाओं और रेटिना organoids का उत्पादन करने के लिए, रेटिना RGCs और photoreceptors से युक्त, pluripotent में मानव एक्सो स्टेम कोशिकाओं से मुक्त और फीडर मुक्त शर्तों. अच्छी विनिर्माण अभ्यास (जीएमपी) की प्रक्रिया के साथ संगत, यहां प्रस्तुत की गई विधि iPSC-व्युत्पन्न रेटिना कोशिकाओं के RPE कोशिकाओं, RGCs के रूप में एक बड़े उत्पादन की अनुमति देता है, और photoreceptors स्टेम कोशिका के विकास के लिए चिकित्सा और दवा आधारित रेटिना अपक्षयी रोगों के भविष्य के उपचार के लिए डिस्कवरी दृष्टिकोण । पूरे रेटिना organoids या hiRPE कोशिकाओं के cryopreservation भी मध्यवर्ती सेल बैंकों की स्थापना में एक प्रमुख लाभ प्रदान करता है, स्टेम सेल आधारित चिकित्सा में भविष्य के उपयोग के लिए एक महत्वपूर्ण कदम.

विभेद की एक विशिष्ट स्तर पर विशिष्ट रेटिना कोशिका प्रकार के बड़े शेयरों का उत्पादन भविष्य नैदानिक अनुवाद के लिए आवश्यक हो जाएगा. इस संबंध में, CD73 के तीन महीनों में जनरेशन-पॉजिटिव photoreceptor पुरोगामी एक प्रत्यारोपण-संगत कोशिका जनसंख्या18के रूप में वर्णित है, और इस संभावना को फ्रीज से गल रेटिना इन अपरिपक्व photoreceptors उत्पन्न करने के लिए organoids15 चिकित्सीय प्रयोजनों के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग करने की आशा को पुष्ट । रेटिना pigmented उपकला के विषय में, इन विट्रो में पैदा करना करने के लिए hiRPE कोशिकाओं की क्षमता बड़े सेल प्रोडक्शंस के लिए उन्हें बैंक की अनुमति देता है. महत्वपूर्ण रूप से, गल मानव iPSC व्युत्पंन RPE कोशिकाओं उनके RPE phenotype और समारोह को बनाए रखने, इसलिए, पौष्टिकता कारक के रूप में स्राव या photoreceptor बाहरी खंड phagocytosis15, स्क्रीनिंग रणनीतियों के लिए उपयोग की उनकी आसानी मांय के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में भविष्य चिकित्सीय दृष्टिकोण ।

iPSC की पीढ़ी के लिए प्रोटोकॉल की एक किस्म है-व्युत्पंन रेटिना organoids7,8,9,10,11,12,15 में भिंनता है कि कल्चरल तरीके (embryoid बॉडी-जैसे समुच्चय बनाम अनुयाई कोशिकाओं) के साथ ही कार्यकुशलता और मजबूती. यहां वर्णित विधि अनुयाई मानव iPSCs से शुरू होता है और मानव iPSC15लाइनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक reproducible प्रभावकारिता, अनुकूलन क्षमता, और प्रयोज्यता से पता चलता है । इस प्रक्रिया, सीरम मुक्त मीडिया के क्रमिक परिवर्तन के आधार पर, recapitulates विभेदक गाइड करने के लिए प्रणाली के आंतरिक संकेतों का दोहन करके रेटिना विकास के मुख्य कदम । इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण लाभ भ्रूण शरीर के गठन के अभाव और भविष्य जीएमपी-समर्थक रेटिना सेल विनिर्माण प्रोटोकॉल के लिए मैट्रिक्स के अलावा सेल थेरेपी डेरिवेटिव का उत्पादन करने के लिए है । इस तरह, रेटिना organoid पीढ़ी और परिपक्वता की दक्षता में कोई अंतर नहीं xenogeneic और नो-xenogeneic संस्कृति सेल थेरेपी सिस्टम (सीटीएस) की खुराक या नहीं का उपयोग कर स्थितियों के बीच पाया गया, रिकॉमबिनेंट के साथ विशेष रूप से तैयार या मानवीय घटकों ।

रेटिना भेदभाव विधि की सफलता काफी हद तक मानव iPSC संस्कृतियों की गुणवत्ता पर निर्भर करता है । reprogramminging विधि मानव iPSCs के अंतर दक्षता रेटिना कोशिकाओं को प्रभावित नहीं करता है8, लेकिन उनके उपजी स्थिति इष्टतम होने की जरूरत है । संक्षेप में, नियमित रूप से खेती मानव iPSCs भेदभाव के कोई संकेत नहीं दिखाना चाहिए । कालोनियों को ओवरलैप नहीं करना चाहिए और उनकी विशेषता गोलाकार आकृति विज्ञान प्रदर्शित करना चाहिए । हालांकि रेटिना भेदभाव की दक्षता क्लोन निर्भर है,2 सेमी प्रति दो रेटिना संरचनाओं की एक ंयूनतम D28 में उठाया जा सकता है, ५०-६० एक 6-cm डिश के लिए neuroretinal संरचनाओं के लिए इसी । चल संस्कृति की स्थिति में रेटिना organoid परिपक्वता के लिए, अच्छी तरह से प्रति संरचनाओं की संख्या सीमित संरचना संलयन और मध्यम खपत से बचा जाता है । इन संस्कृति की स्थिति में, रेटिना organoids देर रेटिना सेल प्रकार प्राप्त करने के लिए आवश्यक एक व्यापक समय के लिए maturated जा सकता है.

आगे खोज, रेटिना organoids इस विधि द्वारा इन विट्रो में उत्पन्न मॉडल रेटिना रोगों के लिए शक्तिशाली उपकरण का गठन. रोगी विशेष iPSC-व्युत्पन्न रेटिना सेल मॉडल अपने आणविक और सेलुलर तंत्र की खोज से बेहतर जटिल या आनुवंशिक रोगों को समझने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. इन मॉडलों उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग, सेल और जीन चिकित्सा, या जीनोम संपादन दृष्टिकोण के माध्यम से दवा की खोज के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हो जाएगा, रेटिना dystrophies के लिए अभिनव उपचार विकसित करने के लिए ।

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Disclosures

साचा Reichman, ओलिवर Goureau, और जोस-Alain सहेल मानव pluripotent स्टेम सेल से रेटिना कोशिकाओं की पीढ़ी से संबंधित लंबित पेटेंट पर अंवेषकों हैं ।

Acknowledgments

लेखक की स्थापना के दौरान अपने इनपुट के लिए है Goureau टीम के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा यहां वर्णित तरीकों की, और उनके महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए जी Gagliardi और एम. Garita । यह काम ANR (GPiPS: ANR-२०१०-RFCS005 से अनुदान द्वारा समर्थित था; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), रेटिना फ्रांस एसोसिएशन और प्रौद्योगिकी अंतरण कंपनी सत्त Lutech । यह भी ANR Investissements कार्यक्रम (d'Avenir-11-ANR-0004-02) के भीतर IDEX द्वारा समर्थित LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-६५) के फ्रेम में प्रदर्शन किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated ThermoFisher Scientific A14700 Coating
CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated ThermoFisher Scientific A27940 Coating
Essential 8 Medium ThermoFisher Scientific A1517001 medium
Essential 6 Medium ThermoFisher Scientific A1516401 medium
CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement ThermoFisher Scientific A1370701 supplement CTS
N-2 Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17502048 supplement
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504044 supplement
CTS B-27 Supplement, XenoFree ThermoFisher Scientific A1486701 supplement CTS
DMEM/F-12 ThermoFisher Scientific 11320074 medium
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140035 supplement
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122 antibiotic
CellStart CTS ThermoFisher Scientific A1014201 Matrix CTS
Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix ThermoFisher Scientific A1569601 Matrix
Gentle Cell Dissociation Reagent Stemcell Technologies 7174 dissociation solution
Cryostem Freezing Media clinisciences 05-710-1D Cryopreservation medium
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) Preprotech 100-18B FGF2
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free Preprotech AF-100-18B FGF2 Xeno free
AGANI needle 23G Terumo AN*2332R1 Needle
Flask 25 cm² Tissue Culture Treated Falcon 353109 T-25 cm²
24 well plate Tissue Culture Treated Costar 3526 24-well plate
6 well plate Tissue Culture Treated Costar 3516 6-well plate

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक १३९ रेटिना organoids pluripotent स्टेम सेल भेदभाव सेल चिकित्सा ड्रग डिस्कवरी
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Slembrouck-Brec, A., Nanteau, C., Sahel, J. A., Goureau, O., Reichman, S. Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models. J. Vis. Exp. (139), e57795, doi:10.3791/57795 (2018).

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