Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Definerte Xeno-fri og mater-fri kultur betingelser for generering av menneskelig iPSC-avledet Retinal celle modeller

Published: September 6, 2018 doi: 10.3791/57795
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Institut de la Vision, Sorbonne Université, INSERM, CNRS, F-75012 Paris, France
* These authors contributed equally

Summary

Produksjon av spesialiserte netthinnen celler fra pluripotent stamceller er et vendepunkt i utviklingen av stilk cellen-basert behandling for retinal sykdommer. Dagens papir beskriver en enkel metode for en effektiv generasjon av netthinnen organoids og retinal pigmentert epitel for grunnleggende translasjonsforskning og klinisk forskning.

Abstract

Produksjon av spesialiserte celler fra pluripotent stamceller gir et kraftig verktøy for å utvikle nye metoder for regenerativ medisin. Bruk av menneskeskapte pluripotent stamceller (iPSCs) er spesielt attraktivt for nevrodegenerative sykdommer studier, inkludert retinal dystrophies, der iPSC-avledet retinal celle modeller merke et stort skritt fremover å forstå og kjempe blindhet. I dette papir beskriver vi en enkelt og skalerbar protokoll for å generere modne og cryopreserve retinal organoids. Basert på medium endre, den største fordelen med denne metoden er å unngå flere tidkrevende trinn kreves vanligvis en guidet atskilling av iPSCs. Etterligne de tidlige fasene av netthinnen utvikling av etterfølgende endringer av definert medier på tilhenger menneskelige iPSC kulturer, denne protokollen tillater samtidig generering av selv danner neuroretinal strukturer og retinal pigmentert (RPE) epitelceller i en reproduserbar og effektiv måte i 4 uker. Disse strukturene som inneholder retinal progenitor celler (RPCer) kan være enkelt isolert for ytterligere modning i flytende kultur stand aktivere differensiering av RPCer inn i sju retinal celletyper tilstede i voksen human netthinnen. I tillegg beskriver vi raske metoder til kryonisk bevaring av netthinnen organoids og RPE celler for langtidslagring. Kombinert sammen, vil metodene som er beskrevet her være nyttig å produsere og bank menneskelige iPSC-avledet netthinnen celler eller vev for både grunnleggende og klinisk forskning.

Introduction

Netthinnen er en integrert del av sentralnervesystemet (CNS) og har begrenset kapasitet til å regenerere spontant etter en traumatisk skade eller sykdommer. Derfor føre degenerative patologi som forårsaker definitive retinal celle tap, som aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), retinitis pigmentosa (RP), grønn stær og diabetisk retinopati, vanligvis til irreversible blindhet. Redde degenerert netthinnen er en stor utfordring som stilk cellen-basert behandling å erstatte skadet eller tapt cellene er en av de mest lovende tilnærminger1,2,3. Pluripotent stamceller som menneskelige embryonale stamceller (ESCs) celler eller menneskeskapte pluripotent stamceller (iPSCs) har kapasitet til å bli utvidet på ubestemt tid i kultur, og de har muligheten å tilvirke alle celletyper. Fremskritt innen vår forståelse av netthinnen utvikling og forbedring av in vitro protokoller for menneskelig iPSC differensiering har resultert i generasjon av netthinnen organoids7,8,9, 10,11,12. Alle store retinal cellene, inkludert retinal ganglieceller (RGCs), fotoreseptorer og retinal pigmentert (RPE) epitelceller, har blitt vellykket differensiert fra menneskelige ESCs og iPSCs4,5, 6. basert på SFEB (serum-fri kultur av embryoid kroppen som aggregater) metoden utviklet av Eiraku et al. 13, selv dannelsen av netthinnen organoids kan fås fra ESC - eller iPSC-avledet embryoid kroppen som aggregater i definerte ekstracellulær matrix komponenter7,10,14. Men disse protokollene er intrikate, som krever mange trinn ikke alltid kompatibel med store produksjonen av celler for terapeutiske metoder eller narkotikarelaterte screening. Dermed valget av metoden å produsere human netthinnen celler er kritisk og metoden må være robuste, skalerbare og effektive.

