Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Definerede Xeno-fri og Feeder-fri kultur betingelser for den Generation af menneskelige iPSC-afledte Retinal Cell modeller

Published: September 6, 2018 doi: 10.3791/57795
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Institut de la Vision, Sorbonne Université, INSERM, CNRS, F-75012 Paris, France
* These authors contributed equally

Summary

Produktionen af specialiserede retinale celler fra pluripotente stamceller er et vendepunkt i udviklingen af stamcelle-baseret terapi for retinal sygdomme. Den nuværende papir beskriver en simpel metode til en effektiv generation af retinale organoids og retinal pigmenteret epitel til grundlæggende, translationel og klinisk forskning.

Abstract

Produktionen af specialiserede celler fra pluripotente stamceller giver et kraftfuldt værktøj til at udvikle nye tilgange til regenerativ medicin. Brug af human-induceret pluripotente stamceller (iPSCs) er særligt attraktive for neurodegenerativ sygdom undersøgelser, herunder retinal dystrophies, hvor iPSC-afledte retinal cell modeller markerer et stort skridt fremad til at forstå og bekæmpe blindhed. I dette papir beskriver vi en enkel og skalerbar protokol for at generere, modne og cryopreserve retinale organoids. Baseret på mellemlang skiftende, den største fordel ved denne metode er at undgå flere og tidskrævende trin kræves almindeligvis i en guidet differentiering af iPSCs. Efterligne de tidlige faser af retinal udvikling af successive ændringer af definerede medier på vedhængende menneskelige iPSC kulturer, denne protokol giver mulighed for den samtidige generation af selvstændige danner neuroretinal strukturer og retinal pigmenteret epitel (ÅV) celler i en reproducerbare og effektiv måde i 4 uger. Disse strukturer, som indeholder retinal stamceller (fjernprocedurekald (RPC)) kan være let isoleret til yderligere modning i et flydende kultur tilstand gør det muligt for differentiering af fjernprocedurekald (RPC) til de syv retinal celletyper i den voksne menneskelige nethinde. Derudover beskriver vi hurtig metoder for kryopræservering af retinale organoids og ÅV celler til langtidsopbevaring. Kombineret sammen, vil de metoder, der beskrives her være nyttigt at producere og bank iPSC-afledte retinale celler eller væv til både grundforskning og klinisk forskning.

Introduction

Nethinden er en integreret del af det centrale nervesystem (CNS) og har en begrænset kapacitet til at regenerere spontant efter en traumatisk skade eller sygdomme. Derfor, degenerative sygdomme forårsager endelige retinal celletab, såsom aldersrelateret Macula degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP), glaukom og diabetisk retinopati, typisk føre til uoprettelige blindhed. Redning degenererede nethinden er en stor udfordring som stamcelle-baserede behandlinger har til formål at erstatte de beskadigede eller mistede celler er en af de mest lovende metoder1,2,3. Pluripotente stamceller som humane embryonale stamceller (økonomiske) celler eller menneskelige-induceret pluripotente stamceller (iPSCs) har kapacitet til at blive udvidet på ubestemt tid i kulturen, og de har potentiale til at producere alle celletyper. Fremskridt i vores forståelse af retinal udvikling og forbedring af in vitro- protokoller for menneskelige iPSC differentiering har resulteret i generation af retinale organoids7,8,9, 10,11,12. Alle de store retinale celler, herunder retinal ganglion celler (RGCs), fotoreceptorer, og retinal pigmenteret (ÅV) epitelceller, har med succes blevet differentieret fra menneskelige og sociale råd og iPSCs4,5, 6. baseret på SFEB (serum-fri kultur af embryoid krop-lignende aggregater) metode udviklet af Eiraku et al. 13, selvstændig dannelsen af retinale organoids kan fås fra ESC - eller iPSC-afledte embryoid krop-lignende aggregater i definerede ekstracellulære matrix komponenter7,10,14. Men disse protokollerne er indviklede, der kræver et stort antal trin ikke altid kompatible med den store produktion af celler til terapeutiske tilgange eller stof screening. Således, at valget af metoden til at producere menneskelige retinale celler er kritisk og metoden skal være robust, skalerbar og effektiv.

Her, beskriver baseret på vores tidligere publikation15, vi hvert trin i en enkel og effektiv generation af retinale celler via retinale organoid selvstændig dannelse fra vedhængende menneskelige iPSCs dyrkes i et feeder-fri og xeno tilstand. Startende fra rutinemæssige kulturer af vedhængende menneskelige iPSCs, kræver denne protokol kun en simpel successive medium forandring for at tillade generation af både iPS-afledte ÅV (hiRPE) celler og neuroretinal strukturer i 4 uger. Efter en manuel isolering, hiRPE kan udvides og de retinale strukturer kan blive kulturperler som flydende organoids hvor de retinale stamceller er i stand til at differentiere i alle retinal celletyper i sekventiel rækkefølge i overensstemmelse med i vivo menneskelige retinogenesis. Endelig, for forskning avancement eller kliniske oversættelse, vi beskriver en kryopræservering metode tillader langtidsopbevaring af hele retinale organoids og hiRPE celler uden at det påvirker deres fænotypiske egenskaber og funktionalitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den protokol, der er beskrevet i denne hvidbog følger retningslinjerne i Institut de la Vision videnskabsetisk Komité. Institut de la Vision har været tilladt manipulering af menneskelige modellen ifølge den nuværende franske forordning. Præparatbehandling følger patienten databeskyttelse i overensstemmelse med grundprincipperne i Helsinki, og nationale bestemmelser efter den etiske godkendelse af "Comité de Protection des Personnes (CPP) Ile-de-France V".

1. forberedelse af dyrkningsmedier og retter

  1. Kultur medier
    1. Brug iPSC medium, et kemisk defineret medium dedikeret til pluripotente stamceller kultur i feeder-fri betingelser16. Forberede 500 mL medium efter producentens protokol.
    2. Brug Basal iPSC (Bi) medium, iPSC kemisk definerede medium uden fibroblast vækstfaktor 2 (FGF2) eller omdanne vækst faktor Beta (TGFß).
    3. Forberede 500 mL Bi medium suppleret med 1% N2 supplement (BiN2 medium), 10 enheder/mL af penicillin og 10 mg/mL af streptomycin.
    4. Forberede 500 mL af proneural N2-baserede medium (ProN2 medium) sammensat af DMEM:Nutrient blanding F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-glutamin), 1% MEM uvæsentlige aminosyrer, 1% N2 supplement, 10 enheder/mL af penicillin og 10 mg/mL af streptomycin.
    5. Forberede proneural B27-baserede medium (ProB27 medium) sammensat af DMEM:Nutrient blanding F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-glutamin), 1% MEM uvæsentlige aminosyrer, 2% B27 supplement, 10 enheder/mL af penicillin og 10 mg/mL af streptomycin.
  2. Kultur fartøj forberedelse
    1. For menneskelige iPSC kultur
      1. Forberede 10 mL af en vitronectin løsning indeholdende 5 μg/mL af vitronectin i 1 x PBS. I 10 mL 1 x PBS, Tilsæt 100 µL af de optøede vitronectin stamopløsning (100 x).
      2. Distribuere 2 mL af vitronectin pr. 6-cm kultur fad svarende til 0,5 µg/cm2. Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur (RT). Fjerne vitronectin løsningen ved aspiration ved hjælp af et vakuum aspiration system eller 5 mL pipette.
      3. Der tilsættes 4 mL af iPSC medium pr. 6-cm parabol.
      4. Inkuber retter i en celle kultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i mindst 30 minutter før brug.
    2. For menneskelige iPSC-afledte ÅV (hiRPE) cellekultur
    3. Bruge en pluripotente stamceller-kvalificeret matrix eller substrat til pels brønde efter producentens protokol. Tilføje tilstrækkelig matrix eller substrat til at dække hele vækst areal. For eksempel sætte 300 µL af matrix pr. brønd i 24-godt plade og 3 mL af matrix i en T-25 cm2 kolbe.
    4. Inkuber belagt kultur fartøjer i mindst 1 time ved 37 ° C. Fjerne matrixen ved hjælp af vakuum aspiration systemer eller 5 mL pipette.
    5. Der tilsættes 1 mL af ProN2 medium pr. brønd på 24-godt plader og returnere kultur fartøj til inkubator i mindst 30 min at varme og reagensglasset medium. T-25 cm2 kolber, under trin 5.2.

2. vedligeholdelse og udvidelse af menneskelige iPSCs

  1. Vedligeholdelse af menneskelige iPSCs
    1. Forbered 3 mL af iPSC medium i en 15 mL tube og holde det på RT for et minimum af 15 min før brug. Forberede en coated 6-cm parabol, som beskrevet i punkt 1.2.1.
    2. Tø en kryogene udsnit af menneskelige iPSCs fra en flydende kvælstof tank eller et-150 ° C fryser ved inkubering i et vandbad ved 37 ° C i 30 s.
    3. Omhyggeligt desinficere kryogene hætteglasset ved hjælp af en desinficerende løsning spray. Overføre den optøede menneskelige iPSCs fra cryotube til 15 mL tube indeholder 3 mL af iPSC medium pre varmet på RT.
    4. Centrifuge tube på 110 x g i 3 min. Fjern supernatanten ved aspiration ved hjælp af et vakuum aspiration system eller 5 mL pipette.
    5. Resuspenderes celle med 1 mL af iPSC medium fra et vitronectin-belagte 6-cm kultur parabol bruger en 2 mL pipette og overføre cellerne tilbage til fadet. Returnere skålen til inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i mindst 24 timer før du ændrer mediet.
      Bemærk: En ROCK-hæmmer, som Y-27632 på 10 µM, kan tilføjes til iPSC medium i 6-cm kultur retter at reducere apoptose.
    6. Ændre medium dagligt og videregive den menneskelige iPSCs hver uge.
  2. Passaging af menneskelige iPSCs
    1. Passere den menneskelige iPSC på en 70-80% confluence, klassisk efter 7 dage i kultur.
    2. Forbered 6-cm retter for passaging som beskrevet i trin 1.2.1. Fjern iPSC medium fra retter med sammenflydende iPSCs og tilsættes 2 mL af en dissociation løsning for 6 min på RT.
      Bemærk: Inkubationstiden afhænger iPSC kloner. Prøv en 6 min inkubation som en start.
    3. Fjerne dissociation løsning ved hjælp af vakuum aspiration systemer eller 5 mL pipette og Tilføj 2 mL af iPSC medium pre varmede på RT. Resuspend iPSC kolonier af pipettering dem op og ned 5-10 x med en 1.000 µL pipette.
      Forsigtig: Undgå enkelt celle dissociation fra overdreven pipettering.
    4. Overføre 30 til 200 µL af resuspenderede celle klumper i en ny 6-cm kultur parabol. Returnere retterne til celle kultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i mindst 24 timer før du ændrer mediet.
      Bemærk: Lydstyrken af resuspenderede celle klumper behov for den passaging afhænger af iPSC klonerne.
    5. Ændre medium dagligt og videregive den menneskelige iPSCs hver uge.

3. generation af retinale Organoids

  1. Start iPSC differentiering efter protokollen skematiserede i figur 1A når kolonierne nå en 60-70% sammenløbet (figur 1B).
  2. Forbered 4 mL Bi medium pr. 6-cm parabol. Varm Bi medium til 37 ° C. Ændre iPSC medium til medium, Bi. Bemærk denne gang som dag 0 (D0).
  3. På D2, skifte kulturer i Bi medium til et BiN2 medie, tidligere varmede ved 37 ° C. Ændre medium hver 2-3 dage.
  4. Identificere emergente selv danner retinale organoids af neuroepithelium knopper, som vist i figur 1 c -1E.
    Bemærk: Disse tidlige retinal organoids, svarer i deres udviklingsstadiet til optik cup, kan være manuelt isoleret for downstream eksperimenter.

4. modning af retinale Organoids

  1. På D28, forberede 6-godt plader der indeholder 4 mL/brønd af ProB27 medium oprindeligt suppleret med 10 ng/mL af FGF2 (figur 1A).
    Bemærk: Tilføje FGF2 umiddelbart før medierne er føjet til pladerne.
    Forsigtig: Filtrér ikke FGF2.
  2. Genskab de retinale strukturer fra 6-cm retter manuelt. For at gøre dette, isolere strukturer gør vinkelrette riller med nål omkring neuroepithelial bud, som vist i figur 1E, og frigør organoids ved forsigtigt skrabe dem med nålen.
  3. Opsug 10-15 organoids ved hjælp af en 1.000 µL pipette og overføre dem i et enkelt godt af 6-godt pladen indeholdende ProB27 medium.
  4. Holde den retinale organoids i flydende dyrkningsbetingelser i ProB27 medium i en celle kultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Ændre halvdelen af medium hver 2-3 dage.
    Bemærk: Behandle organoids med FGF2 indtil D35.
  5. På D35, fjerne halvdelen af substratet og tilføje frisk forvarmet ProB27 medium ved 37 ° C uden FGF2.
  6. Ændre halvdelen af medium hver 2-3 dage i løbet af den tid, der kræves for at opnå de ønskede retinal celletyper efter fremkomsten af retinale celletyper, som afbilledet i figur 2.

5. generation og forstærkning af menneskets iPSC-afledte ÅV (hiRPE) celler

  1. Generation af humane hiRPE celler
    1. Engagere sig i iPSCs i differentiering, da kolonierne nå en 60-70% sammenløb, efter protokollen skematiserede i figur 3A.
    2. Forbered 4 mL pr. 6-cm parabol af Bi medium og varm Bi medium ved 37 ° C. Ændre iPSC medium til medium, Bi. Bemærk denne gang som dag 0 (D0).
    3. På D2, skifte kulturer i Bi medium til et BiN2 medie tidligere varmede ved 37 ° C. Ændre medium hver 2-3 dage.
    4. På D28, ændre mediet til en frisk ProN2 mellem tidligere varmede ved 37 ° C, som afbilledet i figur 3A.
      Bemærk: Dette trin kan ske efter organoid pluk beskrevet i trin 4.
    5. Ændre ProN2 medium hver 2-3 dage.
    6. På D42, skal du identificere emergent hiRPE celler ved observation af pigmenterede pletter, som vist på figur 3B.
      Bemærk: Pigmentering af hiRPE celler vises mellem D35 til D56 afhængigt af iPSC klonerne.
  2. Forstærkning af hiRPE celler
    1. Ved D42, udarbejde en 24-godt plade tidligere belagt med matrix som beskrevet i trin 1.2.2 og indeholder 1 mL af ProN2 medium pr. brønd. Placere plade i 15 min. i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO2 før brug.
    2. Gendanne hiRPE patches fra 6-cm parabol manuelt. At isolere patches, gøre en vinkelret striation med nål omkring den pigmenterede epitel og frigør arket ved forsigtigt skrabe det med nålen. Opsug 10 pigmenterede pletter ved hjælp af en 1.000 µL pipette og overføre dem i et enkelt godt af 24-godt plade.
    3. Hold hiRPE pletter i ProN2 medium i en celle kultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 for 48 h før du ændrer mediet. Bemærk denne hiRPE celle passage som 0 (hiRPEp0). Ændre medium hver 2-3 dage med ProN2 medium.
    4. Pass hiRPEp0 celler, når cellerne er sammenflydende.
      1. Fjern mediet ved hjælp af vakuum aspiration systemer og vaske hver godt 1 x med 1 mL PBS ved hjælp af 5 mL pipette.
      2. Kassér PBS ved hjælp af vakuum aspiration systemer, tilføje 200 µL pr. brønd af 0,25% trypsin og Inkuber i et minimum af 15 min i en inkubator ved 37 ° C. Tilføje 800 µL af ProB27 medium til at inaktivere trypsin.
        Bemærk: Brug af ProN2 medium at stoppe trypsin aktivitet anbefales ikke.
      3. Adskille ark af hiRPE celler af pipettering det op og ned. Placer cellesuspension i en 15 mL tube og centrifugeres i 5 min. ved 110 x g.
        Bemærk: En ekstra vask kan gøres med ProN2 medium til at fjerne overskydende ProB27 medium.
      4. Fjern supernatanten og forsigtigt resuspenderes celle i 2 mL af ProN2 medium pre varmes ved 37 ° C. Tælle celler med en celle counter.
      5. Tage 1,25 millioner celler og placere dem i en matrix-belagt T-25 cm2 kolbe (Se trin 2.2.2) der indeholder 5 mL af ProN2 medium pre varmes ved 37 ° C. Bemærk denne hiRPE celle passage som 1 (hiRPEp1).
    5. Holde hiRPE cellerne i ProN2 medium i en celle kultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 for 48 h før du ændrer mediet.
    6. Ændre medierne hver 2-3 dage. Når hiRPEp1 cellerne når sammenløb, udføre den næste passage eller kryopræservering.

6. kryopræservering af Retinal Organoids og hiRPE celler

  1. For hele retinale organoids
    1. Vælg 5 til 20 retinale organoids ved hjælp af en overførsel pipette og placere dem i en kryogene hætteglas. Fjern eventuelle overskydende medium med 1.000 µL pipette uden at røre ved organoids i bunden af røret og tilsæt 250 µL koldt kryopræservering medium (Se Tabel af materialer).
    2. Fryse hætteglas i en isopropanol-baserede indefrysning beholder ved-80 ° C i mindst 4 h. overførsel af frosne hætteglas til en-150 ° C fryser eller flydende kvælstof tank til langtidsopbevaring.
  2. Til hiRPE celler
    1. På passage 1, adskille hiRPE cellerne når cellerne er sammenflydende.
      Bemærk: En kryopræservering af celler, hiRPEp0 anbefales ikke.
    2. Opsug medium fra T-25 cm2 kolben ved hjælp af vakuum aspiration systemer og vaske det 1 x med 3 mL PBS ved hjælp af 5 mL pipette.
    3. Fjerne PBS ved hjælp af vakuum aspiration systemer, tilsættes 1 mL 0,25% trypsin og Inkuber i et minimum af 15 min i en inkubator ved 37 ° C. Der tilsættes 5 mL af ProB27 medium at stoppe trypsin aktivitet.
      Bemærk: Brug af ProN2 medium til at inaktivere trypsin anbefales ikke.
    4. Adskille ark af hiRPE celler af pipettering det op og ned ved hjælp af 10 mL pipette. Tælle celler med celle counter. Placer cellesuspension i en 15 mL tube og centrifugeres i 5 min. ved 110 x g.
      Bemærk: En ekstra vask kan udføres med ProN2 medium til at fjerne overskydende ProB27 medium.
    5. Opsug supernatanten ved hjælp af vakuum aspiration og forsigtigt resuspend celler for at få 2 millioner celler i 250 µL af kryopræservering medium.
    6. Overføre 250 µL af cellesuspension pr. kryogene hætteglas. Fryse hætteglas i en isopropanol funderet frysende beholder ved-80 ° C i mindst 4 h.
    7. Overføre de frosne hætteglas til en-150 ° C fryser eller en flydende kvælstof tank til langtidsopbevaring.

7. optøning af Retinal Organoids og hiRPE celler

  1. Optøning af hele retinale organoids
    1. Varm ProB27 medium ved 37 ° C (2 mL vil blive krævet for hvert kryogene hætteglas).
    2. Fra den flydende kvælstof tank eller-150 ° C fryser, tø en kryogene hætteglas indeholdende retinale organoids i et vandbad ved 37 ° C til 30 s. Desinficer kryogene hætteglasset omhyggeligt ved hjælp af en desinficerende løsning spray.
    3. Åbn hætteglasset og tilsættes 1 mL af pre varmede ProB27 medium. Overførsel af organoids til en 1,5 mL rør med pipette en overførsel.
    4. Fjern mediet forsigtigt af pipettering det uden at røre de retinale strukturer i bunden af røret. Vask organoids 1 mere tid med 1 mL af den pre varmede ProB27 medium.
    5. Opsug organoids med en overførsel pipette og placere dem i 1 godt af en 6-godt plade indeholdende ProB27 medium pre varmes og ekvilibreres i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
      Bemærk: Placer 10-15 retinale organoids pr. brønd af et 6-godt plade.
    6. Ændre halvdelen af medium hver 2-3 dage i løbet af den tid, der kræves for at opnå de ønskede retinal celletyper efter deres fremkomst, som beskrevet i figur 2.
  2. Optøning af hiRPE celler
    1. Varm ProN2 medium ved 37 ° C (8 mL vil blive krævet for hvert kryogene hætteglas).
    2. Fra den flydende kvælstof tank eller-150 ° C fryser, tø en kryogene udsnit af hiRPEp1 celler af en inkubation i et vandbad ved 37 ° C til 30 s. Desinficer kryogene hætteglasset omhyggeligt ved hjælp af desinficerende løsning spray.
    3. Åbn tuben og tilsættes 1 mL af pre varmede ProN2 medium og overføre cellesuspension til en 15 mL rør indeholdende 2 mL af pre varmede ProN2 medium. Der centrifugeres i 5 min. ved 110 x g.
    4. Fjern supernatanten og forsigtigt resuspenderes celle i 2 mL af ProN2 medium pre varmes ved 37 ° C.
    5. Tælle celler med en celle counter.
    6. Tage 1,25 millioner celler og placere dem i matrix-belagt T-25 cm2 kolbe (Se trin 2.2.2) der indeholder 5 mL af ProN2 medium pre varmes ved 37 ° C. På dette stadium, Bemærk passagen som 2 (hiRPEp2).
    7. Holde hiRPEp2 cellerne i ProN2 medium i celle kultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 for 48 h før du ændrer mediet.
    8. Ændre medierne hver 2-3 dage. Når hiRPE cellerne når sammenløb, udføre den næste passage eller kryopræservering.
      Bemærk: Efter 2 uger i kultur, 8-10 millioner hiRPE celler kan afhentes for yderligere eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det første skridt for menneskelige iPSC differentiering dyrket i feeder-fri betingelser16 er at lukke selvfornyelse maskiner bruge Bi medium for at tilskynde en spontan differentiering (figur 1A). Derefter, på D2, Bi medium er suppleret med en N2 supplement til at guide differentiering iPSCs celler mod de neurale og retinal lineages. Denne proces fører til fremkomsten af neuroretinal knopper på omkring D28 (figur 1 c - 1E). Selv danner neuroretinal strukturer kan isoleres ved hjælp af en nål, som illustreret i figur 1E og overført til kultur plader tillade modning af den retinale organoids i flydende kultur betingelser ved hjælp af ProB27 medium (figur 1F). For at fremme vækst og udvikling af neurale nethinden, er FGF2 tilføjet til medium for 1 uge (figur 1A).

På D28 indeholder de spirende retinal strukturer hovedsagelig retinal stamceller, der Co giver udtryk for den vigtige transkriptionsfaktor som PAX6, RAX og VSX215. Disse stamceller giver anledning til de syv store klasser af retinale celletyper i flydende kultur betingelser i en evolutionært bevarede fødsel ordre i overensstemmelse med menneskets retinal udvikling. Baseret på qRT-PCR og Immunhistokemi tidligere beskrevet i Reichman et al. 15, brede kurver i figur 2 viser bølger af tidlige - og sene-født retinal celle generationer under en in vitro- modning processen. Således, kultur tid definerer celletyper findes i organoids.

Isolationen af hiRPE celler for yderligere forstærkning kan udføres kun når pigmentering er mærkbar, fordi denne celle farvning tillader deres visualisering. På denne måde, er ProN2 medium anvendes fra D28 til D42 for at favorisere pigmentering af ÅV celler15.

Afhængigt af den menneskelige iPSC klon, kan de pigmenterede pletter opdages før eller efter selvstændig dannelsen af retinale strukturer; men for det meste 1 eller 2 uger efter brug af ProN2 medium på D28 (figur 3A, B). En repræsentativ lysfelt billede af hiRPE celler udvides fra de isolerede pletter på passage 0 er vist i figur 3 c og 3D. Så, hiRPE cellerne kan udvides indtil passage 4, bevarer deres ÅV fænotype uden en epitel-mesenchymale overgang (EMT). Ikke desto mindre kan EMT forebygges ved brug af ROCK hæmmere såsom Y-27632, så også en stigning på celle nummer passager17. Langsigtet kulturer af hiRPE celler efter optøning kan let udføres på betingelser beskrevet her for at få en moden og funktionelle epitel15. Et eksempel på modne hiRPEp2 celler i uge 52 med en klassisk cuboidal brostensbelagte morfologi er illustreret i figur 3E.

Figure 1
Figur 1: Generation og modning af retinale organoids fra vedhængende menneskelige iPSCs. (A) differentiering protokollen tillader generation af retinale organoids. (B) menneskelige iPSCs på D0. (C) nye neuroretinal epitel på D15. (D) selv danner neurale nethinden-lignende strukturer på D22. (E) her, neuroretinal bud er isoleret ved hjælp af en nål. (F) repræsentative billeder af retinale organoids i flydende kultur betingelse på D35. Skalere barer = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: bølger af menneskelige iPSC-afledte retinal celle generation. Forkortelser: Retinal stamceller (fjernprocedurekald (RPC)), retinal ganglion celler (RGCs), horisontale celler (Ho), amacrine celler (Am), Müller glial celler (MGCs), bipolar celler (Bp) og fotoreceptorer (PR). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Generation og forstærkning af menneskets iPSC-afledte ÅV. (A) en illustration af differentiering protokollen tillader generation af humane hiRPE celler. (B) fase-kontrast billeder viser pigmenterede pletter opstår fra differentiere vedhængende menneskelige iPSCs i uge 6 (W6). (C) hiRPEp0 celler dyrket en uge (W1) efter pigmenteret patch plukning. (D) hiRPEp0 celler i uge 6 (W6) efter pigmenteret patch plukning. (E) A repræsentativt billede af hiRPEp2 celler efter optøning, dyrket i 52 uger (W52) i ProN2 medium. Skalere barer = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver hvordan man producerer ÅV celler og retinal organoids, som indeholder retinal RGCs og fotoreceptorer, fra humane pluripotente stamceller i xeno-fri og feeder-fri betingelser. Kompatibel med god fremstilling af praksis (GMP) proces, metoden dyrkede præsenteres her tillader en stor produktion af iPSC-afledte retinale celler som ÅV celler, RGCs og fotoreceptorer for udviklingen af stamceller-baserede behandlinger og medicin Discovery tilgange for den fremtidige behandling af retinale degenerative sygdomme. Kryopræservering af hele retinale organoids eller hiRPE celler giver også en stor fordel i at etablere mellemliggende cellebanker, et vigtigt skridt til fremtidig brug i stamcelle-baseret terapi.

Produktion af store lagre af specifikke retinal celletyper på et bestemt tidspunkt af differentiering vil være nødvendig for fremtidige kliniske oversættelse. I denne forbindelse generation i tre måneder af CD73-positive fotoreceptor prækursorer beskrevet som en transplantation-kompatible celle befolkning18, og muligheden for at generere disse umodne fotoreceptorer fra freeze-optøet retinal organoids15 styrke håb om at bruge disse celler til terapeutiske formål. Vedrørende retinal pigmenteret epitel tillader hiRPE celler evne til at formere sig i vitro store celle produktioner til bank dem. Vigtigere, bevarer optøede menneskelige iPSC-afledte ÅV celler deres ÅV fænotype og funktion, således som trofiske faktor sekretion eller fotoreceptor ydre segment fagocytose15, validere deres brugervenlighed for screening strategier såvel som for fremtidige terapeutiske tilgange.

Der er en række forskellige protokoller for generation af iPSC-afledte retinale organoids7,8,9,10,11,12,15 , varierer i kultur metoder (embryoid krop-lignende aggregater vs vedhængende celler) samt effektivitet og robusthed. Metoden beskrevet her starter fra vedhængende menneskelige iPSCs og viser en reproducerbar effektivitet, tilpasningsevne og anvendelighed til en bred vifte af menneskelige iPSC linjer15. Denne proces, baseret på den efterfølgende ændring af serum-frie medier, sammenfatter de vigtigste trin i retinal udvikling ved at udnytte de iboende stikord af systemet til at guide differentiering. En vigtig fordel af denne protokol er fraværet af embryonale krop dannelse og tilsætning af matrix for fremtidige GMP-kompatibel retinal celle fremstiller protokoller for at producere celle terapi derivater. På denne måde, blev ikke fundet nogen forskel i effektiviteten af retinale organoid generation og modning mellem xenogene og no-xenogene kultur betingelser ved hjælp af celle terapi System (CTS) kosttilskud eller ej, formuleret udelukkende med rekombinant eller humaniseret komponenter.

Metoden retinal differentiering succes afhænger i høj grad på kvaliteten af de menneskelige iPSC kulturer. Metoden omprogrammering påvirke ikke menneskers iPSCs retinale celler8differentiering effektivitet, men deres stemness status skal være optimal. Kort, bør rutinemæssigt dyrkede menneskelig iPSCs ikke udviser tegn på differentiering. Kolonierne bør ikke overlapper hinanden og skal vise deres karakteristiske cirkulære morfologi. Selv om effektiviteten af den retinale differentiering er klon-afhængige, kan et minimum af to retinal strukturer per cm2 plukkes på D28, svarende til 50-60 neuroretinal strukturer for en 6-cm parabol. For den retinale organoid modning i flydende dyrkningsbetingelser undgår begrænse antallet af strukturer pr. brønd struktur fusion og medium overforbrug. Under disse forhold, kultur, kan retinale organoids være modnet for en omfattende tid, kræves for at opnå slutningen retinal celletyper.

Rettes blikket fremad, udgør retinal organoids genereret i vitro ved denne metode kraftfulde værktøjer til model retinal sygdomme. Patient-specifikke iPSC-afledte retinal cell modeller vil blive brugt til bedre at forstå komplekse eller genetiske sygdomme af udforskning af deres molekylære og cellulære mekanismer. Disse modeller vil være særligt velegnet for drug discovery gennem high throughput screening, celle og gen behandlinger eller genom-redigering metoder, for at udvikle innovative behandlinger for retinal dystrophies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Sacha Reichman, Olivier Goureau og José-Alain Sahel er opfindere om ventende patenter relateret til generation af retinale celler fra humane pluripotente stamceller.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af Goureau's team for deres input under Opsætning af de metoder, der beskrives her, og G. Gagliardi og M. Garita for deres kritiske læsning. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra ANR (GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), nethinden Frankrig Association og den teknologioverførsel selskab SATT Lutech. Det blev også udført inden for rammen af LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65) understøttes af ANR inden for programmet Investissements d'Avenir (ANR-11-IDEX-0004-02).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated ThermoFisher Scientific A14700 Coating
CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated ThermoFisher Scientific A27940 Coating
Essential 8 Medium ThermoFisher Scientific A1517001 medium
Essential 6 Medium ThermoFisher Scientific A1516401 medium
CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement ThermoFisher Scientific A1370701 supplement CTS
N-2 Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17502048 supplement
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504044 supplement
CTS B-27 Supplement, XenoFree ThermoFisher Scientific A1486701 supplement CTS
DMEM/F-12 ThermoFisher Scientific 11320074 medium
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140035 supplement
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122 antibiotic
CellStart CTS ThermoFisher Scientific A1014201 Matrix CTS
Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix ThermoFisher Scientific A1569601 Matrix
Gentle Cell Dissociation Reagent Stemcell Technologies 7174 dissociation solution
Cryostem Freezing Media clinisciences 05-710-1D Cryopreservation medium
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) Preprotech 100-18B FGF2
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free Preprotech AF-100-18B FGF2 Xeno free
AGANI needle 23G Terumo AN*2332R1 Needle
Flask 25 cm² Tissue Culture Treated Falcon 353109 T-25 cm²
24 well plate Tissue Culture Treated Costar 3526 24-well plate
6 well plate Tissue Culture Treated Costar 3516 6-well plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, C., Wang, Q., Temple, S. Stem cell therapies for retinal diseases: recapitulating development to replace degenerated cells. Development. 144, 1368-1381 (2017).
  2. Dalkara, D., Goureau, O., Marazova, K., Sahel, J. -A. Let There Be Light: Gene and Cell Therapy for Blindness. Human Gene Therapy. 27, 134-147 (2016).
  3. Wright, L. S., Phillips, M. J., Pinilla, I., Hei, D., Gamm, D. M. Induced pluripotent stem cells as custom therapeutics for retinal repair: Progress and rationale. Experimental Eye Research. 123, 161-172 (2014).
  4. Leach, L. L., Clegg, D. O. Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients with Ocular Disease. Stem Cells. 33, 2363-2373 (2015).
  5. Gill, K. P., Hewitt, A. W., Davidson, K. C., Pébay, A., Wong, R. C. B. Methods of Retinal Ganglion Cell Differentiation From Pluripotent Stem Cells. Translational Vision Science and Technology. 3, 2 (2014).
  6. Giacalone, J. C., Wiley, L. A., et al. Concise review: Patient-specific stem cells to interrogate inherited eye disease. STEM CELLS Translational Medicine. 5, 132-140 (2016).
  7. Nakano, T., Ando, S., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
  8. Reichman, S., Terray, A., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 8518-8523 (2014).
  9. Meyer, J. S., Howden, S. E., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29, 1206-1218 (2011).
  10. Zhong, X., Gutierrez, C., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
  11. Mellough, C. B., Collin, J., et al. IGF-1 Signalling plays an important role in the formation of three dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33, 2416-2430 (2015).
  12. Gonzalez-Cordero, A., Kruczek, K., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9, 820-837 (2017).
  13. Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
  14. Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16698-16703 (2009).
  15. Reichman, S., Slembrouck, A., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).
  16. Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
  17. Croze, R. H., Buchholz, D. E., et al. ROCK inhibition extends passage of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium. Stem Cells Translational Medicine. 3, 1066-1078 (2014).
  18. Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, 6462-6471 (2011).

Tags

Udviklingsmæssige biologi sag 139 Retina organoids pluripotente stamceller differentiering celle terapier drug discovery
Definerede Xeno-fri og Feeder-fri kultur betingelser for den Generation af menneskelige iPSC-afledte Retinal Cell modeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Slembrouck-Brec, A., Nanteau, C.,… More

Slembrouck-Brec, A., Nanteau, C., Sahel, J. A., Goureau, O., Reichman, S. Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models. J. Vis. Exp. (139), e57795, doi:10.3791/57795 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter