Summary
De productie van gespecialiseerde netvlies cellen uit pluripotente stamcellen is een keerpunt in de ontwikkeling van stamcel gebaseerde therapie voor retinale ziekten. De huidige paper beschrijft een eenvoudige methode voor een efficiënte generatie van retinale organoids en retinale pigment epitheel voor fundamenteel, translationeel, en klinisch onderzoek.
Abstract
De productie van gespecialiseerde cellen uit pluripotente stamcellen biedt een krachtig hulpmiddel voor de ontwikkeling van nieuwe benaderingen voor regeneratieve geneeskunde. Het gebruik van mens-geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) is met name aantrekkelijk voor neurodegeneratieve ziekte studies, met inbegrip van retinale dystrophie, waar retinale cel iPSC-afgeleide modellen markeert een belangrijke stap voorwaarts te begrijpen en bestrijden van blindheid. In deze paper beschrijven we een eenvoudige en schaalbare protocol to generate, oudere, and cryopreserve retinale organoids. Op basis van middellange veranderende, het belangrijkste voordeel van deze methode is om te voorkomen dat meerdere en tijdrovende stappen vereist vaak een begeleide differentiatie van iPSCs. Het nabootsen van de vroege fasen van retinale ontwikkeling door opeenvolgende wijzigingen van gedefinieerde media op aanhangend menselijke iPSC culturen, dit protocol kunt gelijktijdige opwekking van zelf vorming neuroretinal structuren en netvlies gepigmenteerde epitheliale (RPE) cellen in een reproduceerbaar en efficiënte wijze in 4 weken. Deze structuren met retinal voorlopercellen (RPC's) kunnen gemakkelijk geïsoleerd voor verdere rijping in een zwevende cultuur voorwaarde waardoor de differentiatie van RPC's in de zeven retinale celtypes in het volwassen menselijke netvlies aanwezig. Daarnaast beschrijven we snelle methoden voor cryopreservatie van retinale organoids en RPE cellen voor langdurige opslag. Samen, zijn de hier beschreven methoden nuttig om te produceren en bank menselijke iPSC afkomstige netvlies cellen of weefsels voor zowel fundamenteel en klinisch onderzoek.
Introduction
Het netvlies is een integraal onderdeel van het centrale zenuwstelsel (CNS) en heeft een beperkte capaciteit om spontaan regenereren na een traumatisch letsel of ziekten. Daarom, degeneratieve aandoeningen veroorzaken definitieve retinale cel verlies, zoals leeftijdsgebonden Macula Degeneratie (AMD), retinitis pigmentosa (RP), glaucoom en diabetische retinopathie, meestal leiden tot onomkeerbare blindheid. Redden van de ontaarde netvlies is een grote uitdaging waarvoor de stamcel gebaseerde therapieën gericht op het vervangen van de beschadigde of verloren cellen een van de meest beloftevolle benaderingen1,2,3 zijn. Pluripotente stamcellen als menselijke embryonale stamcellen (SER's) cellen of mens-geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) hebben de capaciteit worden uitgebreid voor onbepaalde tijd in cultuur, en ze hebben het potentieel voor de productie van alle celtypes. Vooruitgang in ons begrip van retinale ontwikkeling en de verbetering van de in vitro protocollen voor menselijke iPSC differentiatie hebben geresulteerd in de generatie van retinale organoids7,8,9, 10,11,12. Alle grote netvlies cellen, met inbegrip van retinale peesknoopcellen (RGCs), researchdieren en netvlies gepigmenteerde epitheliale (RPE) cellen, is met succes ligt in gedifferentieerde van menselijke SER's en iPSCs4,5, 6. op basis van de SFEB (serumvrij cultuur van embryoid lichaam-achtige aggregaten) methode ontwikkeld door Eiraku et al. 13, zelf vorming van retinale organoids kan worden verkregen bij de ESC - of iPSC-afgeleide embryoid lichaam-achtige aggregaten in gedefinieerde extracellulaire matrix onderdelen7,10,14. Maar deze protocollen zijn ingewikkeld, vereisen van een groot aantal stappen niet altijd compatibel met de grote productie van cellen voor therapeutische benaderingen of drug screening. Dus, de keuze van de methode voor de productie van menselijke netvlies cellen is kritisch en de methode moet robuust, schaalbaar en efficiënt.
Hier beschrijven we elke stap is gebaseerd op onze eerdere publicatie15, voor een eenvoudige en efficiënte generatie netvlies cellen door retinale organoid zelf vorming van aanhangend menselijke iPSCs gekweekt in een feeder-gratis en xeno-gratis staat. Vanaf routine culturen van aanhangend menselijke iPSCs, vereist dit protocol slechts een eenvoudige opeenvolgende medium wijzigen zodat de generatie van zowel iPS-afgeleide RPE (hiRPE)-cellen en neuroretinal structuren in 4 weken. Na een handmatige isolatie, hiRPE kan worden uitgebreid en de retinale structuren kunnen worden gekweekt als zwevende organoids waar de retinale voorlopercellen zijn bekwaam om te onderscheiden in alle retinale celtypes in een volgorde die consistent is met de mens in vivo retinogenesis. Tot slot, voor onderzoek vooruitgang of klinische vertaling beschrijven we een cryopreservatie methode waardoor de langetermijnopslag van hele netvlies organoids en hiRPE cellen zonder hun fenotypische kenmerken en functionaliteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol beschreven in dit document volgt de richtsnoeren van het Institut de la Vision onderzoek ethisch comité. Het Institut de la Vision heeft de manipulatie van menselijk specimen volgens de huidige Franse verordening gekregen. Specimen behandeling volgt patiënt gegevensbescherming overeenkomstig de beginselen van Helsinki, en de nationale regelgevers na de ethische goedkeuring van het "Comité de bescherming des Personnes (CPP) Ile-de-France V".
1. bereiding van de voedingsbodems en de schotels
-
Voedingsbodems
- Gebruik iPSC medium, een chemisch welbepaalde medium gewijd aan pluripotente stamcel cultuur in feeder-vrij voorwaarden16. Het bereiden van 500 mL medium volgens protocol van de fabrikant.
- Gebruik basale iPSC (Bi) medium, de iPSC chemisch welbepaald medium zonder fibroblast groeifactor 2 (FGF2) of transformatie groeifactor Beta (TGFß).
- Bereiden van 500 mL van Bi medium aangevuld met 1% N2 supplement (BiN2 medium), 10 eenheden/mL penicilline, en 10 mg/mL streptomycine.
- Proneural N2 gebaseerde medium (ProN2 medium) samengesteld mengsel van DMEM:Nutrient F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-Glutamine), 1% MEM niet-essentiële aminozuren, 1% N2 supplement, 10 eenheden/mL penicilline, en 10 mg/mL streptomycine 500 mL voor te bereiden.
- Voorbereiden proneural B27 gebaseerde medium (ProB27 medium) bestaat uit een mengsel van DMEM:Nutrient F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-Glutamine), 1% MEM niet-essentiële aminozuren, 2% B27 aanvullen, 10 eenheden/mL penicilline en 10 mg/mL streptomycine.
-
Cultuur vaartuig voorbereiding
-
Voor menselijke iPSC cultuur
- 10 mL van de oplossing van een vitronectin met 5 μg/mL van vitronectin in 1 x PBS voor te bereiden. Voeg 100 µL van de stockoplossing ontdooide vitronectin (100 x) in 10 mL, 1 x PBS.
- Distribueren van 2 mL van de oplossing van de vitronectin per 6-cm cultuur schotel overeenkomt met 0,5 µg/cm2. Incubeer het gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT). Verwijder de vitronectin oplossing door met behulp van een vacuüm-aspiratie systeem of een 5 mL-pipet aspiratie.
- Voeg 4 mL van iPSC medium per 6-cm schotel.
- Incubeer de gerechten in een cel cultuur incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende ten minste 30 minuten vóór gebruik.
- Voor cultuur van menselijke cel voor iPSC afkomstige RPE (hiRPE)
- Gebruik een pluripotente stamcel-gekwalificeerde matrix of substraat jas wells volgens protocol van de fabrikant. Voeg voldoende matrix of substraat ter dekking van de oppervlakte van de gehele groei. Bijvoorbeeld, zet 300 µL van matrix per putje in 24-well plaat en 3 mL voor matrix in een maatkolf van T-25 cm2 .
- Incubeer de gecoate kweekvat voor een minimum van 1 uur bij 37 ° C. De matrix met vacuüm-aspiratie systemen of een 5 mL-pipet te verwijderen.
- Voeg 1 mL van ProN2 medium per putje op 24-Wells-platen en de cultuur schip terug naar de incubator voor een minimum van 30 min tot warm en equilibreer van het medium. Zie voor T-25 cm2 flacons, stap 5.2.
-
Voor menselijke iPSC cultuur
2. onderhoud en uitbreiding van de mens iPSCs
-
Onderhoud van menselijke iPSCs
- Bereiden van 3 mL voor iPSC medium in een tube van 15 mL en houden het op RT voor een minimum van 15 min vóór gebruik. Bereiden een gecoate 6-cm schotel zoals beschreven in punt 1.2.1.
- Een cryogene steekproef van menselijke iPSCs van een tank met vloeibare stikstof of een-150 ° C diepvriezer ontdooien door incubatie in een waterbad bij 37 ° C gedurende 30 s.
- Zorgvuldig Desinfecteer de cryogene flacon met behulp van een desinfecterende oplossing spray. Overdracht van de ontdooide menselijke iPSCs van de cryotube naar de tube van 15 mL met 3 mL van iPSC medium vooraf opgewarmd op RT.
- Centrifugeer de buis 110 x g gedurende 3 min. Verwijder het supernatant door met behulp van een vacuüm-aspiratie systeem of een 5 mL-pipet aspiratie.
- Resuspendeer de pellet cel met 1 mL van iPSC medium van een cultuur van 6 cm vitronectin beklede schotel met behulp van een precisiepipet 2 mL en de cellen ook terug overzetten naar de schotel. Terug de schotel naar de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende ten minste 24 uur voordat u wijzigt het medium.
Opmerking: Een ROCK-remmer, zoals Y-27632 op 10 µM, kan worden toegevoegd aan het iPSC medium in de 6-cm cultuur gerechten om apoptosis. - Het medium dagelijks veranderen en doorgeven van de menselijke iPSCs elke week.
-
Passaging van menselijke iPSCs
- De menselijke iPSC doorgeven aan een samenvloeiing van 70-80%, klassiek na 7 dagen in de cultuur.
- Bereidt gerechten, 6 cm voor de passaging zoals beschreven in stap 1.2.1. Verwijder het iPSC medium uit de gerechten met confluente iPSCs en voeg 2 mL van een oplossing van de dissociatie voor 6 min op RT.
Opmerking: De incubatietijd is afhankelijk van de iPSC-klonen. Probeer een incubatie 6 min als een begin. - Verwijder de dissociatie oplossing om met vacuüm-aspiratie systemen of een 5 mL-pipet en voeg 2 mL van iPSC medium vooraf opgewarmd op RT. resuspendeer de iPSC-kolonies door pipetteren hen op en neer 5-10 x met een 1.000 µL pipet.
Let op: Vermijd eencellige dissociatie van buitensporige pipetteren. - Overdracht van 30 tot 200 µL van de geresuspendeerde cel klontjes in een nieuwe cultuur van 6 cm schotel. De gerechten terugkomen met de cel cultuur incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende ten minste 24 uur voordat u wijzigt het medium.
Opmerking: Het volume van de geresuspendeerde cel bosjes die nodig zijn voor de passaging hangt de iPSC-klonen. - Het medium dagelijks veranderen en doorgeven van de menselijke iPSCs elke week.
3. productie van retinale Organoids
- Start de iPSC differentiatie volgens het protocol geschematiseerde in figuur 1A wanneer de kolonies een samenloop van 60-70% (figuur 1B bereiken).
- 4 mL Bi voedingsbodem per 6-cm schotel te bereiden. Warm de Bi middellange tot 37 ° C. Te wijzigen in het iPSC medium Bi normaal. Opmerking Dit keer als dag 0 (D0).
- Bij D2, schakelen de culturen in het Bi-medium naar een medium van de BiN2, eerder opgewarmd bij 37 ° C. Het medium elke 2-3 dagen wijzigen.
- Identificeren van opkomende zelf vorming retinale organoids door neuroepithelium toppen, zoals aangegeven in Figuur 1 c -1E.
Opmerking: Deze vroege retinale organoids, corresponderende hun ontwikkelingsstadium naar de optic cup, kunnen worden handmatig geïsoleerd voor downstream experimenten.
4. de rijping van de retinale Organoids
- Bereiden op D28, 6-Wells-platen met 4 mL/putje van ProB27 medium aanvankelijk aangevuld met 10 ng/mL FGF2 (figuur 1A).
Opmerking: Toevoegen FGF2 onmiddellijk voordat de media wordt toegevoegd aan de platen.
Let op: FGF2 niet filteren. - Handmatig herstellen van het netvlies structuren van de 6-cm schotels. Om dit te doen, isoleren van de structuren die loodrecht strepen maken met de naald rond de neuroepithelial-bud, zoals weergegeven in figuur 1Een loskoppelen van de organoids door krassen hen zachtjes met de naald.
- 10-15 organoids met behulp van een precisiepipet µL 1.000 gecombineerd en ze in een enkel putje van de plaat van de 6-well met ProB27 medium overdragen.
- Houd de retinale organoids zwevende kweekomstandigheden in ProB27 medium in een cel cultuur incubator bij 37 ° C en 5% CO2. De helft van het medium elke 2-3 dagen wijzigen.
Opmerking: Behandel de organoids met FGF2 tot de D35. - Bij D35, verwijder de helft van het medium en voeg verse voorverwarmde ProB27 medium bij 37 ° C zonder FGF2.
- De helft van het medium elke 2-3 dagen tijdens de benodigde tijd voor het verkrijgen van de gewenste retinale celtypes volgens de opkomst van retinale celtypen, zoals afgebeeld in Figuur 2te wijzigen.
5. generatie en versterking van de menselijke cellen van iPSC afkomstige RPE (hiRPE)
-
Generatie van menselijke hiRPE cellen
- Deelnemen aan de iPSCs differentiatie wanneer de kolonies een samenloop van 60-70% bereiken, volgens het protocol geschematiseerde in figuur 3A.
- Bereiden van 4 mL per 6-cm schotel van Bi medium en warm het Bi-medium bij 37 ° C. Te wijzigen in het iPSC medium Bi normaal. Opmerking Dit keer als dag 0 (D0).
- Bij D2, schakelen de culturen in het Bi-medium naar een medium van de BiN2 eerder opgewarmd bij 37 ° C. Het medium elke 2-3 dagen wijzigen.
- Bij D28, te wijzigen in het medium een verse ProN2 normaal eerder bij 37 ° C opgewarmd zoals afgebeeld in figuur 3A.
Opmerking: Deze stap kan worden gedaan na het plukken van de organoid beschreven in stap 4. - Het ProN2 medium elke 2-3 dagen wijzigen.
- Identificeren op D42, opkomende hiRPE cellen op door de observatie van gepigmenteerde patches, zoals weergegeven in figuur 3B.
Opmerking: De pigmentatie van de hiRPE cellen verschijnt tussen de D35 tot D56 afhankelijk van de iPSC-klonen.
-
Versterking van de hiRPE cellen
- Bereiden op D42, een 24-well plaat eerder bedekt met de matrix zoals beschreven in stap 1.2.2 en die 1 mL van ProN2 medium per putje. Plaats de plaat gedurende 15 minuten in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 vóór gebruik.
- De hiRPE patches van de 6-cm schotel handmatig herstellen. Isoleren van patches, maken een loodrecht strepen met de naald rond de gepigmenteerde epitheel en loskoppelen van het blad door het zachtjes te krabben met de naald. Gecombineerd 10 gepigmenteerde patches met behulp van een precisiepipet µL 1.000 en breng ze in een enkel putje van de plaat 24-well.
- Houd de hiRPE patches ProN2 medium in een cel cultuur incubator bij 37 ° C en 5% CO2 voor 48 uur voordat u wijzigt het medium. Opmerking Deze passage van de cel hiRPE 0 (hiRPEp0). Het medium elke 2-3 dagen met ProN2 medium wijzigen.
- De hiRPEp0 cellen doorgeven wanneer de cellen confluent.
- Verwijder het medium gebruik van vacuüm-aspiratie systemen en wassen van elke goed 1 x met 1 mL PBS met behulp van een precisiepipet 5 mL.
- Negeren van de PBS met behulp van vacuüm-aspiratie systemen, voeg 200 µL per putje van 0,25% trypsine en Incubeer het voor een minimum van 15 min in een incubator bij 37 ° C. Voeg 800 µL van ProB27 medium naar de inactivering van de trypsine.
Opmerking: Het gebruik van ProN2 medium om te stoppen met de trypsine-activiteit wordt niet aanbevolen. - Het blad van hiRPE cellen door het op en neer pipetteren distantiëren. Plaats de celsuspensie in een tube van 15 mL en het gedurende 5 min op 110 x g centrifugeren.
Opmerking: Een extra wassen kan worden gedaan met ProN2 medium te verwijderen van de overmaat van ProB27 medium. - Verwijder het supernatant en zachtjes resuspendeer de pellet cel in 2 mL zuiver ProN2 medium vooraf opgewarmd bij 37 ° C. De cellen met de teller van een cel tellen.
- Neem 1,25 miljoen cellen en plaats hen in een matrix-gecoate T-25 cm2 kolf (zie stap 2.2.2) vooraf met 5 mL van ProN2 medium opgewarmd bij 37 ° C. Opmerking Deze passage van de cel hiRPE als 1 (hiRPEp1).
- Houd de hiRPE cellen in het medium van de ProN2 in een cel cultuur incubator op 37 ° C en 5% CO2 voor 48 uur voordat u wijzigt het medium.
- De media elke 2-3 dagen wijzigen. Wanneer de hiRPEp1 cellen samenvloeiing bereiken, voeren de volgende passage of cryopreservatie.
6. cryopreservatie van retinale Organoids en hiRPE cellen
-
Voor hele netvlies organoids
- Selecteer retinale organoids 5 tot 20 met behulp van een pipet overdracht en plaats hen in een cryogene flesje. Verwijder alle overtollige medium met een pipet 1.000 µL zonder te raken de organoids aan de onderkant van de buis en voeg 250 µL van koude cryopreservatie medium (Zie Tabel van materialen).
- Het bevriezen van de flesjes in een isopropanol gebaseerde bevriezing container bij-80 ° C gedurende ten minste 4 h. overdracht de bevroren flesjes aan een-150 ° C vriezer of vloeibare stikstof tank voor opslag op lange termijn.
-
Voor hiRPE cellen
- Bij passage 1, door de hiRPE cellen te distantiëren wanneer de cellen confluent.
Opmerking: Een cryopreservatie van hiRPEp0 cellen wordt niet aanbevolen. - Het medium van de T-25 cm2 kolf met behulp van vacuüm-aspiratie systemen gecombineerd en wassen het 1 x met 3 mL PBS met behulp van een precisiepipet 5 mL.
- Verwijderen van de PBS met behulp van vacuüm-aspiratie systemen, voeg 1 mL van 0,25% trypsine en Incubeer het voor een minimum van 15 min in een incubator bij 37 ° C. Voeg 5 mL van ProB27 medium om te stoppen met de trypsine-activiteit.
Opmerking: Het gebruik van ProN2 medium naar de inactivering van trypsine wordt niet aanbevolen. - Het blad van hiRPE cellen door het op en neer met behulp van een precisiepipet 10 mL pipetteren distantiëren. De cellen met cel counter tellen. Plaats de celsuspensie in een tube van 15 mL en het gedurende 5 min op 110 x g centrifugeren.
Opmerking: Een extra wassen kan worden uitgevoerd met ProN2 medium te verwijderen van de overmaat van ProB27 medium. - De bovendrijvende vloeistof met behulp van vacuüm-aspiratie gecombineerd en zachtjes resuspendeer cellen te verkrijgen van 2 miljoen cellen in 250 µL van cryopreservatie medium.
- 250 µL celsuspensie per cryogene flacon overbrengen. Het bevriezen van de flesjes in een isopropanol gebaseerde bevriezing container bij-80 ° C gedurende ten minste 4 uur.
- De bevroren flesjes overbrengen in een vriezer-150 ° C of een vloeibare stikstof tank voor opslag op lange termijn.
- Bij passage 1, door de hiRPE cellen te distantiëren wanneer de cellen confluent.
7. ontdooien van retinale Organoids en hiRPE cellen
-
Ontdooien van hele netvlies organoids
- Warme ProB27 medium bij 37 ° C (2 mL zal worden vereist voor elke cryogene vial).
- Uit de vloeibare stikstof tank of-150 ° C vriezer, ontdooi een cryogene flacon met retinal organoids in een waterbad bij 37 ° C voor 30 s. ontsmetten de cryogene flacon zorgvuldig met een desinfecterende oplossing spray.
- Openen van het flesje en voeg 1 mL van voorverwarmde ProB27 medium. De organoids overbrengen in een 1,5 mL-buis met een pipet overdracht.
- Verwijder het medium zachtjes door het pipetteren zonder het aanraken van de retinale structuren aan de onderkant van de buis. Wassen van de organoids 1 meer tijd met 1 mL van het voorverwarmde ProB27 medium.
- De organoids met een overdracht Pipetteer gecombineerd en plaats ze in 1 goed van een 6-well plaat met ProB27 medium vooraf opgewarmd en geëquilibreerd in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
Opmerking: Plaats de retinale organoids 10-15 per putje van de plaat van een 6-well. - De helft van het medium elke 2-3 dagen tijdens de benodigde tijd voor het verkrijgen van de gewenste retinale celtypes volgens hun opkomst, zoals beschreven in Figuur 2te wijzigen.
-
Ontdooien van hiRPE cellen
- Warme ProN2 medium bij 37 ° C (8 mL zal worden vereist voor elke cryogene vial).
- Uit de vloeibare stikstof tank of-150 ° C vriezer, ontdooi eenmonstervan cryogene hiRPEp1 cellen door een incubatie in een waterbad bij 37 ° C voor 30 s. ontsmetten de cryogene flacon zorgvuldig gebruik van desinfecterende oplossing spray.
- Open de tube en voeg vervolgens 1 mL van voorverwarmde ProN2 medium en de celsuspensie overbrengen in een tube van 15 mL met 2 mL van voorverwarmde ProN2 medium. Het gedurende 5 min op 110 x g centrifugeren.
- Verwijder het supernatant en zachtjes resuspendeer de pellet cel in 2 mL zuiver ProN2 medium vooraf opgewarmd bij 37 ° C.
- De cellen met de teller van een cel tellen.
- Neem 1,25 miljoen cellen en plaats hen in de matrix beklede T-25 cm2 kolf (zie stap 2.2.2) vooraf met 5 mL van ProN2 medium opgewarmd bij 37 ° C. Opmerking in dit stadium, de passage als 2 (hiRPEp2).
- Houd de hiRPEp2 cellen in ProN2 medium in de cel cultuur incubator op 37 ° C en 5% CO2 voor 48 uur voordat u wijzigt het medium.
- De media elke 2-3 dagen wijzigen. Wanneer de hiRPE cellen samenvloeiing bereiken, voeren de volgende passage of cryopreservatie.
Opmerking: Na 2 weken in cultuur, 8-10 miljoen hiRPE cellen kunnen worden verzameld voor verdere experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De eerste stap voor menselijke iPSC differentiatie in feeder-vrij voorwaarden16 verbouwd is zelf-vernieuwing machines met behulp van Bi middellange ter bevordering van een spontane differentiatie (figuur 1A) afsluiten. Vervolgens op D2, het Bi-medium wordt aangevuld met een supplement van de N2 om te differentiëren iPSCs cellen naar het neurale en netvlies lineages begeleiden. Dit proces leidt tot de verschijning van neuroretinal toppen op rond D28 (Figuur 1 c - 1E). Zelf vorming neuroretinal structuren kunnen worden afgezonderd met behulp van een naald, zoals geïllustreerd in figuur 1E en overgedragen aan cultuur platen dat de rijping van de retinale organoids in zwevende kweekomstandigheden via ProB27 (figuur 1F). Gunste van de groei en ontwikkeling van het neurale netvlies, wordt FGF2 toegevoegd aan het medium voor 1 week (figuur 1A).
D28 bevatten de opkomende retinale structuren voornamelijk retinale voorlopercellen die mede het uitdrukken van de belangrijkste transcriptiefactor als PAX6, RAX en VSX215. Deze progenitoren geven aanleiding tot de zeven belangrijke klassen van retinale celtypes in kweekomstandigheden drijvend in een evolutionair geconserveerde geboorte order verenigbaar zijn met menselijke netvlies ontwikkeling. Op basis van qRT-PCR en immunohistochemistry eerder beschreven in Reichman et al. 15, de brede curven in Figuur 2 Toon golven van begin - en eind-geboren retinale cel generaties tijdens een rijping in vitro . Dus, de tijd van de cultuur definieert de aanwezig in de organoids celtypes.
Het isolement van hiRPE cellen voor verdere versterking kan worden alleen uitgevoerd wanneer pigmentatie waarneembaar, is omdat de kleur van deze cel hun visualisatie toestaat. Op deze manier is het ProN2 medium gebruikt vanaf D28 tot D42 om de gunst van de pigmentatie van RPE cellen15.
Afhankelijk van de kloon van menselijke iPSC, kunnen de gepigmenteerde patches worden gedetecteerd, vóór of na de eigen vorming van retinale structuren; maar meestal 1 of 2 weken na het gebruik van ProN2 medium op D28 (figuur 3A, B). Een representatieve helder veld beeld van cellen van de hiRPE uitgebreid van de geïsoleerde patches bij passage 0 wordt weergegeven in Figuur 3 c en 3D. De hiRPE cellen kunnen vervolgens worden uitgebreid tot de passage 4, behouden hun RPE fenotype zonder een epitheliale-mesenchymale overgang (EMT). Niettemin, EMT kan worden voorkomen door het gebruik van ROCK-remmers zoals Y-27632, waardoor ook een stijging van de cel nummer passages17. Op lange termijn van de culturen van hiRPE cellen na het ontdooien kunnen gemakkelijk worden uitgevoerd in de voorwaarden beschreven hier om het verkrijgen van een volwassen en functionele epitheel15. Een voorbeeld van volwassen hiRPEp2 cellen in week 52 met een klassieke cuboidal geplaveide morfologie wordt geïllustreerd in figuur 3E.
Figuur 1: generatie en rijping van retinale organoids van aanhangend menselijke iPSCs. (A) differentiatie protocol waardoor de generatie van retinale organoids. (B) menselijke iPSCs op D0. (C) opkomende neuroretinal epitheel in D15. (D) zelf forming neurale netvlies-achtige structuren op D22. (E) hier, de neuroretinal knop is geïsoleerd met behulp van een naald. (F) representatieve beelden van retinale organoids in drijvende cultuur voorwaarde op D35. Schaal bars = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: golven van menselijke iPSC afkomstige retinal cel generatie. Afkortingen: Retinal voorlopercellen (RPC's), retinale ganglion cellen (RGCs) horizontale cellen (Ho), amacrine cellen (Am), Müller gliale cellen (MGCs), bipolaire cellen (Bp) en researchdieren (PR). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: generatie en versterking van de menselijke iPSC afkomstige RPE. (A) een illustratie van het differentiatie-protocol waardoor de generatie van menselijke hiRPE cellen. (B) fase-contrast beelden weergegeven: gepigmenteerde patches uit het differentiëren van aanhangend menselijke iPSCs op Week 6 (W6). (C) hiRPEp0 cellen gekweekt één week (W1) na de gepigmenteerde patch plukken. (D) hiRPEp0 cellen in week 6 (W6) na de gepigmenteerde patch plukken. (E) A representatief beeld van hiRPEp2 cellen na het ontdooien, gekweekt voor 52 weken (W52) in ProN2 medium. Schaal bars = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol wordt beschreven hoe RPE cellen en netvlies organoids, met retinale RGCs en researchdieren, van menselijke pluripotente stamcellen in xeno-vrij en feeder-vrij voorwaarden te produceren. Compatibel met het proces van Good Manufacturing Practice (GMP), de methode geteeld hier gepresenteerd staat een grote productie van iPSC-afgeleide netvlies cellen als RPE cellen, RGCs en researchdieren voor de ontwikkeling van stamcel gebaseerde therapieën en drug ontdekking benaderingen voor de toekomstige behandeling van retinale degeneratieve ziekten. Cryopreservatie van hele netvlies organoids of hiRPE cellen biedt ook een groot voordeel bij het vaststellen van tussenliggende celbanken, een belangrijke stap voor toekomstig gebruik in stamcel gebaseerde therapieën.
De productie van grote voorraden van specifieke retinale celtypes in een specifieke fase van differentiatie zal vereist zijn voor toekomstige klinische vertaling. In dit verband de generatie in drie maanden van de CD73-positieve fotoreceptor precursoren beschreven als een transplantatie-compatibele cel bevolking18, en de mogelijkheid voor het genereren van deze onrijpe researchdieren van bevriezing-ontdooid retinale organoids15 versterken de hoop te gebruiken deze cellen voor therapeutische doeleinden. Met betrekking tot de retinale pigment epitheel kan de mogelijkheid van hiRPE cellen vermenigvuldigen in vitro grote cel producties bank hen. Bovenal behouden ontdooide menselijke iPSC-afgeleide RPE cellen hun RPE fenotype en functie, dus als trofische factor secretie of fotoreceptor buitenste segment fagocytose15, valideren hun gebruiksgemak voor het screenen van strategieën zo goed als voor toekomstige therapeutische benaderingen.
Er zijn een verscheidenheid van protocollen voor de generatie van iPSC afkomstige retinale organoids7,8,9,10,11,12,15 die variëren in cultuur methoden (embryoid lichaam-achtige aggregaten vs. Adherente cellen) alsmede efficiëntie en robuustheid. De hier beschreven methode begint vanaf aanhangend menselijke iPSCs en toont een reproduceerbare werkzaamheid, het aanpassingsvermogen en de toepasbaarheid op een breed scala van menselijke iPSC lijnen15. Dit proces, gebaseerd op de opeenvolgende verandering van serum-vrije media, recapituleert de belangrijkste stappen van retinale ontwikkeling door te profiteren van de intrinsieke signalen van het systeem bij de differentiatie. Een belangrijk voordeel van dit protocol is het ontbreken van embryonale lichaam vorming en de toevoeging van matrix voor toekomstige GMP-conforme retinale cel productie van protocollen voor de productie van cel therapie derivaten. Op deze manier geen verschil in de efficiëntie van de retinale organoid generatie en rijping werden gevonden tussen XENOGENECELLEN en neen-XENOGENECELLEN kweekomstandigheden gebruik van cel therapie System (CTS) supplementen of niet, geformuleerd uitsluitend met recombinant of gehumaniseerd onderdelen.
Het succes van de retinale differentiatie methode hangt grotendeels af van de kwaliteit van de menselijke iPSC culturen. De herprogrammering methode heeft geen invloed op de efficiëntie van de differentiatie van de iPSCs van de menselijke netvlies cellen8, maar hun stemness status moeten optimaal. Kort, routinematig gekweekte menselijke iPSCs moet niet geen symptomen vertonen van differentiatie. De koloniën niet moeten overlappen en hun karakteristieke circulaire morfologie moeten weergeven. Hoewel de efficiëntie van de retinale differentiatie afhankelijk van de kloon is, kan een minimum van twee retinale structuren per cm2 worden geplukt op D28, overeenkomend met 50-60 neuroretinal structuren voor een 6-cm schotel. Voor de rijping van de retinale organoid in zwevende kweekomstandigheden vermijdt beperking van het aantal structuren per putje structuur fusion en middellange overconsumptie. In deze kweekomstandigheden, kan retinale organoids worden herkauwend voor een uitgebreide tijd, nodig om te halen laat retinale celtypes.
Vooruitblikkend, vormen retinale organoids gegenereerd in vitro door deze methode krachtige hulpmiddelen voor model retinale ziekten. Patiënt-specifieke iPSC afkomstige retinale cel modellen zal worden gebruikt om complexe of genetische ziekten beter te begrijpen door de verkenning van hun moleculaire en cellulaire mechanismen. Deze modellen zullen met name geschikt voor drugontdekking door middel van high-throughput screening, cel- en gen-therapieën of genoom benaderingen, het ontwikkelen van innovatieve behandelingen voor retinale dystrophie bewerken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sacha Reichman, Olivier Goureau, en José-Alain Sahel zijn uitvinders op in afwachting van de octrooien met betrekking tot de generatie van netvlies cellen van menselijke pluripotente stamcellen.
Acknowledgments
De auteurs bedank de leden van de Goureau team voor hun inbreng tijdens de opbouw van de hier beschreven methoden en G. Gagliardi, M. Garita voor hun kritische lezing. Dit werk werd gesteund door subsidies van de ANR (GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), de vereniging Retina Frankrijk en de technologieoverdracht bedrijf SATT Lutech. Het werd ook uitgevoerd in het kader van de LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65) ondersteund door de ANR binnen het Investissements d'Avenir programma (ANR-11-IDEX-0004-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A14700 | Coating |
| CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A27940 | Coating |
| Essential 8 Medium | ThermoFisher Scientific | A1517001 | medium |
| Essential 6 Medium | ThermoFisher Scientific | A1516401 | medium |
| CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | A1370701 | supplement CTS |
| N-2 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | supplement |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | supplement |
| CTS B-27 Supplement, XenoFree | ThermoFisher Scientific | A1486701 | supplement CTS |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | supplement |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | antibiotic |
| CellStart CTS | ThermoFisher Scientific | A1014201 | Matrix CTS |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFisher Scientific | A1569601 | Matrix |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | dissociation solution |
| Cryostem Freezing Media | clinisciences | 05-710-1D | Cryopreservation medium |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Preprotech | 100-18B | FGF2 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free | Preprotech | AF-100-18B | FGF2 Xeno free |
| AGANI needle 23G | Terumo | AN*2332R1 | Needle |
| Flask 25 cm² Tissue Culture Treated | Falcon | 353109 | T-25 cm² |
| 24 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3526 | 24-well plate |
| 6 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3516 | 6-well plate |
References
- Zhao, C., Wang, Q., Temple, S. Stem cell therapies for retinal diseases: recapitulating development to replace degenerated cells. Development. 144, 1368-1381 (2017).
- Dalkara, D., Goureau, O., Marazova, K., Sahel, J. -A. Let There Be Light: Gene and Cell Therapy for Blindness. Human Gene Therapy. 27, 134-147 (2016).
- Wright, L. S., Phillips, M. J., Pinilla, I., Hei, D., Gamm, D. M. Induced pluripotent stem cells as custom therapeutics for retinal repair: Progress and rationale. Experimental Eye Research. 123, 161-172 (2014).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients with Ocular Disease. Stem Cells. 33, 2363-2373 (2015).
- Gill, K. P., Hewitt, A. W., Davidson, K. C., Pébay, A., Wong, R. C. B. Methods of Retinal Ganglion Cell Differentiation From Pluripotent Stem Cells. Translational Vision Science and Technology. 3, 2 (2014).
- Giacalone, J. C., Wiley, L. A., et al. Concise review: Patient-specific stem cells to interrogate inherited eye disease. STEM CELLS Translational Medicine. 5, 132-140 (2016).
- Nakano, T., Ando, S., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Reichman, S., Terray, A., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 8518-8523 (2014).
- Meyer, J. S., Howden, S. E., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29, 1206-1218 (2011).
- Zhong, X., Gutierrez, C., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
- Mellough, C. B., Collin, J., et al. IGF-1 Signalling plays an important role in the formation of three dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33, 2416-2430 (2015).
- Gonzalez-Cordero, A., Kruczek, K., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9, 820-837 (2017).
- Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16698-16703 (2009).
- Reichman, S., Slembrouck, A., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).
- Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
- Croze, R. H., Buchholz, D. E., et al. ROCK inhibition extends passage of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium. Stem Cells Translational Medicine. 3, 1066-1078 (2014).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, 6462-6471 (2011).