Her beskriver vi basert på vår forrige publikasjonen15, hvert trinn for en enkel og effektiv generasjon netthinnen celler gjennom netthinnens organoid selv formasjon fra tilhenger menneskelige iPSCs dyrket i en mater- og xeno-fri tilstand. Denne protokollen fra rutinemessige kulturer av tilhenger menneskelige iPSCs, og krever bare en enkel påfølgende medium endrer tillate generering av både iPS-avledet RPE (hiRPE) celler og neuroretinal strukturer i 4 uker. Etter en manuell isolasjon, hiRPE kan utvides og retinal strukturer kan kultivert som flytende organoids hvor retinal progenitor celler er kjøpedyktig skille ut alle retinal celletyper i en rekkefølge som er forenlig med den i vivo menneskelige retinogenesis. Til slutt, forskning utvikling eller klinisk oversettelse beskriver vi en kryonisk bevaring metoden tillater lagring av hele retinal organoids og hiRPE celler uten å påvirke deres fenotypiske egenskaper og funksjonaliteten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen beskrevet i denne hvitboken følger retningslinjene i Institut de la Visjonens forskning etikk. Institut de la visjon har fått manipulering av menneskelig etter gjeldende franske regulering. Prøve-håndtering følger pasienten databeskyttelse i samsvar med prinsippene i Helsinki og nasjonale forskrifter etter etiske godkjennelse av "Comité de beskyttelse des Personnes (CPP) Ile-de-France V".

1. forberedelse av kultur medier og retter

  1. Kultur medier
    1. Bruk iPSC medium, en kjemisk definerte medium dedikert til pluripotent stamceller kultur i arkmateren uten betingelser16. Forberede 500 mL medium i henhold til produsentens protokollen.
    2. Bruk basale iPSC (Bi) medium, iPSC kjemisk definert medium uten fibroblast vekstfaktor 2 (FGF2) eller transformere vekstfaktor Beta (TGFß).
    3. Forberede 500 mL Bi medium med 1% N2 supplement (skuff 2 middels), 10 enheter/mL av penicillin og 10 mg/mL streptomycin.
    4. Forberede 500 mL proneural N2-baserte medium (ProN2 medium) består av DMEM:Nutrient blanding F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-glutamin), 1% MEM unødvendige aminosyrer, 1% N2 supplement, 10 enheter/mL av penicillin og 10 mg/mL streptomycin.
    5. Forberede proneural B27-baserte medium (ProB27 medium) består av DMEM:Nutrient blanding F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-glutamin), 1% MEM unødvendige aminosyrer, 2% B27 supplement, 10 enheter/mL av penicillin og 10 mg/mL streptomycin.
  2. Kultur fartøy forberedelse
    1. For menneskelige iPSC kultur
      1. Forberede 10 mL av en vitronectin løsning som inneholder 5 μg/mL av vitronectin i 1 x PBS. I 10 mL 1 x PBS, kan du legge 100 µL av tinte vitronectin lager løsningen (100 x).
      2. Distribuere 2 mL vitronectin løsningen per 6 cm kultur parabol tilsvarer 0,5 µg/cm2. Inkuber det 1t ved romtemperatur (RT). Fjern vitronectin løsningen ved aspirasjon bruker et vakuum-aspirasjon system eller en 5 mL pipette.
      3. Legge til 4 mL iPSC medium per 6 cm parabolen.
      4. Inkuber retter i en celle kultur inkubator på 37 ° C og 5% CO2 i minst 30 min før bruk.
    2. For menneskelig iPSC-avledet RPE (hiRPE) cellekultur
    3. Bruk pluripotent stamceller kvalifisert matrise eller substrat til coat brønner i henhold til produsentens protokollen. Legg nok matrise eller substrat å dekke hele vekst areal. For eksempel Legg 300 µL av matrise per brønn i 24-vel plate og 3 mL matrix i en T-25 cm2 kolbe.
    4. Inkuber belagt kultur fartøyene i minst 1 h på 37 ° C. Fjerne matrisen bruker vakuum-aspirasjon systemer eller en 5 mL pipette.
    5. Legge 1 mL av ProN2 medium per brønn på 24-vel plater og tilbake kultur fartøyet til inkubator i minst 30 minutter til varme og equilibrate medium. Hvis T-25 cm2 flasker, se trinn 5.2.

2. vedlikehold og utvidelse av menneskelig iPSCs

  1. Vedlikehold av menneskelig iPSCs
    1. Forberede 3 mL iPSC medium i en 15 mL tube og holde det på RT i minst 15 min. før bruk. Forberede en belagt 6 cm rett som beskrevet i 1.2.1.
    2. Tine et kryogene utvalg av menneskelig iPSCs fra en flytende nitrogen tank eller en-150 ° C fryser ved inkubasjon i et vannbad på 37 ° C for 30 s.
    3. Nøye Desinfiser kryogene ampullen bruke et desinfeksjonsmiddel spray. Overføre de tinte menneskelige iPSCs fra cryotube til 15 mL tube med 3 mL iPSC medium pre varmet på RT.
    4. Sentrifuge røret på 110 x g for 3 min. fjerne nedbryting av aspirasjon bruker et vakuum-aspirasjon system eller en 5 mL pipette.
    5. Resuspend celle pellets med 1 mL av iPSC medium fra en vitronectin-belagt 6 cm kultur parabol med en 2 mL pipette og overføre cellene tilbake til retten. Tilbake rett inkubatoren på 37 ° C og 5% CO2 i minst 24 timer før endring mediet.
      Merk: En ROCK inhibitor, som Y-27632 på 10 µM, kan legges til iPSC medium i 6 cm kultur retter å redusere apoptose.
    6. Endre mediet daglig og passerer den menneskelige iPSCs hver uke.
  2. Passaging av menneskelig iPSCs
    1. Pass menneskelige iPSC på en 70-80% samløpet, klassisk etter 7 dager i kultur.
    2. Forberede 6 cm retter passaging som beskrevet i trinn 1.2.1. Fjerne iPSC mediet fra retter med confluent iPSCs og legge til 2 mL av en dissosiasjon løsning for 6 min RT.
      Merk: Inkubasjon tiden avhenger iPSC kloner. Prøv en 6 min incubation som en start.
    3. Fjern dissosiasjon løsningen bruker vakuum-aspirasjon systemer eller en 5 mL pipette og legge 2 mL iPSC medium pre varmet på RT. Resuspend iPSC koloniene av pipettering dem opp og ned 5-10 x med en 1000 µL pipette.
      FORSIKTIG: Unngå enkeltcelle tar avstand fra overdreven pipettering.
    4. Overføring 30 til 200 µL av resuspended celle klumper i en ny 6 cm kultur parabol. Tilbake retter til celle kultur inkubator på 37 ° C og 5% CO2 i minst 24 timer før du endrer medium.
      Merk: Resuspended celle klumper behøvde for det passaging volumet avhenger iPSC kloner.
    5. Endre mediet daglig og passerer den menneskelige iPSCs hver uke.

3. generasjon av netthinnen Organoids

  1. Starte iPSC differensiering følger protokollen schematized i figur 1A når koloniene når en 60-70% samløpet (figur 1B).
  2. Forberede 4 mL av Bi medium per 6 cm parabolen. Varme Bi mellomlang til 37 ° C. Endre iPSC mediet til Bi medium. Merk denne gangen som 0 (D0).
  3. På D2, bytte kulturer i Bi medium til en skuff 2 medium, tidligere varmet på 37 ° C. Endre mediet hver 2-3 dager.
  4. Identifisere emergent selv danner retinal organoids av neuroepithelium knopper, som vist i figur 1 c -1E.
    Merk: Disse tidlige retinal organoids, tilsvarende i deres utviklingsstadiet til optikk cup, kan isoleres manuelt for nedstrøms eksperimentering.

4. modning av netthinnen Organoids

  1. Ved D28, utarbeide 6-vel plater som inneholder 4 mL/vel av ProB27 medium først supplert med 10 ng/mL FGF2 (figur 1A).
    Merk: Legg FGF2 umiddelbart før media legges til platene.
    Forsiktig: Ikke Filtrer FGF2.
  2. Gjenopprette retinal strukturer fra 6 cm rettene manuelt. Dette gjør isolere strukturer gjør vinkelrett striations med nålen rundt neuroepithelial bud, som vist i figur 1E, og koble til organoids ved å forsiktig skrape dem med nålen.
  3. Sug opp 10-15 organoids bruker en 1000 µL pipette og overføre dem i en enkelt brønn av 6-vel plate inneholder ProB27 medium.
  4. Hold den retinal organoids i flytende kultur forhold i ProB27 medium i en celle kultur inkubator på 37 ° C og 5% CO2. Endre halvparten av mediet hver 2-3 dager.
    Merk: Behandle organoids med FGF2 til D35.
  5. På D35, ta halvparten av mediet og legge fersk prewarmed ProB27 medium på 37 ° C uten FGF2.
  6. Endre halvparten av mediet hver 2-3 dager i løpet av tiden det tar å få de ønskede retinal celletyper ifølge fremveksten retinal celletyper, som vist i figur 2.

5. generasjon og forsterkning av menneskelige iPSC-avledet RPE (hiRPE) celler

  1. Generasjon av menneskelig hiRPE celler
    1. Delta i iPSCs i differensiering når koloniene når en 60-70% samløpet, følger protokollen schematized i figur 3A.
    2. Forberede 4 mL per 6 cm rett av Bi medium og varme Bi mediet på 37 ° C. Endre iPSC mediet til Bi medium. Merk denne gangen som 0 (D0).
    3. På D2, bytte kulturer i Bi medium til en skuff 2 middels tidligere varmet på 37 ° C. Endre mediet hver 2-3 dager.
    4. På D28, endre mediet til en frisk ProN2 medium tidligere varmet på 37 ° C som vist i figur 3A.
      Merk: Dette trinnet kan gjøres etter organoid plukking beskrevet i trinn 4.
    5. Endre ProN2 mediet hver 2-3 dager.
    6. På D42, identifisere emergent hiRPE celler ved observasjon av pigmenterte flekker som vist i figur 3B.
      Merk: Pigmentering av hiRPE celler vises mellom D35 til D56 avhengig av iPSC kloner.
  2. Forsterkning av hiRPE celler
    1. Ved D42, utarbeide en 24-vel plate tidligere belagt med matrisen som beskrevet i trinn 1.2.2 og inneholder 1 mL av ProN2 medium per brønn. Plass platen i 15 minutter i kuvøse på 37 ° C og 5% CO2 før bruk.
    2. Gjenopprette de hiRPE oppdateringene fra 6 cm parabolen manuelt. Å isolere patcher, lage en vinkelrett striation med nålen rundt pigmentert epitel og koble arket ved å forsiktig skrape den med nålen. Sug opp 10 pigmenterte flekker med en 1000 µL pipette og overføre dem i en enkelt brønn av 24-vel plate.
    3. Hold hiRPE patcher i ProN2 medium i en celle kultur inkubator på 37 ° C og 5% CO2 for 48 timer før du endrer medium. Merk denne hiRPE celle passasjen som 0 (hiRPEp0). Endre mediet hver 2-3 dager med ProN2 medium.
    4. Passere hiRPEp0 cellene når cellene ikke er confluent.
      1. Fjerne mediet bruker vakuum-aspirasjon systemer og vask hver vel 1 x med 1 mL av PBS bruker en 5 mL pipette.
      2. Forkaste PBS bruker vakuum-aspirasjon systemer legge 200 µL per brønn av 0,25% trypsin og ruge det i minst 15 minutter i en inkubator på 37 ° C. Legge til 800 µL av ProB27 medium å deaktivere trypsin.
        Merk: Bruk av ProN2 medium å stoppe trypsin aktiviteten anbefales ikke.
      3. Distansere arket hiRPE celler av pipettering det opp og ned. Sett celle suspensjon i en 15 mL tube og sentrifuge det etter 5 min på 110 x g.
        Merk: En ekstra vask kan gjøres med ProN2 medium for å fjerne overflødig ProB27 medium.
      4. Fjerne nedbryting og forsiktig resuspend celle pellet i 2 mL av ProN2 medium pre varmet på 37 ° C. Telle celler med en celle teller.
      5. Ta 1,25 millioner celler og plassere dem i en matrix-belagt T-25 cm2 kolbe (se trinn 2.2.2) som inneholder 5 mL av ProN2 medium pre varmet på 37 ° C. Merk denne hiRPE celle passasjen som 1 (hiRPEp1).
    5. Hold hiRPE cellene i ProN2 medium i en celle kultur inkubator på 37 ° C og 5% CO2 for 48 timer før du endrer medium.
    6. Endre media hver 2-3 dager. Når de hiRPEp1 cellene nå samløpet, utføre neste avsnitt eller kryonisk bevaring.

6. kryonisk bevaring av Retinal Organoids og hiRPE celler

  1. For hele retinal organoids
    1. Velg 5 til 20 retinal organoids bruker en overføring Pipetter og plassere dem i Kryogenisk ampuller. Fjerne alle overflødig medium med en 1000 µL pipette uten å berøre organoids på bunnen av røret og legge til 250 µL av kaldt kryonisk bevaring medium (se Tabell for materiale).
    2. Fryse ampullene i isopropanol-baserte frysing beholdere ved-80 ° C i minst 4 h. Transfer frosne hetteglass til-150 ° C fryser eller flytende nitrogen tank for langtidslagring.
  2. For hiRPE celler
    1. På passage 1, distansere hiRPE cellene når cellene ikke er confluent.
      Merk: En kryonisk bevaring av hiRPEp0 celler er ikke anbefalt.
    2. Sug opp mediet T-25 cm2 kolbe bruker vakuum-aspirasjon systemer og vaske det 1 x med 3 mL PBS bruker en 5 mL pipette.
    3. Fjerne PBS bruker vakuum-aspirasjon systemer, Legg 1 mL av 0,25% trypsin og ruge det i minst 15 minutter i en inkubator på 37 ° C. Legge til 5 mL av ProB27 medium å stoppe trypsin aktiviteten.
      Merk: Bruk av ProN2 medium å deaktivere trypsin anbefales ikke.
    4. Distansere arket hiRPE celler av pipettering det opp og ned ved hjelp av en 10 mL pipette. Telle celler med cellen counter. Sett celle suspensjon i en 15 mL tube og sentrifuge det etter 5 min på 110 x g.
      Merk: En ekstra vask kan utføres med ProN2 medium for å fjerne overflødig ProB27 medium.
    5. Sug opp nedbryting bruker vakuum-aspirasjon og forsiktig resuspend celler for å få 2 millioner celler i 250 µL av kryonisk bevaring medium.
    6. Overføre 250 µL av cellen suspensjon per kryogene medisinglass. Fryse ampullene i isopropanol-baserte frysing beholdere ved-80 ° C i minst 4 timer.
    7. Transfer frosne hetteglass-150 ° C fryser eller en flytende nitrogen tank for langtidslagring.

7. tining av Retinal Organoids og hiRPE celler

  1. Tiner hele retinal organoids
    1. Varm ProB27 medium på 37 ° C (2 mL vil være nødvendig for hvert kryogene hetteglass).
    2. Fra flytende nitrogen tanken eller-150 ° C fryser, tine kryogene ampuller som inneholder retinal organoids i et vannbad på 37 ° C for 30 s. Disinfect kryogene ampullen forsiktig med desinfeksjonsmiddel spray.
    3. Åpne ampullen og Legg 1 mL av forvarmes ProB27 medium. Overføring av organoids til en 1,5 mL tube med en overføring pipette.
    4. Fjerne mediet forsiktig ved pipettering det uten å berøre retinal strukturer nederst på røret. Vask organoids 1 mer tid med 1 mL av forvarmes ProB27 medium.
    5. Sug opp organoids med en overføring Pipetter og plassere dem i 1 godt i en 6-vel plate inneholder ProB27 medium pre varmet og equilibrated i en inkubator på 37 ° C og 5% CO2.
      Merknad: Plassere 10-15 retinal organoids per brønn av en 6-vel plate.
    6. Endre halvparten av mediet hver 2-3 dager i løpet av tiden det tar å få de ønskede retinal celletyper ifølge fremveksten, som beskrevet i figur 2.
  2. Tiner hiRPE celler
    1. Varm ProN2 medium på 37 ° C (8 mL vil være nødvendig for hvert kryogene hetteglass).
    2. Fra flytende nitrogen tanken eller-150 ° C fryser, tine et kryogene utvalg av hiRPEp1 celler av en inkubasjon i et vannbad på 37 ° C for 30 s. Disinfect kryogene ampullen forsiktig med desinfeksjonsmiddel spray.
    3. Åpne røret og legge 1 mL av forvarmes ProN2 medium og overføre celle suspensjon til en 15 mL tube med 2 mL forvarmes ProN2 medium. Sentrifuge det etter 5 min på 110 x g.
    4. Fjerne nedbryting og forsiktig resuspend celle pellet i 2 mL av ProN2 medium pre varmet på 37 ° C.
    5. Telle celler med en celle teller.
    6. Ta 1,25 millioner celler og plassere dem i matrix-belagt T-25 cm2 kolbe (se trinn 2.2.2) som inneholder 5 mL av ProN2 medium pre varmet på 37 ° C. På dette stadiet, Merk passasjen som 2 (hiRPEp2).
    7. Hold hiRPEp2 cellene i ProN2 medium i celle kultur inkubator på 37 ° C og 5% CO2 for 48 timer før du endrer medium.
    8. Endre media hver 2-3 dager. Når de hiRPE cellene nå samløpet, utføre neste avsnitt eller kryonisk bevaring.
      Merk: Etter 2 uker i kultur, 8-10 millioner hiRPE celler kan samles ytterligere experimentations.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det første skrittet for menneskelig iPSC differensiering dyrket i arkmateren uten betingelser16 er å slå av selvtillit fornyelse maskiner ved hjelp av Bi medium for å oppmuntre en spontan differensiering (figur 1A). Deretter på D2, Bi mediet er supplert med en N2 supplement å styre unike iPSCs celler mot nevrale og retinal linjen. Denne prosessen fører til utseendet neuroretinal knopper på rundt D28 (figur 1 c - 1E). Selv danner neuroretinal strukturer kan isoleres bruker en nål, som vist i figur 1E og overført til kultur plater tillate modning av netthinnen organoids i flytende oppdrettsforholdene ved hjelp av ProB27 medium (figur 1F). For å favorisere vekst og utvikling av neural netthinnen, legges FGF2 til mediet for 1 uke (figur 1A).

På D28 inneholder nye retinal strukturer hovedsakelig retinal progenitor celler som uttrykker co nøkkel transkripsjon faktoren som PAX6 og SANY VSX215. Disse progenitors gi opphav til de syv store klassene av netthinnen celletyper i flytende oppdrettsforholdene i et evolusjonært bevarte fødsel bestill forenlig med menneskelig retinal utvikling. Basert på qRT PCR og immunohistochemistry tidligere beskrevet i Reichman et al. 15, bred kurvene i figur 2 viser bølger av tidlig og sent-født retinal celle generasjoner under en i vitro modning prosess. Dermed definerer kultur tiden i celletyper tilstede i organoids.

Isolasjon av hiRPE celler for ytterligere forsterkning kan utføres bare når pigmentering er merkbar fordi denne cellen farge gjør deres visualisering. På denne måten brukes ProN2 mediet fra D28 å D42 for å favorisere pigmentering RPE celler15.

Avhengig av menneskelig iPSC klone, kan de pigmenterte flekkene oppdages før eller etter selv dannelsen av netthinnen strukturer; men oftest 1 eller 2 uker etter bruk av ProN2 medium på D28 (figur 3A, B). En representant lyse feltet bilde av hiRPE celler utvidet fra isolert patcher på passage 0 vises i Figur 3 c og 3D. Deretter kan hiRPE cellene utvides til passering 4, beholder sine RPE fenotypen uten en epithelial-mesenchymal overgang (EMT). Likevel kan EMT forebygges ved bruk av ROCK hemmere som Y-27632, slik at også en økning på celle nummer passasjer17. Langsiktig kulturer av hiRPE celler etter tining kan enkelt utføres i forholdene beskrevet her for å få en moden og funksjonelle epitel15. Et eksempel på eldre hiRPEp2 cellene på uken 52 med en klassisk kubisk brosteinsbelagte morfologi er illustrert i figur 3E.

Figure 1
Figur 1: generasjon og modning av netthinnen organoids fra tilhenger menneskelige iPSCs. (A) differensiering protokollen tillater generering av netthinnen organoids. (B) Human iPSCs på D0. (C) nye neuroretinal epitel på D15. (D) selv forming neural netthinnen-lignende strukturer på D22. (E) her, neuroretinal bud er isolert med en nål. (F) representant bilder av netthinnen organoids i flytende kultur tilstand på D35. Skalere barer = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: bølger av menneskelig iPSC-avledet retinal celle generasjon. Forkortelser: Retinal progenitor celler (RPCer), retinal ganglieceller (RGCs), vannrette celler (Ho), amacrine celler (Am), Müller gliacellene (MGCs), bipolar celler (Bp) og fotoreseptorer (PR). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: generasjon og forsterkning av menneskelig iPSC-avledet RPE. (A) en illustrasjon av differensiering protokollen tillater generering av menneskelig hiRPE celler. (B) kontrast bilder viser pigmentert patcher fremvoksende fra skille tilhenger menneskelige iPSCs uke 6 (W6). (C) hiRPEp0 celler dyrket en uke (W1) etter pigmentert oppdateringen plukking. (D) hiRPEp0 celler i uke 6 (W6) etter pigmentert oppdateringen plukking. (E) A representativt bilde av hiRPEp2 celler etter tining, dyrket i 52 uker (W52) i ProN2 medium. Skalere barer = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver hvordan RPE celler og retinal organoids, som inneholder retinal RGCs og fotoreseptorer, fra menneskelige pluripotent stamceller i xeno- og mater-fri forhold. Kompatibel med god produksjon praksis (GMP) prosessen metoden dyrket presenteres her gjør en stor produksjon av iPSC-avledet netthinnen celler som RPE celler, RGCs og fotoreseptorer for utvikling av stilk cellen-basert behandling og stoff Discovery tilnærminger for fremtidige behandling av netthinnens degenerative sykdommer. Kryonisk bevaring av hele retinal organoids eller hiRPE celler gir også en stor fordel i å etablere mellomliggende cellen banker, et viktig skritt for fremtidig bruk i stilk cellen-basert behandling.

Produksjon av store bestander av spesifikke netthinnen celletyper på et bestemt stadium av differensiering vil være nødvendig for fremtidige klinisk oversettelse. I denne forbindelse generasjonen i tre måneder av CD73-positive photoreceptor prekursorer beskrevet som en transplantasjon-kompatible celle befolkningen18, og muligheten til å generere disse umodne fotoreseptorer fra fryse-tint retinal organoids15 forsterke håp om å bruke disse cellene for terapeutiske formål. Om retinal pigmentert epitel kan evnen til hiRPE celler å spre seg på vitro store celle produksjoner til banken dem. Viktigere, beholder tinte iPSC-avledet RPE menneskeceller sin RPE fenotypen og funksjon, derfor som trophic faktor sekresjon eller photoreceptor ytre segmentet fagocytose15, validere sin brukervennlighet for screening strategier så vel som for fremtidige terapeutiske metoder.

Det finnes en rekke protokoller for generering av iPSC-avledet retinal organoids7,8,9,10,11,12,15 som varierer i kultur metoder (embryoid kropp som samler vs tilhenger celler) effektivitet og robusthet. Metoden beskrevet her starter tilhenger menneskelig iPSCs og viser en reproduserbar effekt, tilpasningsevne og anvendelighet til et bredt spekter av menneskelig iPSC linjer15. Denne prosessen, basert på påfølgende endring av serum-frie medier, viser de viktigste trinnene av netthinnen utvikling ved å utnytte den iboende signaler av systemet for å veilede differensiering. En viktig fordel med denne protokollen er fravær av embryonale kroppen dannelse og tillegg av matrise for fremtidige GMP-kompatibel retinal celle produksjon for å produsere cellen terapi derivater. På denne måten ingen forskjell i effektivitet i netthinnen organoid-generasjonen og modning ble funnet mellom xenogeneic og ingen-xenogeneic kultur forhold med cellen terapi System (CTS) kosttilskudd eller ikke, formulert med rekombinant eller humanized komponenter.

I metoden retinal differensiering avhenger i stor grad kvaliteten av menneskelig iPSC kulturer. Metoden reprogramming påvirker ikke differensiering effektiviteten av menneskelig iPSCs til netthinnen celler8, men stemness status må være optimal. Kort, rutinemessig kultivert menneskelig iPSCs bør ikke viser alle underskriver av differensiering. Koloniene må ikke overlappe hverandre, og må vise sine karakteristiske sirkulær morfologi. Selv om effektiviteten av netthinnen differensiering klone-avhengige, kan minst to retinal strukturer per cm2 plukkes på D28, tilsvarende 50-60 neuroretinal strukturer for en 6 cm rett. For retinal organoid modning i flytende oppdrettsforholdene unngår begrense antall strukturer per brønn struktur fusion og middels overforbruk. I disse kultur forhold, kan netthinnen organoids være maturated for en omfattende tid, pålagt å skaffe sent retinal celletyper.

Gleder, netthinnen organoids generert i vitro ved denne metoden utgjør kraftige verktøy for modell retinal sykdommer. Pasient-spesifikke iPSC-avledet retinal celle modeller vil bli brukt for bedre å forstå komplekse eller genetiske sykdommer av utforskningen av deres molekylære og cellulære mekanismer. Disse modellene vil være spesielt egnet for stoffet funnet gjennom høy gjennomstrømming screening, celle-og genet eller genomet redigering metoder, til å utvikle nyskapende behandlinger for retinal dystrophies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Sacha Reichman og Olivier Goureau José-Alain Sahel venter oppfinnere på patenter relatert til generasjon av netthinnen celler fra menneskelige pluripotent stamceller.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke medlemmer av Goureau's team for innspill deres under Oppsett av metodene som er beskrevet her, og G. Gagliardi og M. Garita for deres kritisk lesing. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra ANR (GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), netthinnen Frankrike foreningen og den teknologioverføring selskapet SATT Lutech. Det ble også utført i rammen av LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65) støttes av ANR Investissements d'Avenir programmet (ANR-11-IDEX-0004-02).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated ThermoFisher Scientific A14700 Coating
CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated ThermoFisher Scientific A27940 Coating
Essential 8 Medium ThermoFisher Scientific A1517001 medium
Essential 6 Medium ThermoFisher Scientific A1516401 medium
CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement ThermoFisher Scientific A1370701 supplement CTS
N-2 Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17502048 supplement
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504044 supplement
CTS B-27 Supplement, XenoFree ThermoFisher Scientific A1486701 supplement CTS
DMEM/F-12 ThermoFisher Scientific 11320074 medium
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140035 supplement
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122 antibiotic
CellStart CTS ThermoFisher Scientific A1014201 Matrix CTS
Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix ThermoFisher Scientific A1569601 Matrix
Gentle Cell Dissociation Reagent Stemcell Technologies 7174 dissociation solution
Cryostem Freezing Media clinisciences 05-710-1D Cryopreservation medium
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) Preprotech 100-18B FGF2
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free Preprotech AF-100-18B FGF2 Xeno free
AGANI needle 23G Terumo AN*2332R1 Needle
Flask 25 cm² Tissue Culture Treated Falcon 353109 T-25 cm²
24 well plate Tissue Culture Treated Costar 3526 24-well plate
6 well plate Tissue Culture Treated Costar 3516 6-well plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, C., Wang, Q., Temple, S. Stem cell therapies for retinal diseases: recapitulating development to replace degenerated cells. Development. 144, 1368-1381 (2017).
  2. Dalkara, D., Goureau, O., Marazova, K., Sahel, J. -A. Let There Be Light: Gene and Cell Therapy for Blindness. Human Gene Therapy. 27, 134-147 (2016).
  3. Wright, L. S., Phillips, M. J., Pinilla, I., Hei, D., Gamm, D. M. Induced pluripotent stem cells as custom therapeutics for retinal repair: Progress and rationale. Experimental Eye Research. 123, 161-172 (2014).
  4. Leach, L. L., Clegg, D. O. Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients with Ocular Disease. Stem Cells. 33, 2363-2373 (2015).
  5. Gill, K. P., Hewitt, A. W., Davidson, K. C., Pébay, A., Wong, R. C. B. Methods of Retinal Ganglion Cell Differentiation From Pluripotent Stem Cells. Translational Vision Science and Technology. 3, 2 (2014).
  6. Giacalone, J. C., Wiley, L. A., et al. Concise review: Patient-specific stem cells to interrogate inherited eye disease. STEM CELLS Translational Medicine. 5, 132-140 (2016).
  7. Nakano, T., Ando, S., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
  8. Reichman, S., Terray, A., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 8518-8523 (2014).
  9. Meyer, J. S., Howden, S. E., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29, 1206-1218 (2011).
  10. Zhong, X., Gutierrez, C., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
  11. Mellough, C. B., Collin, J., et al. IGF-1 Signalling plays an important role in the formation of three dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33, 2416-2430 (2015).
  12. Gonzalez-Cordero, A., Kruczek, K., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9, 820-837 (2017).
  13. Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
  14. Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16698-16703 (2009).
  15. Reichman, S., Slembrouck, A., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).
  16. Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
  17. Croze, R. H., Buchholz, D. E., et al. ROCK inhibition extends passage of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium. Stem Cells Translational Medicine. 3, 1066-1078 (2014).
  18. Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, 6462-6471 (2011).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 139 netthinnen organoids pluripotent stamceller differensiering cellen terapi medisiner
Definerte Xeno-fri og mater-fri kultur betingelser for generering av menneskelig iPSC-avledet Retinal celle modeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Slembrouck-Brec, A., Nanteau, C.,… More

Slembrouck-Brec, A., Nanteau, C., Sahel, J. A., Goureau, O., Reichman, S. Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models. J. Vis. Exp. (139), e57795, doi:10.3791/57795 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter